用无血清培养基体外扩增CIK细胞的研究

ＣＩＫ (ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄｋｉｌｌｅｒ)细胞是一类细胞因子诱导的杀伤细胞。ＣＩＫ细胞能大量扩增 ,而且具有比ＬＡＫ细胞更强的肿瘤杀伤活性。为了获得临床应用的ＣＩＫ细胞 ,必须用自身血浆或无血清培养取代传统的牛血清培养方式 ,以减少病人意外感染的机会。本实验对有血清和无血清培养条件下ＣＩＫ细胞的生物活性进行了研究。将人脐血用Ｆｉｃｏｌｌ密度梯度分离后得单个核细胞 (ＭＮＣ) ,ＭＮＣ分别用含胎牛血清或自身血浆的ＲＰＭＩ 16 40培养基、或ＡＩＭ Ⅴ无血清培养基进行培养。培养ＣＩＫ细胞时 ,先加ＩＦＮ γ …     

CIK细胞的体外培养与细胞毒作用

CIK(cytokine-induced killer)细胞在体外可以快速扩增,具有高效的非MHC限制性杀瘤活性,被认为是抗肿瘤过继细胞免疫治疗的新希望。随着细胞操作及基因修饰技术的日益精进,人们正逐渐改进CIK细胞的体外培养和处理方法,以便进一步提高CIK细胞的增殖率及特异杀伤力,使其更好地应用于临床。     

不同细胞因子诱导脐血来源的CIK、NK细胞对K562细胞杀伤活性的研究

目的：了解不同细胞因子组合扩增的脐血CIK、NK细胞对人K562细胞株的杀伤活性的差异性。方法：通过SCF、FLT3L、IL-2、IL-7及IL-15等细胞因子的不同组合扩增的脐血CIK、NK细胞，分为3组，A组（SCF＋IL-2＋IL-7＋IL-15）、B组（SCF＋FLT3L＋IL-2＋IL-7＋IL-15）和C组（IL-2＋IL-7＋IL-15，对照组）；通过MTT法检测各组CIK、NK细胞在不同效靶比下对K562的杀伤率，计算各组的总杀伤单位。结果：经过21天培养A组体系中CIK＋NK细胞的比例平均超过60％，B组CIK＋NK细胞的比例平均超过70％，而C组约为50％；各组扩增的CB-CIK／NK细胞同组间在效靶比20：1时对K562的杀伤率均显著高于10：1（P〈0．01）。在不同效靶比下A组CIK／NK细胞对K562的杀伤率显著高于B和C组（P〈0．01）；C组CIK／NK细胞对K562的杀伤率稍高于B组，但两组间对K562的杀伤率无显著性差异。A组总杀伤单位显著高于C组，与B组无显著差异。结论：不同细胞因子组合扩增的脐血CIK、NK细胞对人K562细胞株的杀伤活性有差异，考虑到对效应细胞的扩增效果，B组为具有最佳杀伤活性的脐血CIK、NK细胞培养体系，其中的SCF、FLT3L对CIK／NK细胞诱导有协同效果。     

CIK细胞的体外增殖及杀瘤活性的实验研究

通过第１天在外周血淋巴细胞中加入γ－ＩＦＮ，第２天再加入ＩＬ－２、ＣＤ３单抗和ＩＬ－１，获得了已被定义为多种细胞因子诱导的杀伤细胞（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ）即ＣＩＫ细胞。通过学种方法，使外周血中微是的ＣＤ３＾＋ＣＤ５６＾＋细胞得到大量扩增。这种ＣＤ３＾＋ＣＤ５６＾＋细胞被证明是Ｔ细胞并具有ＮＫ细胞表面标志ＣＤ５６抗原。ＣＩＫ能溶解多种肿瘤细胞，表面为非ＭＨＣ限制     

