局灶脑缺血再灌注成年模型大鼠大脑髓鞘相关蛋白的基因表达

背景：髓鞘蛋白是少突胶质细胞的主要成分,研究脑缺血再灌注后大脑髓鞘相关蛋白基因表达的变化有助于探讨少突胶质前体细胞在缺血性脑损伤和修复中的作用。 目的：观察脑缺血再灌注后成年模型大鼠大脑髓鞘蛋白相关基因,在脑缺血后不同时间及部位表达变化和差异。 方法：以线栓法制作成年SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,采用5′末端标记地高辛的寡核苷酸探针荧光原位核酸分子杂交检测模型大鼠再灌注后早期大脑梗死中心区、梗死周边区和梗死对侧区皮质髓鞘蛋白脂质蛋白mRNA、髓鞘碱性蛋白mRNA和髓鞘转录因子1 mRNA表达变化。 结果与结论：在梗死中心区,脑缺血再灌注后早期3种髓鞘相关蛋白基因表达均明显减少;在梗死周边区,再灌注后1 d时3种髓鞘相关蛋白基因表达与对照组比较无明显变化,之后逐渐增加,至14 d时均高于对照组(P  < 0.05,0.01),以髓鞘转录因子1 mRNA阳性细胞数升高最早(7 d)最为显著(P < 0.01)。因此,成年SD大鼠脑缺血再灌注后急性期梗死周边区皮质髓鞘相关蛋白的基因表达增加,提示少突胶质前体细胞对脑缺血性损伤敏感,其可能参与了脑缺血后损伤的修复过程。     

Expression and function of A1 adenosine receptors in the rat hippocampus following transient forebrain ischemia

We investigated how transient cerebral ischemia affects the gene expression, immunoreactive protein levels, and the function of the A1 subtype of adenosine receptor in the rat hippocampus at different times following reperfusion. A1 receptor mRNA levels were altered significantly in different hippocampal subfields as early as 6 h following insult. However, these changes in mRNA levels were not paralleled at the protein level, as western blotting with A1 receptor-specific antibodies revealed that hippocampal A1 adenosine receptor prevalence did not differ from sham control at either 6 or 24 h following insult. The lack of change in A1 receptor prevalence was consistent with functional examinations, as only marginal changes were observed in the ability of A1 receptors to attenuate excitatory post-synaptic potentials in the CA1 subfield at 24 h following reperfusion. These data illustrate that although the mRNA expression levels of the A1 adenosine receptor are altered by transient cerebral ischemia, the immunoreactive prevalence and function of this receptor are maintained in the post-ischemic hippocampus at times preceding the death of the vulnerable neurons.     

脑络欣通及其拆方对脑缺血再灌注大鼠海马CA1区Fas、Fas L蛋白及皮质Fas mRNA表达影响的实验研究

目的： 探讨脑络欣通及其拆方对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马CA1区Fas、FasL蛋白及皮质Fas mRNA表达的影响。方法： 采用线栓法大鼠大脑中动脉阻塞复制局部脑缺血再灌注模型,缺血2 h分别再灌注 1 d、3 d、7 d，随机分为假手术组、模型组、益气药组、活血药组和脑络欣通组。应用免疫组化和原位杂交法,观察缺血侧海马CA1区Fas、FasL蛋白及额顶叶皮质Fas mRNA表达。结果： 局灶性脑缺血再灌注后,缺血侧海马CA1区Fas、FasL蛋白表达平均吸光度值比假手术组增强(P＜0.01），额顶叶皮质Fas mRNA表达平均吸光度和阳性面积值强于假手术组(P＜0.01），脑络欣通组Fas、FasL蛋白和Fas mRNA表达各时段均显著低于模型组(P＜0.05或P＜0.01)；其拆方益气药、活血药组于3 d、7 d显著低于模型组(P＜0.05或P＜0.01)；脑络欣通组于3 d或/和 7 d 显著低于其拆方益气药、活血药组(P＜0.05或P＜0.01)。结论： 脑络欣通及其拆方益气药、活血药可通过抑制海马CA1区Fas、FasL蛋白和Fas mRNA表达，抗局部脑缺血再灌注神经细胞的凋亡，减轻病理性损伤。     

