在我国流行的脊髓灰质炎中发现脊灰病毒Ⅰ型自然重组株

消灭脊灰是预防医学的重要课题,1991年时我国仍是世界上脊灰流行区之一,其主要病原为Ⅰ型脊髓灰质炎病毒(PV1),为弄清PV在我国的流行情况,我们组织全国主要省区防疫站协作自选进行“我国PV1野毒株的分子流行病学研究”课题。地方同志负责脊灰病人粪便样品的采集、病毒的分离和部分病毒血清型检定,本实验室负责从各地的PV分离株中用RT—PCR和打点杂交方法区别疫苗相关株或野毒株,选PV1     

青海省2013-2017年脊髓灰质炎病原学监测结果分析

目的通过对青海省2013-2017年急性驰缓性麻痹(Acllte flaccid paralysis,AFP)病例与健康人群的病原学进行监测,为维持无脊灰状态提供准确、可靠的科学依据。方法采用RD、L20B细胞对AFP病例及健康人群的粪便标本进行病毒分离,分离到的脊髓灰质炎毒株送至国家脊髓灰质炎实验室进行鉴定。结果 2013-2017年共接收AFP病例粪便标本106份,分离到脊髓灰质炎病毒(Poliovirus,PV) 1株,分离率为0. 94%,分离到非脊灰肠道病毒(NonPolio Enterovirus,NPEV) 11株,分离率为10. 38%。共接收全省健康人群粪便标本790份,分离到PV 6株,分离率为0. 76%,分离到NPEV 143株,分离率为18. 10%。AFP病例及健康人群标本中分离到的所有PV毒株中,PVⅠ型5株,PVⅢ型1株,PVⅠ+PVⅢ混合型1株,均为脊灰疫苗相关株,无脊灰野病毒株。结论青海省2013-2017年无本地脊灰野毒株病例流行,阻断了脊灰本地野病毒的传播,保持了无脊灰状态。     

三种细胞在脊髓灰质炎病毒检测中的特点观察

目的:运用RD、Hep-2及L20B细胞进行脊髓灰质炎病毒(简称脊灰)的分离鉴定.方法:使用WHO推荐的3种细胞对脊灰病毒分离鉴定.结果:L20B细胞对脊灰病毒具有良好的特异性,对非脊灰肠道病毒不敏感.在脊灰分离株和粪便悬液标本中脊灰病毒的检出率为100%,优于RD用Hep-2细胞.结论:L20B细胞对脊灰病毒有较强的特异性和敏感性.     

海南省2005～2009年急性弛缓性麻痹病例病原学监测分析

目的分析海南省2005—2009年急性弛缓性麻痹（AcuteFlaccidParalysis,FP）病例及其密切接触者病原学监测结果,为维持无脊髓灰质炎（脊灰）状态提供病原学依据。方法按照世界卫生组织（WHO）规定的方法,用RDa和L20B细胞对AFP病例及其密切接触者的粪便进行病毒分离和鉴定。结果2005～2009年从AFP病例及其密切接触者966份粪便标本中分离到33株脊髓灰质炎病毒（PV）毒株,非脊灰肠道病毒（NPEV）196株;33株PV毒株中PVI型8株、PVⅡ型6株、PVⅢ型5株、PV混合型（Pmix）13株、PV＋NPEV混合株1株。所有PV毒株经中国疾病预防控制中心国家脊灰实验室进行型内鉴定,均为脊灰疫苗相关株。结论海南省2005～2009年AFP病例及其密切接触者中未发现脊灰疫苗衍生毒株（VDPV）,且脊灰实验室监测系统各项监测指标都达到WHO的标准,表明海南省AFP病例的病原学监测敏感、高效。     

重组痘苗病毒为载体表达脊髓灰质炎病毒（Ⅰ型）及甲型肝炎病毒双价抗原

本文报道含有脊髓灰质炎病毒Ⅰ型中和抗原位点及甲型肝炎病毒中和抗原位点重组痘苗病毒的构建，用重组痘苗病毒感染１４３ＴＫ－细胞后成功地表达了脊髓灰质炎病毒Ⅰ型和甲型肝炎病毒的抗原。免疫荧光显示，两种抗原的荧光颗粒均分布在胞浆内。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实，重组痘苗病毒所表达的脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原和甲型肝炎病毒抗原为一融合蛋白。用此重组痘苗病毒免疫动物，可诱导脊髓灰质炎病毒Ⅰ型和甲型肝炎病毒的中和抗体产生。     