人外周血自然杀伤T细胞体外扩增及其功能的初步研究

为了建立人自然杀伤T(NKT)细胞在体外扩增的方法并对其功能进行初步的研究,通过不同的方法从人外周血单个核细胞(MNC)和纯化T淋巴细胞中扩增TCRVα24+/Vβ11+NKT细胞,并采用流式细胞术测定NKT细胞中IL-4、IFN-γ、TNF-α分泌水平。采用CD4/CD8免疫磁珠去除CD4+和CD8+细胞进一步纯化NKT细胞,并用DIOC18染色及流式细胞术测定NKT细胞杀伤活性。α半乳糖神经酰胺(α-Galcer)和IL-2可以使NKT细胞在体外扩增。扩增19d后,TCRVα24+/Vβ11+细胞比率最高上升到25.5%±7.2%,NKT细胞最大扩增倍数达到(1.51±0.91)×104倍。体外扩增的NKT细胞高表达TCRVα24、Vβ11、CD3、CD161,低表达CD56。在CD3单克隆抗体和IL-2刺激下,TCRVβ11+细胞分泌IL-4和IFN-γ的细胞比例均高于TCRVβ11-细胞(P<0.05)。去除CD4+和CD8+细胞后NKT细胞含量上升到80%。NKT细胞对肿瘤细胞株U937和HL60以及树突状细胞具有较强的细胞毒效应。NKT细胞可以通过α-Galcer直接从人外周血MNC扩增获得,从而简化实验步骤。     

细胞因子诱导杀伤（CIK）细胞的大容量扩增与杀伤活性观察

建立大容量细胞因子诱导杀伤(Cytokine-inducedkiller,CIK)细胞培养方法,观察CIK细胞回输后对患者细胞免疫功能的影响。采用1000ml培养袋大量扩增患者自体CIK细胞,用MTT法检测CIK细胞杀伤活性,比较回输前后患者外周血单个核细胞(PBMNC)对靶细胞的杀伤活性及其毒副作用。结果表明大容量培养法使自体CIK细胞扩增总量达1.6×1010以上,回输CIK细胞使患者PBMNC的杀伤活性明显增加,未出现毒副作用。因此CIK细胞大容量扩增方法在治疗肿瘤微小残留病变上有着良好的临床应用前景。     

IL-24基因修饰增强CIK细胞对HL-60细胞的细胞毒作用

目的:研究IL-24基因修饰的CIK细胞与同源树突状细胞共培养后对白血病细胞的杀伤作用及其机制.方法:从健康人外周血单个核细胞中常规诱导DC和CIK 细胞,电穿孔法将IL-24基因导入CIK细胞中(获得细胞为CIK-IL24),RT-PCR 和ELISA法检测CIK细胞中IL-24基因的表达,FCM和ELISA法检测转基因前后CIK表型及分泌细胞因子能力的变化,将CIK 细胞和同源DC共培养,FCM法检测共培养的DC-CIK细胞对HL-60细胞细胞毒活性的变化.结果:通过电穿孔法成功将IL-24基因导入CIK细胞,与对照组相比,转IL-24基因后CIK细胞中CD3~+、CD3~+CD56~+细胞的比例无明显改变,CD4~+CD25~+细胞比例显著下降.IL-24可上调CD3+CD56+细胞表面粘附分子CD54、CXCR4的表达,转染IL-24基因后CIK分泌TNF-α和IFN-γ的能力显著增强,与DC共同作用HL-60细胞时转染IL-24基因后的CIK细胞细胞毒活性明显增强.结论:通过IL-24基因修饰,明显增强了CIK细胞对HL-60细胞的杀伤能力,其机制与IL-24促进CIK分泌TNF-α、IFN-γ,上调CIK细胞表面粘附分子的表达,减少CD4~+CD25~+调节性T细胞比例等密切相关.     

