玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及胶体金免疫层析法的建立

目的 制备并鉴定玉米赤霉烯酮(ZEN)单克隆抗体(mAb),并初步建立ZEN的胶体金免疫层析检测方法.方法 采用活泼酯法制备人工抗原ZEN-OVA和ZEN-BSA,以ZEN-OVA作为免疫原制备ZEN mAb.ELISA法鉴定抗体效价、亚类、特异性等.ZEN mAb-胶体金复合物包被于胶体金结合垫上,检测原ZEN-BSA和山羊抗小鼠lgG分别结合于硝酸纤维膜上作为检测线(T线)和质控线(C线),建立ZEN的胶体金免疫层析检测法.结果 经紫外分光光度法和SDS-PAGE鉴定,ZEN人工抗原合成成功.经3次克隆化后,筛选出1株能稳定分泌ZEN mAb的杂交瘤细胞株1G4,腹水效价为1∶1.6×105;抗体亚类为IgG2b;对ZEN的IC50为10.2 ng/mL,检测限为0.58 ng/mL.mAb对ZEN具有高度的特异性,除与β-玉米赤霉烯醇的交叉反应率为12.8％外,与其他ZEN代谢物α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮及其他相似毒素呕吐毒素、伏马毒素、赭曲霉素A等几乎无交叉反应.制备的胶体金免疫层析试纸条在5 min内即可肉眼观察到结果,对ZEN的最低检测限为100 ng/mL.结论 成功制备出1株ZEN mAb,并初步建立了其胶体金免疫层析检测方法,最低检测限为100 ng/mL.     

植物雌激素α-玉米赤霉醇对HUVEC低氧/复氧损伤的保护作用

目的:探讨植物雌激素α-玉米赤霉醇（ZAL）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）低氧/复氧损伤的保护作用及其机制。 方法:低氧(93%N₂-5%CO₂-2%O₂)环境中培养HUVECs 3 h后再恢复正常氧供应1 h。用MTT法检测细胞存活率, 分光光度法测定细胞培养上清液中LDH、SOD活性及MDA含量。 结果:HUVECs经低氧/复氧处理后,细胞存活率及SOD活性显著低于对照(P<0.01), LDH活性及MDA含量显著高于对照(P<0.01)；经不同浓度(10-9-10-6 mol/L)的ZAL或雌二醇（E₂）预处理后, 均可显著缓解上述改变，此作用为剂量依赖性，同浓度ZAL与E2的作用无显著差异。 结论:ZAL对低氧/复氧损伤的HUVECs可产生与E2类似的保护作用, 机制可能与促进自由基清除而减轻细胞氧化应激损伤有关。     

植物雌激素α-玉米赤霉醇对内皮祖细胞的促增殖效应

目的:观察植物雌激素α-玉米赤霉醇(α-ZAL)对内皮祖细胞(EPCs)增殖能力的影响并探讨其机制。方法:密度梯度离心法获取大鼠外周血单个核细胞,加用内皮细胞培养基EGM-2培养,免疫荧光染色和流式细胞术等进行EPCs鉴定,培养2～3代后用于实验。分别用10-5mol/LH2O2和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)及下游靶蛋白Akt(PI3K/Akt)抑制剂LY294002处理细胞,并加用10-6和10-7mol/Lα-ZAL进行干预。检测EPCs上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性以反映细胞损伤情况,用MTT法、EPCs克隆数及细胞总数计数反映EPCs增殖情况,Westernbloting法检测Akt及磷酸化Akt(phosphor-Akt)蛋白表达。结果:经鉴定培养细胞为EPCs;10-5mol/LH2O2及PI3K/Akt抑制剂LY294002可明显降低EPCs存活率(P<0.05),减少细胞克隆,增加LDH活性(P<0.01);而加入10-6和10-7mol/Lα-ZAL干预后能减轻以上作用(P<0.05),同时10-6mol/Lα-ZAL能减少LY294002抑制EPCsAkt的表达和磷酸化。结论:α-ZAL能促进EPCs的体外增殖能力,其机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。     