脑缺血再灌注后脑内血红素氧合酶-1表达的时相变化

目的 :研究局灶性脑缺血再灌注时血红素氧合酶 1(HO 1)在脑内的表达及其作用。方法 :采用梗塞大鼠大脑中动脉制备脑缺血再灌注模型 ,对 66只大鼠脑缺血及缺血再灌注后不同时间点进行HO 1免疫组化及病理学研究 ,并用计算机图像分析技术计算HO 1表达的强弱。结果 :单纯缺血 1h后皮质及海马即有HO 1阳性神经元胶质细胞的表达 ,梗塞 1h再灌 0 .5hHO 1表达与单纯缺血基本相同。随着再灌注时间的延长 ,HO 1的表达逐渐增强 ,到再灌 12h时达最高 ,以后逐渐下降 ,再灌 7天后仍有HO 1表达。HO 1主要分布在灶周皮质、梗塞皮质区、梨状皮质内的神经元及胶质细胞 ,丘脑、下丘脑、海马齿状回的神经元。结论 :局灶性脑缺血再灌注时脑内HO 1表达变化 ,是脑组织对自身损伤的重要恢复机制之一。HO 1自身具有脑保护作用并通过其下游产物CO起作用     

醒脑静注射液对全脑缺血再灌注大鼠血脑屏障ZO-1表达的影响

目的:探讨醒脑静(XNJ)注射液对大鼠全脑缺血再灌注后血脑屏障通透性及紧密连接蛋白1(ZO-1)表达的影响。方法:采用改良Pulsinelli四血管闭塞法建立大鼠全脑缺血再灌注模型。将雄性Wistar大鼠随机分为4组,即假手术组、全脑缺血再灌注模型组、溶剂对照组和XNJ组。每组均在缺血再灌注后24 h、48 h和72 h处理。用干湿重法测定脑组织中水含量,分光光度计法检测脑组织伊文思蓝(EB)含量,Western blot检测大脑皮层的ZO-1蛋白含量。结果:缺血再灌注后24 h,模型组、溶剂对照组和XNJ组的脑组织含水量均显著高于假手术组(P0.05),但在缺血再灌注后48 h和72 h,模型组和溶剂对照组脑组织含水量显著高于XNJ组和假手术组(P0.05)。缺血再灌注后24 h,模型组、溶剂对照组和XNJ组大鼠脑组织内EB含量均高于假手术组(P0.05),缺血再灌注后48 h和72 h,假手术组和XNJ组的EB含量显著低于模型组和溶剂对照组(P0.05)。缺血再灌注后24h,模型组、溶剂对照组和XNJ组大鼠脑皮层中的ZO-1蛋白表达水平显著低于假手术组(P0.05),同样缺血再灌注后48 h和72 h,假手术组和XNJ组皮层中ZO-1蛋白含量显著高于模型组和溶剂对照组(P0.05)。结论:在缺血再灌注后的48 h和72 h,醒脑静注射液对血脑屏障具有保护作用,可能与醒脑静注射液上调ZO-1蛋白的表达有关。     

缺血再灌注大鼠脑内促红细胞生成素表达的变化

探讨缺血再灌注大鼠脑内促红细胞生成素（erythropoietin,Epo）表达的变化,揭示短暂缺血时神经系统发生内源性脑保护的机制。采用线栓法制作大鼠局灶性缺血再灌注模型,以免疫组织化学和逆转录聚合酶链式反应（PT-PCR）技术,检测缺血再灌注不同时间脑内Epo的表达变化。脑缺血再灌注不同时间Epo蛋白在脑内表达广泛,主要颁布在缺血侧基底节区、海马和部分皮层。在缺血再灌注1h和6h,基底节区Epo蛋白和mRNA表达较高,再灌注12h,基底节区Epo表达减少,额顶皮质Epo表达增加,再灌注24h,额顶皮质Epo表达达到高峰,48h开始下调。因此,促红细胞生成素在缺血再灌注大鼠脑内表达的变化,可能是机体发生内源性脑保护的机制之一。     