CIK细胞对胃癌OCUM-2MD3细胞体内外杀瘤活性的实验研究

目的：研究正常人细胞因子激活的杀伤细胞（Cytokine-induced killer,CIK)对人胃癌细胞株OCUM－2MD3的体外细胞毒活性以及对胃癌腹膜移植模型的体内抗肿瘤作用。方法：取正常人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，加入γ－IFN、IL－2、抗－CD3单抗和IL－1，体外诱导成CIK细胞，用流式细胞仪对细胞作动态表型分析，用MTT法测定CIK细胞体外对OCUM－2MD3的细胞毒活性，并与CD3AK作对比。在Balb/c裸小鼠腹腔内接种OCUM－2MD3细胞，观察CIK细胞对荷瘤鼠的抑瘤作用。结果：CIK细胞在培养2周左右获得大量增殖，CD3^ CD56^ 双阳性细胞大量增殖达1000倍以上；体外实验证明，CIK细胞对OCUM－2MD3有明显的细胞毒活性，对比CD3AK其抑瘤率与85％与62．8％（P＜0．05）。体内实验表明，CIK细胞能够显著抑制癌性腹水的生长，其抑瘤率可达100％；肿瘤标志物CEA含量明显降低。结论：CIK细胞是一种新型、高效的免疫活性细胞，具有较强的体内外抗胃癌细胞活性，具有明显的抑制癌性腹水的生长的作用，有可能用于临床上晚期胃癌的过继性免疫治疗。     

CIK细胞在慢性乙型肝炎患者外周血中表达及临床意义

目的了解细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞在慢性乙型肝炎患者外周血中的水平及临床意义。方法采用流式细胞术对62例慢性乙型肝炎患者(CHB组)及20例健康对照组外周血中的T淋巴细胞亚群、CD3-CD56+NK细胞、CD3+CD56+T淋巴细胞进行标记分析。结果在CHB组和对照组中:慢性乙型肝炎患者CD3+CD4+比例及绝对值与正常对照组比较均明显下降(P<0.05),其中低病毒载量组(HBV-L组)CD3+CD4+的绝对值高于0病毒载量组(HBV-0组)和高病毒载量组(HBV-H组)。慢性乙型肝炎患者CD3+CD8+比例及绝对值与正常对照组比较无差别;慢性乙型肝炎患者CD4/CD8比值与正常对照组比较均明显下降(P<0.05),其中以0病毒载量组(HBV-0组)和高病毒载量组(HBV-H组)降低为主。慢性乙型肝炎患者外周血CD3-CD56+NK细胞与正常组比较百分比无显著差异,绝对值显著低于正常组,各病毒载量组之间无显著差别且均低于正常对照组;CD3+CD56+T淋巴细胞与正常组比较百分比略高于正常组,但无统计学意义,绝对值显著高于正常组,且随着病毒载量的增加而升高。结论乙型肝炎病毒侵入人体,使机体上调了CIK细胞...     

人外周血NK T细胞体外扩增的初步研究

自然杀伤Ｔ细胞 (ＮａｔｕｒｅＫｉｌｌｅｒＴｃｅｌｌｓ,ＮＫＴｃｅｌｌｓ)是近来被人们所认识的不同于普通Ｔ细胞及ＮＫ细胞的一类新的免疫调节细胞 ,在肿瘤治疗 ,自身免疫病 ,以及ＧＶＨＤ方面有着广泛的应用前景[1 3] 。该类细胞有着特殊的表型 ,它既可表达ＮＫ相关的表面标志物 ,又具有明显选择性倾向的αβ型ＴＣＲ受体。鼠为Ｖα1 4Ｖβ8,人则为Ｖα2 4Ｖβ1 1 ,其配体为递呈脂类抗原的ＣＤ1ｄ分子[4 ] 。由于ＮＫＴ主要存在于胸腺、骨髓和肝脏中 ,外周血含量极少[5] ,单纯依靠原位分离的方法很难获得足够的人ＮＫＴ细胞。本研究利…     