宁夏回族自治区2000-2005年急性弛缓性麻痹病例病原学监测结果分析

目的了解宁夏2000-2005年急性弛缓性麻痹(AFP)病例及其他健康人群肠道病毒病原学监测结果。方法对采集的粪便标本利用L20B及RD细胞进行病毒分离,阳性标本用脊灰标准诊断血清定型。结果AFP病例及其他健康人群脊灰病毒(PV)分离率分别为8.33%和1.61%,非脊灰肠道病毒(NPEV)分离率分别为13.33%和15.20%。结论我区AFP病例的病原学监测结果运行良好。在所有人群中分离到的23例PV株经国家脊灰实验室进行型内鉴定均为疫苗株,表明我区未发现脊灰野毒株和疫苗衍生株病例。     

重组痘苗病毒为载体表达脊髓灰质炎病毒（I型）及甲型肝炎…

本文报道含有脊髓灰质炎病毒Ｉ型中和抗原位点及甲型肝炎病毒中和抗原位点重组痘苗病毒的构建，用重组痘苗病毒感染１４３ＴＫ细胞后成功地表达了脊髓灰质炎病毒Ｉ型和甲型肝炎病毒的抗原，免疫荧光显著，两种抗原的荧光颗粒均分布在胞浆内，Ｗｅｓｔｇｅｒｎｂｌｏｔ证实，重组痘苗病毒所表达的脊髓灰质炎病毒Ｉ型抗原和甲型肝炎病毒抗原为一融合蛋白，用此重组痘苗病毒免疫动物，可诱导脊髓灰质炎病毒Ｉ型和甲型肝炎病毒的中和抗体     

湖南省2003年急性弛缓性麻痹病例病毒学监测结果分析

目的 总结分析湖南省急性驰缓性麻痹(AFP)病例病毒学监测结果，为我省维持无脊髓灰质炎状态提供科学依据。方法 采集AFP病例双份粪便标本，接种L20B、RD两种细胞进行病毒分离；阳性毒株采用微量中和实验进行型别鉴定；脊灰(PV)阳性毒株送国家脊灰实验室进行型内鉴别。结果 湖南省2003年共报告AFP病例199例，采集粪便标本199例，病毒分离阳性45例。其中脊灰病毒21例，非脊灰肠道病毒(NPEV)24例。所有PV毒株经国家脊灰实验室鉴定，除一株为I型疫苗变异株外，其余均为疫苗相关株。     

人巨细胞病毒负荷量对细胞病变的影响

目的探讨感染后人巨细胞病毒负荷量与细胞病变的关系。方法采用不同滴定度的人巨细胞病毒感染传代培养的人胚肺成纤维细胞,建立人巨细胞病毒梯度感染细胞模型,荧光定量PCR法测定感染细胞内及其维持液病毒DNA量,光镜观察致细胞病变作用,电镜检查其超微结构的改变。结果人巨细胞病毒感染后,细胞内与其维持液病毒DNA量成正相关(r=0.83,P<0.01)。当细胞内病毒DNA量>105GE/106HEL时,病毒开始自细胞内释放;当维持液病毒DNA量>103GE/ml时,细胞出现病变。结论人巨细胞病毒感染后,受染细胞排放病毒致细胞外,且细胞内外病毒负荷量成正相关。细胞病变的发生情况与细胞内及其周围环境的病毒负荷量均密切相关。     

河北省2016年脊髓灰质炎实验室运转情况分析

目的分析河北省2016年脊髓灰质炎(脊灰)实验室运转情况,为维持河北省无脊灰状态提供实验室依据。方法对河北省各市通过急性弛缓性麻痹(Acute flaccid paralysis,AFP)病例监测信息报告管理系统报告的AFP病例及河北省脊灰实验室监测数据进行分析,对WHO要求的各项监测指标进行评价。结果 2016年河北省AFP病例监测信息报告管理系统共报告AFP病例365例,实验室收到362例AFP病例粪便标本719份,5例分离到脊灰病毒(Poliovirus,PV),分离率为1.38%;49例分离到非脊灰肠道病毒(NPEV),分离率为13.54%。分离的PV分离成单血清型共计10株,VP1区编码区核苷酸均发生了不同程度变异,但都以低个数变异为主,均为疫苗相似株(Sabin Like,SL)。2016年接受WHO一次病毒分离和两次型内鉴定(Intra-typic differentiation,ITD)盲样标本能力考核,实验室各项监测指标均远远超过WHO的认证标准。按WHO要求,细胞支原体检测结果均为阴性,没有受到支原体污染,细胞敏感性的评价两种细胞都对PV敏感、有效。结论河北省脊灰实验室运转正常,没有发现脊灰野病毒(Wild poliovirus,WPV)和疫苗衍生脊灰病毒(Vaccine-derived poliovirus,VDPV)及VDPV病例,为河北省维持无脊灰状态提供了准确、可靠的病毒学依据。     