益气活血方和补肾生髓方对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带Notch-1和Jagged1表达的影响

目的:探讨益气活血方和补肾生髓方对脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带Notch-1和Jagged1蛋白表达的影响。方法:线栓法制作局灶性脑缺血再灌注大鼠模型。随机分为假手术组、模型组、益气活血方防治组和补肾生髓方防治组。脑缺血2h,分别再灌注1周、2周、3周,采用免疫组化SABC法检测Notch-1和Jagged1蛋白表达的阳性总面积和平均吸光度。结果:在缺血侧额顶叶皮质缺血半暗带,再灌注各时点,模型组Notch-1和Jag-ged1蛋白表达的阳性总面积和平均吸光度显著高于假手术组(P0.05或P0.01),2种中药复方组再灌注各时点Notch-1和Jagged1蛋白表达的阳性总面积和(或)平均吸光度显著低于模型组(P0.05或P0.01)。结论:2种复方能通过降低缺血半暗带Notch-1、Jagged1蛋白表达,抑制Notch信号转导通路。     

CGRP和NGF对短暂性全脑缺血后再灌注大鼠纹皮质Caspase-3蛋白表达的影响

为了探讨外源性降钙素基因相关肽 ( CGRP)和神经生长因子 ( NGF)对短暂性全脑缺血后再灌注大鼠纹皮质 Caspase-3蛋白表达的影响 ,在全脑缺血后再灌注模型上 ,应用免疫组织化学结合显微图象分析方法检测了 Caspase-3蛋白表达。结果发现 ,假手术组大鼠纹皮质未见 Caspase-3表达 ;缺血组较假手术组 Caspase-3表达显著增加 ( P<0 .0 1) ;CGRP组和 NGF组 Cas-pase-3表达均弱于缺血组 ( P<0 .0 5 ) ;CGRP和 NGF合用组 Caspase-3表达明显弱于缺血组 ( P<0 .0 1) ,分别弱于 CGRP组 ( P<0 .0 5 )和 NGF组 ( P<0 .0 5 )。缺血组缺血后再灌注 3 h Caspase-3开始表达 ,1d达高峰 ,3 d时减弱 ,CGRP和 NGF合用组 Cas-pase-3表达随着缺血后再灌注时间的延长而逐渐减弱。以上结果提示 :CGRP和 NGF分别抑制全脑缺血后大鼠纹皮质 Caspase-3蛋白表达 ,联合应用则能显著抑制全脑缺血后大鼠纹皮质 Caspase-3蛋白表达 ,二者对保护缺血神经元可能有协同作用     

亚低温对脑缺血-再灌注损伤后PLC-γ 1mRNA的影响

目的探讨脑缺血-再灌注(I/R)损伤后PLC-γ1mRNA的表达变化及亚低温对脑损伤的保护作用。方法 70只雄性SD大鼠随机分为正常组、脑缺血-再灌注组(I/R)、亚低温组(SHP组),I/R、SHP组又分为24h、36h、72h亚组,每组10只动物。采用RT–PCR技术检测各时间点脑皮质中PLC-γ1mRNA的表达。结果正常组、I/R组、SHP组脑皮质中均有PLC-γ1mRNA的阳性表达,I/R组的阳性表达水平随损伤时间的延长逐渐下调,SHP组各时间点脑皮质PLC-γ1mRNA表达水平均高于I/R组。结论亚低温的脑缺血-再灌注损伤的保护作用可能与上调PLC-γ1mRNA表达相关。     