体外CIK细胞的细胞因子表达谱研究的初步探讨

目的：探讨CIK细胞的细胞因子表达谱。方法：Ficoll分层液分离人外周血得到非粘附性淋巴细胞，体外经IFN-γ、IL-1β、IL-2及抗CD3单抗诱导分化成CIK细胞。流式细胞术鉴定细胞表型，RT-PCR定性和半定量检测细胞因子的表达。结果：CD3^＋CD56^＋细胞百分率均可达50％以上，增殖活性随培养时间的延长而上升，最高集中在14-21天。该诱导条件下获得的CIK细胞不表达IFN-ω、IFN-κ和IFN-λ，其他IFN成员多集中在10-20天高表达，初期和末期都较低；IL家族多数成员在6—10（或20）天时稳定表达，后略有下调；TNT-β和TRAIL各时期组成性表达，表达水平变化很小或几乎不变。TNF-α第20天时高表达。TGF-β1。则集中在后期表达，个体差异小。结论：在体外CIK细胞能广泛表达多种类型的细胞因子。     

脐血CIK细胞诱导K562细胞的凋亡作用

探讨脐血CIK细胞对K562细胞的杀伤活性及诱导凋亡作用。通过第1天在脐血淋巴细胞中加入IFN-r，第2天再加入IL-2和CD3单抗进行细胞培养获得多种细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokines induced killer cells)即脐血CIK细胞。用MTT法测定其抗肿瘤活性，原位末端标记法进行凋亡分析，台盼蓝拒染法计数细胞。脐血CIK细胞及培养上清抗K562活性明显优于CD3AK细胞，短期培养后其增殖活性低于CD3AK细胞；但是加入G-CSF可以提高CIK细胞的增殖活性，且CIK细胞的抗K562活性仍高于CD3AK细胞。CIK细胞诱导K562细胞凋亡率大于CD3AK细胞，G-CSF能部分抑制CIK细胞诱导的K562细胞的凋亡。脐血CIK细胞是一种有效的杀伤活化细胞，脐血在多种细胞因子适当组合的诱导下可提高杀瘤活性。     

CIK在无血清培养体系中的增殖、表型变化和抗肿瘤活性

目的:探索细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)在无血清体系中的增殖规律、表型变化及其抗瘤活性。方法:不同培养基培养CIK细胞,采用活细胞计数法观察CIK细胞的增殖,流式细胞仪检测CIK细胞的表型,CytoTox96非放射性细胞毒试剂盒检测CIK细胞的细胞毒活性。结果:经过细胞因子和抗体刺激后,CIK细胞能明显增殖,无血清培养基加自体血浆组最高可扩增473.28±27.53倍,无血清培养基组可扩增218.24±16.86倍,而RPMI1640加FCS只扩增11.52±1.04倍。CD3 CD8 、CD3 CD56 、CD226 CD11a 和CD305 CD11a 细胞随着培养时间的延长而增加,而CD3 CD4 细胞则明显减少。CIK细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用明显高于LAK细胞(P<0.01),且其细胞毒活性随着培养时间的延长而增高。结论:CIK细胞在体外扩增能力强,对肿瘤细胞的杀伤活性高,有望成为新一代抗肿瘤过继免疫细胞制剂而应用于临床。     

不同培养条件下CIK细胞纯度变化的研究

目的 为了研究不同培养条件对CIK细胞（cytokine-induced killer cells,CIK细胞）纯度的影响。方法 分别从脐血和成人外周血单个核细胞定向诱导CIK细胞的产生,用流式细胞分析法对不同培养条件下CIK细胞的纯度进行了分析。结果 培养到第14、21d时,脐血来源的CIK细胞纯度分别为38.68%和53.11%。成人来源的CIK细胞纯度分别为33.90%和63.26%,说明培养时间对CIK的纯度具有明显影响。CIK细胞培养14d后,在无细菌因子或受到再次激活的条件下继续培养7d,与连续培养的CIK细胞相比,两种来源的CIK细胞的纯度都没有明显的变化。结论 这一结果对于CIK细胞的大量扩增和临床应用具有重要的指导意义。     