褐藻糖胶体外抗病毒作用研究

由海带中提取的褐藻糖胶具有抗ＲＮＡ及ＤＮＡ病毒作用，实验结果表明，褐藻糖胶对脊髓灰质炎病毒Ⅲ型，柯萨奇Ｂ３和Ａ１６型病毒，腺病毒Ⅲ型，埃可Ⅵ型病毒有明显的抑制作用，表现为能显著抑制细胞病变（ＣＰＥ）的发生，使组织培养细胞得到保护。     

人巨细胞病毒诱导ECV304血管内皮样细胞凋亡

目的 探讨人巨细胞病毒（HCMV）感染ECV304血管内皮样细胞的致病机制。方法 常规方法传代细胞和接种病毒。以PCR法和间接免疫荧光法检测病毒即刻早期基因（IE gene）及其蛋白表达;相差显微镜及电子显微镜观察病毒感染后细胞和细胞器形态变化;DNA梯度法和流式细胞术检测细胞凋亡。结果 病毒感染后72h开始出现胞体变圆、缩小、脱壁,胞质内颗粒增多,细胞边缘模糊不清的特征,可明显检测出病毒特异IEgene及其蛋白表达;电镜结果显示病毒感染96h后,胞质内明显空泡化,细胞膜微绒毛减少,核染色质浓集、边缘化,线粒体出现溶酶体化、空泡化和自噬现象,呈早期凋亡特征;DNA梯度电泳结果显示感染细胞DNA片段化特征的条带：流式细胞仪检测发现感染4d和6d时,细胞调亡率分别为4．1％和45．7％。结论 巨细胞病毒在体外细胞培养中可诱导ECV304血管内皮样细胞的凋亡。     

黄芩甙对柯萨奇Ⅲ型病毒性心肌炎病毒复制的影响

目的采用观察细胞病理变化(CPE)的方法,探讨黄芩甙对柯萨奇Ⅲ型病毒复制的影响。方法通过细胞培养,用先吸附病毒再加入药物、先用药物处理后攻击病毒和直接灭活的方法,观察黄芩甙的药效学作用。结果在病毒先感染细胞后加入黄芩甙的实验中,低病毒感染量(10TCID50)时,显示出对柯萨奇Ⅲ型病毒有一定的抗病毒活性;在黄芩甙与病毒同时加入的实验中,在100TCID50、10TCID50时,均显示出对柯萨奇Ⅲ型病毒的抑制作用。结论黄芩甙对柯萨奇Ⅲ型病毒有一定的抗病毒活性。     

复方羌芪水提液体外抗柯萨奇病毒B3作用的研究

目的：测定复方羌芪水提液的体外抗ＣＶＢ３作用，并对其抗病毒机理进行初步的探讨。方法：用含有不同浓度复方羌芪水提液的维护液培养ＣＶＢ３感染的Ｖｅｒｏ细胞，４８ｈ后用ＭＴＴ法测定细胞活性；培养上清液滴定ＴＣＩＤ５０。结果：复方氏水提液能抑制ＣＶＢ３对Ｖｅｒｏ细胞的致病变作用（ＣＰＥ），使细胞夏活率升高，培养上清病毒滴度降低；且随药物浓度及药物与病毒作用时间的延长抑制作用增强。结论：复方羌芪水提液的抗病     

猪脾细胞干扰素在细胞中对疱疹病毒的抑制作用

目的:体外评价猪脾细胞干扰素抗疱疹病毒的活性,为疱疹病毒感染寻找新的治疗手段。方法:主要通过观察细胞病变效应(CPE)、噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率和病毒抑制率来评价猪脾细胞干扰素体外对单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和2型(HSV-2)的抑制作用。结果:猪脾细胞干扰素对HeLa细胞的半数毒性浓度(TC50)为535.3 IU/ml,对HSV-1和HSV-2的半数有效浓度(IC50)分别为24.6×103IU/L和25.9×103IU/L,治疗指数(TI)为21.8和20.7;其抗病毒效果与人白细胞干扰素及喷昔洛韦一致。结论:猪脾细胞干扰素具有很好的体外抗疱疹病毒作用。     