缓激肽选择性增加局部脑缺血大鼠血脑屏障的通透性

目的　研究颈动脉灌注小剂量缓激肽对缺血后血脑屏障通透性的影响及机制。方法　免疫组化分析正常脑组织的缓激肽B2受体所在。大鼠大脑中动脉结扎 1h或 2h再灌流 1h。用放射自显影方法检测缓激肽对血脑屏障通透性的变化。WesternBlot方法检测bNOS ,iNOS和B2受体。NOS检测盒检测NOS的活性。结果　正常脑组织毛细血管内皮未见B2受体表达 ,在神经细胞上发现B2受体的表达。缺血 2h再灌流1h缓激肽灌注缺血区血脑屏障通透性显著增加。WesternBlot结果提示 ,在缓激肽灌注组和对照组间 ,缺血皮质区bNOS和B2受体没有明显变化 ,各组中均未检测出iNOS。缓激肽灌注组的NOS活性显著高于对照组。结论　正常脑组织毛细血管内皮未表达B2受体 ,神经细胞上可见B2受体的表达。灌注小剂量缓激肽能选择性增加局部脑缺血大鼠血脑屏障的通透性     

CGRP和NGF对全脑缺血再灌注大鼠脑组织PKC表达的调节作用

目的　研究大鼠脑缺血再灌注后蛋白激酶C(proteinkinaseC ,PKC)在海马和顶叶皮质的表达 ,探讨降钙素基因相关肽 (CGRP)和神经生长因子 (NGF)对脑组织缺血再灌注的保护作用及机制。方法　采用颈动脉负压分流法制作大鼠脑缺血再灌注模型 ,采用免疫组织化学SABC法及显微图像分析检测海马及皮质内PKC的表达。结果　大鼠缺血再灌注海马CA1区及顶叶皮质内PKC阳性产物平均灰度值较正常组低 (P <0 .0 5 ) ,注射CGRP或NGF后PKC阳性产物平均灰度值明显高于缺血再灌注组 (P <0 .0 1) ,二者联合应用时平均灰度值比单独应用高 (P <0 .0 1)。结论　CGRP及NGF参与缺血神经元PKC的调节 ,二者对缺血神经元有协同保护作用     

大鼠脑缺血再灌注损伤后极化的小胶质细胞排斥性导向分子A的表达变化

目的 探讨大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤后极化的小胶质细胞排斥性导向分子A（RGMa）的表达变化。 方法 取雄性SD大鼠30只,随机分成对照组,缺血再灌注损伤7 d、14 d模型组（I/R）,采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型(tMCAO);Real-time PCR检测M1、M2型小胶质细胞标记分子白细胞介素-1β（IL-1β）、诱导性一氧化氮合酶（iNOS）、精氨酸酶1（Arg-1）及CD206 mRNA的表达;免疫荧光检测缺血区小胶质细胞RGMa的表达;体外培养小胶质细胞,分别用M1或M2型小胶质细胞的诱导物脂多糖（LPS）或IL-4诱导24 h后,利用Real-time PCR检测M1、M2型小胶质细胞标记分子IL-1β、iNOS、Arg-1、CD206 mRNA的表达;Western blotting检测M1、M2型小胶质细胞上RGMa的表达。 结果 缺血再灌注损伤后7 d、14 d,M1、M2型小胶质细胞的标记分子表达增加。缺血后7 d、14 d激活的小胶质细胞上RGMa大量表达。RGMa在体外培养的LPS诱导极化的M1型小胶质细胞和IL-4诱导极化的M2型小胶质细胞上表达均显著增加。 结论 大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤后,RGMa在缺血区M1型和M2型极化的小胶质细胞上均大量表达,RGMa可能在小胶质细胞激活极化过程中发挥重要作用。RGMa可能是缺血性脑卒中治疗的新靶点。     

Calcium/calmodulin dependent protein kinase II mRNA in the gerbil brain after cerebral ischemia.