水飞蓟宾增强人CIK细胞杀伤胃癌细胞株BCG-823的体外研究

为探讨水飞蓟宾对人CIK细胞杀伤胃癌细胞株BCG-823的影响及作用机制,分离健康志愿者外周血单个核细胞,体外诱导培养成人CIK细胞;收集培养扩增7d的CIK细胞,将其用不同浓度的水飞蓟宾诱导24h、48h、72h,CCK-8法检测其增殖情况;流式细胞术检测CIK细胞穿孔素、颗粒酶B、CD107a和IFN-γ的表达变化及水飞蓟宾对其凋亡的影响;LDH法检测CIK细胞对胃癌细胞株BCG-823的杀伤活性。结果显示,与对照组相比,浓度为(1.6~50)μg/mL的水飞蓟宾作用CIK细胞72h后,增殖率较对照组显著增加(P<0.05);穿孔素、颗粒酶B、CD107a和IFN-γ的表达以及活细胞率均不同程度增加(P<0.05);且对胃癌细胞BGC-823的杀伤活性显著增强(P<0.05)。以上实验结果提示一定浓度的水飞蓟宾对CIK细胞有促增殖作用,且能增强其对胃癌细胞株BCG-823的杀伤活性。     

不同输注途径对CIK细胞体内分布和抑瘤作用的影响

目的 研究不同输注途径(皮下、腹腔、瘤周注射)对CIK细胞在活体内的分布规律和抑瘤活性的影响.方法 以同位素32P-adATP标记CIK细胞,而后经尾静脉途径和腹腔途径注射入裸鼠体内,用放射性定量检测方法分析CIK细胞在各器官的动态分布.裸鼠皮下注射结肠癌细胞建立肿瘤活体模型,分别按瘤周、腹腔和尾静脉注射途径接受CIK细胞治疗,观察肿瘤的体积和重量变化.结果 CIK细胞输入裸鼠体内后,迅速分布至肝、脾、肾、肺、胃、肠等器官,其中肝、脾、肾的分布浓度最高,CIK细胞在各脏器的分布规律与不同的输注途径存在一定的联系.裸鼠皮下接种结肠癌细胞系HCT-8后,瘤周和尾静脉注射CIK细胞可以明显抑制皮下移植肿瘤的生长,而腹腔注射CIK细胞对于皮下肿瘤的抑制没有统计学意义.结论 CIK细胞体内分布的广泛性表明它可以用于身体各部位恶性肿瘤的治疗;针对不同解剖部位的肿瘤可以选择不同的CIK细胞输注途径以最大限度地提高疗效.     

恶性肿瘤转移与患者免疫活性细胞水平的相关性研究

目的 :探讨肿瘤转移和患者机体免疫活性细胞检出率的关系。方法 :用流式细胞术对恶性肿瘤患者肿瘤组织和外周血的自然杀伤细胞、细胞毒T细胞和单核 巨噬细胞的检出率进行了检测和分析。结果 :恶性肿瘤患者的组织和血液中的自然杀伤细胞、细胞毒T细胞和单核 巨噬细胞的检出率均显著低于相应的对照组 (P <0 0 1或P <0 0 5 )。恶性肿瘤转移者的自然杀伤细胞、细胞毒T细胞和单核 巨噬细胞检出率均显著低于未转移者 (P <0 0 1或 P <0 0 5 )。肿瘤组织和外周血的自然杀伤细胞、细胞毒T细胞和单核 巨噬细胞的检出率在各种情况下均呈现平行性的变化。结论 :恶性肿瘤能引起患者机体免疫活性细胞的水平显著降低 ,肿瘤转移使患者机体免疫活性细胞水平进一步下降。通过对恶性肿瘤患者外周血免疫活性细胞检测可以了解肿瘤组织免疫活性细胞的变化趋势。     