人疱疹病毒6B感染对Molt3细胞增殖和细胞周期的影响

目的 :研究人疱疹病毒(human herpesvirus,HHV)6B感染T淋巴细胞系Molt3后对其细胞增殖和周期的影响。方法 :HHV-6B感染Molt3细胞后,倒置显微镜观察细胞形态变化,PCR鉴定Molt3细胞中HHV-6 U22基因,间接免疫荧光及Western blot检测HHV-6蛋白表达;MTT检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期变化,荧光定量PCR检测细胞周期相关蛋白m RNA水平变化。结果:HHV-6B感染48 h后,Molt3细胞出现典型细胞病变。PCR检测到感染组细胞中含有HHV-6 U22基因,间接免疫荧光及Western blot均检测到HHV-6蛋白表达。MTT显示HHV-6B能明显抑制Molt3细胞的增殖。HHV-6B感染后Molt3细胞周期发生改变,与对照组相比,感染组细胞G1期增多,S期和G2期减少。实时荧光定量PCR表明HHV-6B感染后cyclin E1m RNA水平降低,p53 m RNA水平升高。结论:HHV-6B能够有效感染Molt3细胞引起典型的细胞病变效应,HHV-6B感染使细胞周期阻滞在G1期从而抑制细胞增殖。     

腺病毒41型致缺乏腺病毒E_1区的A_(549)细胞产生病变的实验研究

首次报道了腺病毒41型TaK株致缺乏腺病毒E1基因功能的A(549)细胞产生细胞病变。该病变与病毒感染的稀释度存在量一效关系。核酸杂交示1:10与1:20稀释度组病毒核酸含量相近，但明显高于1:50组。免疫荧光技术分析显示各稀释度组病毒蛋白表达起始时相均在病毒感染后的2～3d。     

卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染前列腺上皮细胞并激活Wnt信号通路的初探

目的:研究卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)是否能够感染前列腺非致瘤性上皮细胞系RWPE-1及前列腺癌细胞系PC-3,并初步探索其相关信号通路变化。方法:将12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA)刺激人原发性渗出性淋巴瘤细胞系BC-3,收集细胞上清(含KSHV病毒颗粒),感染RWPE-1及PC-3,观察前列腺细胞的细胞病变效应(CPE)。采用RT-PCR检测KSHV即刻基因ORF50 mRNA转录状况;进一步运用Western blot检查病毒裂解期产物病毒白细胞介素6(vIL-6)的蛋白表达水平;最后采用Western blot法检测被感染细胞胞浆和胞核中β-catenin表达水平。结果:PC-3细胞感染KSHV后未见明显CPE,但RT-PCR和Western blot均在预期位置检测到KSHV基因ORF50和vIL-6的mRNA及其编码的蛋白条带。RWPE-1细胞感染KSHV后可出现明显的CPE,感染后24h可以检测到vIL-6的表达。Wnt通路蛋白β-catenin在感染KSHV的RWPE-1细胞胞浆和胞核均呈上升趋势。结论:KSHV可以感染前列腺细胞系并有可能激活Wnt通路。     

腺病毒介导反义RNA抑制HIV-1辅助受体CCR5和CXCR4表达

目的抑制细胞表面人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的辅助受体CCR5和CXCR4表达,阻止HIV-1进入靶细胞。方法逆转录聚合酶链反应扩增HIV-1辅助受体基因5'-端cDNA片段,反向插入穿梭质粒中,再与腺病毒基因组骨架质粒在大肠杆菌BJ5183中同源重组,重组质粒在293细胞中包装、扩增得到含有CCR5、CXCR4反义RNA的重组腺病毒,分别感染U937细胞和MT4细胞,于感染后24、48和72h及10d时用流式细胞仪检测细胞表面相应受体的表达。并用Boyden小室法检测重组腺病毒感染对细胞趋化活性的影响以及用3H掺入法检测对细胞增殖能力的影响。结果成功获得含有CCR5和CXCR4反义RNA的重组腺病毒,其滴度为5×1011PFU/ml和7×1010PFU/ml。重组腺病毒感染24h后流式细胞仪检测显示,U937细胞表面CCR5的表达率分别为:Ad-antiR51.12%,未感染细胞对照82.10%,Ad-senseR580.94%,Ad-control81%。MT4细胞表面CXCR4的表达率分别为:Ad-antiX41.03%,未感染细胞对照42%,Ad-senseX444%,Ad-control39%。48、72h及10d后Ad-antiR5感染的U937细胞表面CCR5表达率分别为:1.02%、1.26%、1.23%;Ad-antiX4感染的MT4细胞表面CXCR4表达率分别为:1.13%、1.17%、1.22%。感染重组腺病毒后,两种细胞的趋化活性及增殖能力均无改变。结论包含有CCR5、CXCR4反义RNA的重组腺病毒可以使细胞表面相应受体表达下降,且重组腺病毒不影响细胞的趋化活性和增殖能力。