The effect of transient cerebral ischemia on the expression of Ca2+/calmodulin dependent protein kinase II (CaM kinase II) mRNA in the gerbil brain was analyzed by Northern blots using cDNA clones for CaM kinase II. Ten minutes of bilateral carotid occlusion and 30 min of reperfusion resulted in reduced protein levels for alpha and beta subunits of the CaM kinase II, decreasing to 35% of control levels at 24 h. Recovery of immunoreactivity was detected in the cortex after 48 h. Eight to twelve hours after ischemia, the cortex showed a decrease in alpha and beta CaM kinase II mRNA levels. By 12-24 h of reperfusion the level of CaM kinase II mRNA was reduced to 26% of the control mRNA levels. CaM kinase II mRNA levels recovered by 48 h after ischemia, coinciding with the increase in CaM kinase II protein immunoreactivity. These results suggest that CaM kinase II is involved in neuronal survival through the reorganization of the neuroarchitecture and that the regulation of this role is controlled at the level of gene expression.     

降钙素基因相关肽和神经生长因子对短暂性脑缺血后再灌注大鼠纹皮质c-fos mRNA及蛋白表达的影响

目的：探讨外源性降钙素基因相关肽(CGRP)和神经生长因子(NGF)对短暂性脑缺血后再灌注大鼠纹皮质c-fos mRNA及蛋白表达的影响。方法：在脑缺血后再灌注模型上，应用原位杂交和免疫组织化学结合显微图像分析方法检测c-fos mRNA及蛋白表达。结果：缺血组大鼠纹皮质较假手术组c-fos mRNA和蛋白表达非常显著增加；CGRP组和NGF组c-fos mRNA和蛋白表达分别显著弱于缺血组；CGRP和NGF合用组c-fos mRNA和蛋白表达非常明显弱于缺血组、CGRP组和NGF组。结论：CGRP和NGF分别抑制脑缺血后再灌注大鼠纹皮质c-fos mRNA及蛋白表达，联合应用则能显著抑制脑缺血后再灌注大鼠纹皮质c-fos mRNA及蛋白表达，二者对保护缺血神经元可能有协同作用。     

高迁移率族蛋白B1对大鼠局灶脑缺血/再灌注后大脑皮质梗死周围区神经干细胞增殖的影响

 目的：探讨高迁移率族蛋白B1（HMGB1）对局灶脑缺血/再灌注大脑皮质梗死周围区神经干细胞增殖的影响。方法：选取雄性SD大鼠48只,分为假手术组、模型组、RNA干扰组和阴性干扰组。采用线栓法制备大鼠局灶脑缺血/再灌注模型,缺血1 h再灌注7 d时观测。用携带大鼠HMGB1 shRNA的慢病毒载体介导RNA干扰抑制脑内HMGB1的表达,通过免疫荧光双标记HMGB1/GFAP和Western blotting法检测RNA干扰效果。通过免疫荧光双标记5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）/神经巢蛋白（nestin）检测大脑皮质梗死周围区神经干细胞的增殖。结果：与假手术比较,再灌注7 d时,模型组大脑皮质梗死周围区HMGB1蛋白表达明显升高（P<0.05）;与模型组比较,RNA干扰有效抑制HMGB1蛋白的表达（P<0.05）。与假手术组比较,模型组的BrdU/nestin双标记细胞明显增多（P<0.05）;与模型组比较,RNA干扰组的BrdU/nestin双标记细胞明显减少（P<0.05）。结论：局灶脑缺血/再灌注后大脑皮质梗死周围区HMGB1蛋白表达水平升高可促进该部位的神经干细胞增殖。     