脐血来源的树突状细胞增强CIK细胞的杀伤作用

为确认体外诱导出的成熟脐血来源树突状细胞 (CBDC )可以引发强大抗肿瘤免疫反应 ,CBDC培养 12d后用电镜分析形态 ,用流式细胞仪检测其表型。在不同培养时间 ,用3 H TdR掺入法检测CBDC和细胞因子诱导杀伤细胞 (CIK )的扩增功能 ;用MTT法检测被CBDC激活的CIK抗肿瘤活性。结果表明 ,体外诱导出形态典型的DC ,高表达主要组织相容性抗原I、II类分子、CD5 4 ,也表达CD80、CD83、CD1a,不表达CD6 8。体外培养 12d成熟的CBDC ,能使CIK以最高的比率扩增 ,2种细胞最佳混合比为 1∶10时被激活的CIK杀伤BEL 74 0 2肝癌细胞的功能最强 ,最佳效靶比为 80∶1     

IL-2或IL-15协同结核分枝杆菌抗原诱导人外周血单个核细胞体外扩增细胞的特性比较北大核心CSCD

目的分析白细胞介素2(IL-2)或IL-15协同结核分枝杆菌抗原(MTB-Ag)诱导人外周血单个核细胞(PBMC)扩增细胞的生物学特性。方法采用MTB-Ag联合IL-2或MTB-Ag联合IL-15体外分别刺激正常人PBMC,培养至第12天时,经流式细胞术检测扩增细胞中γδT细胞、自然杀伤(NK)细胞和CD4+T细胞所占的比例,以及分析3种淋巴细胞扩增的绝对数量。同时用MTT法检测两组扩增细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。结果与MTB-Ag联合IL-2刺激组相比,MTB-Ag联合IL-15刺激组扩增细胞中γδT细胞所占比例明显高于前者,NK细胞所占比例明显低于前者;而两组扩增细胞中CD4^+T细胞所占比例并无显著性差异。与2个刺激组中3种淋巴细胞数量的分析结果一致。并且MTB-Ag联合IL-15刺激组扩增细胞对不同肿瘤细胞均具有显著的杀伤活性,但与MTB-Ag联合IL-2刺激组相比,并无显著性差异。结论 IL-15协同MTB-Ag可高效诱导人PBMC产生以γδT细胞增殖为主的效应细胞,该扩增细胞在体外对肿瘤细胞具有显著的杀伤活性。     

肝癌患者CIK细胞的诱导及对肝癌细胞毒作用的研究

观察肝癌患者PBMC在体外诱导成CIK细胞的能力及其对肝癌细胞的细胞毒作用。对比正常人组和肝癌患者组CIK细胞和LAK细胞之间的扩增差异。用流式细胞仪检测CIK细胞表面标志CD3、CD5 6 ,3 H TdR释放法检测CIK细胞、LAK细胞对肝癌细胞系SMMC 772 1等多种细胞系的细胞毒作用。结果显示 ,肝癌组和正常组的CIK细胞扩增倍数分别达 6 4 3倍和6 7 4倍 ,CD3+CD5 6 +细胞扩增倍数均达 6 0 0倍以上 ,在细胞扩增曲线及细胞表面标志上无差异 ,远大于LAK细胞 ;肝癌组CIK对肝癌细胞SMMC 772 1、Bel 74 0 2、Hep 3b杀伤能力均达 6 5 %～ 81% ,与正常组相同 ,且与对肠癌细胞系HIC 2 5 1杀伤能力无差异 ;对正常胎肝细胞系L 0 2的细胞毒作用 <5 % ;肝癌患者CIK对耐药的和未诱导耐药的K5 6 2细胞细胞毒作用均达到 70 %左右。肝癌患者CIK和正常人CIK一样对肝癌细胞有很强的细胞毒作用 ,对耐药肿瘤同样有效 ,对正常肝细胞无损伤 ,具有临床应用前景