α-玉米赤霉醇改善去卵巢高同型半胱氨酸血症大鼠的血管功能

目的 探讨植物雌激素α-玉米赤霉醇（α-ZAL）对去卵巢高同型半胱氨酸血症(HHcy)大鼠血管功能的保护作用。方法 用高蛋氨酸(Met)饮食复制HHcy大鼠模型。40只雌性Wistar大鼠随机分为5组：(1)对照组（Con）;(2)2.5%蛋氨酸组（Met）;(3)卵巢切除+2.5%蛋氨酸组（OVX+Met）;(4)卵巢切除+2.5%蛋氨酸+α-ZAL组（OVX+Met+α-ZAL）;(5)卵巢切除+2.5%蛋氨酸+17β-E2组（OVX+Met+17β-E2）。12周后,测定血浆雌二醇（E2）及同型半胱氨酸（Hcy）的含量;离体胸主动脉环灌流,观察胸主动脉环对不同浓度苯肾上腺素（PE）、乙酰胆碱（ACh）和硝普钠（SNP）的反应。结果 高蛋氨酸饮食可明显增高血浆Hcy水平,其中OVX+Met组大鼠Hcy水平升高最显著。与其他组相比, OVX+Met组大鼠胸主动脉环对PE的收缩反应明显减弱,对ACh的舒张反应明显增强。各组大鼠胸主动脉环对SNP的舒张反应无明显差异。结论 α-ZAL可抑制去卵巢HHcy大鼠血浆Hcy水平的升高,减轻血管内皮细胞的损伤,明显改善大鼠的血管功能,其作用与17β-E2相似。     

植物雌激素α-玉米赤霉醇对HUVEC组织因子基因表达的转录调控作用

目的 探讨植物雌激素α-玉米赤霉醇(ZAL)影响血管内皮细胞组织因子(TF)基因表达的转录调控机制,并与内源性动物类雌激素17β联雌二醇(17β联estradiol,E2)进行比较分析。方法 进行人脐静脉内皮细胞(HUVECs)原代培养,利用基因重组技术构建4个含人TF基因5′上游不同长度序列的荧光素酶报告基因质粒,用脂质体转染法分别转入以下6组细胞：①正常对照组;②10^-7mol／L,E2刺激组;③10^-7mol／L ZAL刺激组;④10^-6mol／L AngⅡ刺激组;⑤10～mol／L E2 10^-6mol／L AngⅡ刺激组;⑥10^-7mol／L ZAL 10^-6mol／L AngⅡ刺激组;测定细胞裂解液中荧光素酶比活性(relative luciferase activity,BLA)的变化。结果 转染pGL3-TF-171/ 71的各组细胞BLA均较低,不同刺激组之间无显著差异;AngⅡ可使质粒pGL3-TF-593／ 71,pGL3-TF-316／ 71,pGL3-TF-236／ 71荧光素酶表达大量增加,E2、ZAL均可不同程度地抑制AngⅡ的上述效应,2者间无显著差异。结论 含有1个NF-κB位点和2个AP-1位点的-236bp-171bp区域在E2或ZAL影响TF基因转录中有重要作用。     

17β-雌二醇及α-玉米赤霉醇对人脐静脉内皮细胞组织因子表达的影响

为探讨17β-雌二醇(17β-estrodiol，17β-E2)及植物雌激素α-玉米赤霉醇(α-zearalanol，α-ZAL)对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)组织因子(tissue factor，TF)蛋白含量及mRNA表达的影响，进行人脐静脉内皮细胞原代培养，传至2—3代后用于实验。在细胞培养液中分别加入不同浓度17β-E2及α-ZAL作用48h，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞裂解液中TF蛋白浓度，双辛丁酸法(bicinchoninic acid，BCA)检测细胞总蛋白含量。提取细胞总RNA，用RT-PCR观察17β-E2及α-ZAL对TF mRNA表达的影响。结果发现：10^-7mol／L 17β-E2及α-ZAL均可明显降低HUVECs组织因子蛋白含量及mRNA的表达，二者的作用类似。表明17β-E2及α-ZAL可明显抑制HUVECs组织因子的表达，这可能是它们抗血栓形成、发挥心血管保护作用的机制之一。     

鼠抗HCV单克隆抗体研制及初步应用探讨

交联HCV 合成多肽抗原,用鼠一鼠杂交瘤技术获得8株稳定分泌抗HCV 的特异性单抗,分别命名为YLCV 系1—8。经初步研究结果表示,抗HCV 抗体阳性血清可抑制酶标YLCV-1和YLCY-5单抗与抗原的反应。抗原测定结果6份血清中有一份呈强阳性反应,由此提示单抗在HCV 抗体抗原检测系统中应用的可能性,同时为HCV 抗原成份的分析提供了必要的条件.     

抗重组人肿瘤坏死因子—α单克隆抗体的研制及其初步应用

应用淋巴细胞杂交瘤技术获得１０株抗重组人肿瘤坏死因子－α（ｒＨｕＴＮＦ－α）ＭｃＡｂ。７株ＭｃＡｂ为ＩｇＧ１，２株为ＩｇＧ２ａ，１株为ＩｇＧ２ａ。１株ＭｃＡｂ与淋巴毒素（ＬＴ或ｒＨｕＴＮＦ－β）、ｒＨｕＩＬ－６和载体菌菌体蛋白均无交叉反应。其中７株ＭｃＡｂ具有中和活性，７株ＭｃＡｂ能识别天然的ＴＮＦ－α。Ｇ１１和Ｅ６ＭｃＡｂ应用ＡＢＣ法免疫组化染色肝病患者组织细胞片得到明确的阳性结果。用２株识别不     

α-玉米赤霉醇干预骨质疏松性骨折模型大鼠白细胞介素1、6的表达

背景：α-玉米赤霉醇是一种新的植物雌激素,可能具有动物雌激素的某些生理功能。 目的：观察植物雌激素α-玉米赤霉醇对骨质疏松性骨折大鼠白细胞介素1和白细胞介素6表达的影响。 方法：切除40只6月龄雌性SD大鼠双侧卵巢建立去卵巢骨质疏松模型,造模成功后锯断右侧胫骨建立骨折模型,骨折1周,分别灌胃0.066 mg/kg雌二醇、10,5,1 mg/kg α-玉米赤霉醇及二甲基亚砜;另取10只大鼠,不切除卵巢,制备骨折模型后灌胃二甲基亚砜。给药35 d,ELISA法测定大鼠血清白细胞介素1和白细胞介素6的表达。 结果与结论：去卵巢后,骨折大鼠血清白细胞介素1和白细胞介素6的表达明显升高,5,1 mg/kg α-玉米赤霉醇及0.066 mg/kg雌二醇均可明显降低骨质疏松性骨折大鼠血清白细胞介素1和白细胞介素6的表达,但10 mg/kg α-玉米赤霉醇作用效果不显著。说明α-玉米赤霉醇可以剂量依赖性地降低骨质疏松性骨折大鼠血清白细胞介素1和白细胞介素6的表达。     

抗甲型副伤寒沙门氏菌鞭毛抗原单克隆抗体的研制及初步应用

本文采用杂交瘤技术,制备了７ 株抗甲型副伤寒沙门氏菌鞭毛抗原单克隆抗体（ｍ Ａｂ） 的杂交瘤细胞株。对３ 株ｍＡｂ（２Ｃ８、２Ｅ６ 和５Ｄ７） 进行了鉴定,ｍＡｂ ２Ｃ８ 和５Ｄ７ 为ＩｇＭ,２Ｅ６ 为ＩｇＧ１（κ）亚类,可分别识别不同的抗原表位,均具有很强的特异性,即只与甲型副伤寒沙门氏菌及其鞭毛抗原起反应,而与相关肠道细菌：尼亚里木沙门氏菌、达卡沙门氏菌及伤寒沙门氏菌、乙型和丙型副伤寒杆菌、猪霍乱沙门氏菌、纽波特沙门氏菌等均无交叉反应。免疫印迹显示,３ 株ｍＡｂ 只能与甲型副伤寒沙门氏菌鞭毛抗原Ｍｒ 为５２ ０００ 的蛋白结合。用ｍＡｂ ２Ｅ６ 和５Ｄ７ 建立的双ｍＡｂ 夹心ＥＬＩＳＡ 法,检测了１３ 例血培养阳性的副伤寒患者血清中的甲型副伤寒沙门氏菌鞭毛抗原,１２ 例呈阳性,阳性符合率为９２－３％ 。     

植物雌激素α-玉米赤霉醇降低组织因子及核转录因子AP-1和NF-κB水平的作用

目的 :探讨天然植物雌激素α 玉米赤霉醇对组织因子含量的影响及对内皮细胞表达核转录因子AP 1和NF κB的作用。方法 :建立大鼠去卵巢模型 ,进行人脐静脉内皮细胞体外培养。用放射免疫法测定大鼠血浆雌二醇水平 ;酶联免疫吸附法测定血浆及内皮细胞组织因子水平。用WesternBlot法测定核转录因子AP 1和NF κB的含量。结果 :去卵巢后 ,大鼠血浆组织因子水平升高 ,补充α 玉米赤霉醇后可使升高的血浆组织因子接近正常 ;α 玉米赤霉醇亦可降低内皮细胞组织因子含量 ,且可下调内皮细胞核转录因子AP 1和NF κB的水平 ,以上作用均与 17β 雌二醇类似。结论 :α 玉米赤霉醇可能具有抗血栓形成 ,保护心血管系统的作用     

鼠抗人IL－5单克隆抗体研制及初步应用探讨

Ｔ细胞杂交瘤来源的人ＩＬ—５免疫小鼠。用鼠鼠杂交瘤技术获得两株分沁抗人ＩＬ—５特异性单抗（Ｓ１７和Ｓ６６）的杂交瘤，并对Ｓ１７单抗的特性进行了探讨。实验结果表明；两株单抗皆为ＩｇＧ１亚类；Ｓ１７单抗能显著抑制ＭＴＨｈ５Ｒ细胞的增殖，不能竞争性抑制ＮＣ１７单抗与人ＩＬ—５的结合。利用Ｓ１７单抗作为包被抗体建立的检测人ＩＬ—５ＥＬＩＳＡ法具有较高的敏感性，提示其在临床上检测病人血中ＩＬ—５浓度应用的可能性。     

鼠抗人IL－5单克隆抗体研制及初步应用探讨

Ｔ细胞杂交瘤来源的人ＩＬ—５免疫小鼠。用鼠鼠杂交瘤技术获得两株分沁抗人ＩＬ—５特异性单抗（Ｓ１７和Ｓ６６）的杂交瘤，并对Ｓ１７单抗的特性进行了探讨。实验结果表明；两株单抗皆为ＩｇＧ１亚类；Ｓ１７单抗能显著抑制ＭＴＨｈ５Ｒ细胞的增殖，不能竞争性抑制ＮＣ１７单抗与人ＩＬ—５的结合。利用Ｓ１７单抗作为包被抗体建立的检测人ＩＬ—５ＥＬＩＳＡ法具有较高的敏感性，提示其在临床上检测病人血中ＩＬ—５浓度应用的可能性。     

关于补充“植物雌激素α-玉米赤霉醇对内皮祖细胞的促增殖效应”一文有关信息的告示

<正>本刊2011年第21卷第4期"基础与实验"栏目所发表的"植物雌激素α-玉米赤霉醇对内皮祖细胞的促增殖效应"一文补充以下信息:基金项目:北京市自然科学基金项目(7112012),北京市教委科技发展计划(KM200910025003)     

抗D型葡萄球菌肠毒素单克隆抗体的研制及其初步应用

应用小鼠杂交瘤技术获得５株分泌抗Ｄ型葡萄球菌肠毒素（ＳＥＤ）ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞（ＤＣ３、ＤＣ４、ＤＢ１１、４Ｄ３和４Ｄ５）。其中４Ｄ３为ＩｇＭ（λ），其余为ＩｇＧ１（ｋ）。这组ＭｃＡｂ除ＤＣ３外，其它４株ＭｃＡｂ识别的抗原构象表位相同，其相对亲和力依次为４Ｄ５＞ＤＣ３＞ＤＣ４＞４Ｄ３＞ＤＢｌｌ。利用抗ＳＥＤ多克隆抗体与ＨＲＰ标记的ＤＣ３和４Ｄ３（针对不同表位）混合ＭｃＡｂ建立了夹心ＥＬＩＳＡ法，并以该法检测了自临床标本中分离的８０林金葡萄菌所产生的ＳＥＤ，其产毒率为４１．３％。     

玉米赤霉烯酮半抗原及全抗原的合成与鉴定

目的:合成玉米赤霉烯酮(ZEN)半抗原及全抗原,并鉴定其是否合成成功,为制备ZEN抗体奠定基础.方法:将ZEN与羧甲氧基胺半盐酸盐(0-( carboxymethyl)hydroxylamine hemihydrochloride)反应,合成半抗原ZEN-6-羧甲氧基胺(ZEN-oxime),采用TLC、HPLC和液相-质谱联用技术进行半抗原的纯化、鉴定;通过活泼酯法将半抗原与载体蛋白偶联制备ZEN全抗原,采用紫外光谱法、TNBS法结合比的测定以及免疫学方法进行全抗原鉴定.结果:鉴定结果表明目标半抗原及全抗原合成成功.结论:本研究采用多种方法进行半抗原及全抗原的鉴定,结果皆表明目标半抗原及全抗原合成成功,说明本研究合成ZEN半抗原及人工抗原的技术路线是可行的,为进一步研制ZEN的抗体奠定良好基础.     

抗AFP单克隆抗体夹心ELISA检测试剂盒的研制及应用

甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)是一种癌胚抗原,在胚胎期由肝细胞和卵黄囊合成并出现在胎儿血清中,出生后血清中AFP的含量很低,正常人血清中的AFP浓度在20μg/L以下。当机体发生原发性肝癌时,肝癌细胞可合成和分泌大量AFP,在癌组织提取液、血清及腹水中均可检出高水平的AFP,现已作为肝癌的标志物,广泛应用于肝癌的普查、诊断、     

植物雌激素α-玉米赤霉醇与17β雌二醇、戊酸雌二醇对兔食饵性动脉粥样硬化的作用

目的:研究新的植物雌激素α-玉米赤霉醇(α-ZAL)的抗动脉粥样硬化(AS)作用。方法:49只新西兰成熟未孕雌兔分成6组。A组为正常对照组;B组为假手术组;C组为高脂对照组;D组为17βE2雌二醇组;E组为戊酸雌二醇组;F组为α-ZAL组。分别测定血清TC,LDL-C,HDL-C含量和血浆ET-1及NO水平,肉眼观察并用扫描仪测定各组主动脉内膜脂质斑块沉积面积与内膜总面积之比。并进行病理组织学观察。测定子宫重量/体重。结果:主动脉内膜脂质斑块沉积与内膜总面积之比为B、D、E、F组vs C组P<0.01。病理观察:C组内皮脱落和大量泡沫细胞;B、D、E、F组上述病理变化明显减轻,内皮基本正常或正常,仅有少量或无泡沫细胞。子宫重量/体重D、E、F组较C组明显增加,但F组增加明显小于D组、E组。血清TC、LDL-C、C组均明显升高,而B、D、E、F组明显低于C组,HDL-C各组无显著差异;血浆ET-1与NO水平C组明显升高,而B、D、E、F组明显下降。结论:α-ZAL可减少主动脉内膜脂质斑块沉积面积,减轻病理变化,减轻高脂血症,降低增高的ET-1与过度增高的NO,具有较强的抗AS作用。但对子宫增大作用明显小于17βE2与E2V。     

抗FITC单克隆抗体的制备及初步应用

以抗原抗体反应为基础的免疫学诊断技术需要有高特异性和高敏感性。为了提高免疫检测系统的敏感性 ,生物素 亲和素系统已被广泛地应用于免疫诊断技术。但生物素 亲和素系统也存在着标记较为复杂 ,易受内源性生物素影响等不足。异硫氰酸荧光黄 (ＦＩＴＣ)是一种很稳定的荧光素 ,极易结合在蛋白分子上 ,不仅标记简单 ,标记物也十分稳定。ＦＩＴＣ作为半抗原结合到蛋白质载体上具有很强的免疫原性 ,抗ＦＩＴＣ单克隆抗体 (ｍＡｂ)与标记在的蛋白质上ＦＩＴＣ反应 ,不仅特异性高 ,而且亲和力也高于抗体与多肽抗原的结合。因此 ,ＦＩＴＣ 抗ＦＩ…