小鼠脑缺血时自噬相关基因5的抗损伤作用

 目的: 观察自噬相关基因5(Atg5)在小鼠脑缺血再灌注损伤中的抗损伤作用。方法: 将雄性BALB/c小鼠随机分为假手术(sham)组、缺血再灌注(I/R)组、Atg5 siRNA组和control siRNA组。I/R组采用大脑中动脉阻塞(MCAO)60 min后再灌注24 h。Atg5 siRNA组和control siRNA组将5 μL Atg5 siRNA或scrambled siRNA在MCAO前24 h侧脑室注射。实时荧光定量PCR和Western blot检测Atg5的表达;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法检测抑制Atg5对缺血再灌注损伤后脑梗死面积和水肿率的影响;神经行为学评分法检测抑制Atg5对缺血再灌注损伤后神经症状的影响。结果: MCAO后再灌24 h,缺血半影区Atg5 mRNA和蛋白水平显著增高(P<0.05);Atg5 siRNA明显降低缺血再灌后Atg5 mRNA和蛋白的表达(P<0.05);侧脑室给予Atg5 siRNA能显著增加脑梗死面积和水肿率,并加重神经行为学损伤(P<0.05)。结论: 沉默Atg5加重小鼠脑缺血再灌损伤,提示MCAO后诱导的 Atg5 可减轻小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤。     

大鼠星形胶质细胞在高血糖脑缺血再灌注损伤中的变化

目的:探讨星形胶质细胞在高血糖脑缺血再灌注损伤中的变化规律。方法:采用链脲佐菌素(STZ)诱导Ⅰ型糖尿病高血糖大鼠模型,通过双侧颈总动脉夹闭联合股动脉放血法建立全脑缺血再灌注模型,应用组织学、免疫荧光、组织化学及Western Blot方法,对比观察糖尿病高血糖脑缺血再灌注组(简称糖尿病组)与正常血糖脑缺血再灌注组(简称正常血糖组)在脑缺血15 min、再灌注1 h和6 h大脑额叶皮质区神经元、星形胶质细胞组织学变化及GFAP的表达。结果:正常血糖组再灌注1 h脑组织出现轻度水肿;再灌注6 h脑水肿加重,出现神经元固缩;再灌注1 h,糖尿病组病变与正常血糖组基本相同,再灌注6 h脑水肿加重,固缩神经元进一步增加。再灌注1 h和6 h,糖尿病组Nissl体平均光密度值明显低于正常血糖组(P<0.05)。脑组织GFAP免疫荧光检查可见,再灌注6 h正常血糖组GFAP免疫阳性细胞明显增加。糖尿病组再灌注1 h和6 h,出现GFAP阳性星形胶质细胞数目增加(P<0.05),胞体显著增大,突起增长、增粗。Western Blot结果可见,糖尿病组GFAP的表达明显高于正常血糖组。结论:糖尿病高血糖脑缺血再灌注能够加重神经元损伤,星形胶质细胞出现更明显的数量增加和GFAP表达。     

亚低温对大鼠缺血性脑损伤后SOCS3表达的影响

目的观察大鼠局灶性脑缺血再灌注后不同时间点细胞因子信号转导抑制因子-3(supressor of cytokine signaling 3,SOCS3)的表达情况及实施亚低温后的变化,进一步探讨亚低温的脑保护作用。方法线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞局灶性脑缺血再灌注模型,同时给予亚低温治疗。HE染色观察病理形态改变,免疫组化法检测SOCS3的表达,TUNEL法检测凋亡细胞。结果与假手术组相比,常温缺血组于再灌注3 h后SOCS3的表达开始增强,至24 h达高峰,7天时仍有表达;亚低温缺血组各时间点表达均明显高于常温缺血组(P<0.05);常温缺血组凋亡阳性细胞数随再灌注时间的延长而逐渐增多,至72h达高峰;亚低温缺血组各时间点的表达均明显少于常温缺血组(P<0.05)。结论脑缺血再灌注损伤后SOCS3的表达增强,亚低温可能通过促进SOCS3的表达发挥缺血后抗神经元凋亡的作用。     

脂质体介导的VEGF质粒对成年大鼠脑缺血再灌注后大脑皮质内P-MeCP2表达的影响

目的观察脂质体介导的VEGF质粒对成年大鼠脑缺血再灌注后大脑神经元phosphorylation of methyl-CpG binding protein 2 (P-MeCP2)表达的影响,探讨VEGF促进缺血损伤后神经元新生的可能机制,进一步为VEGF治疗缺血性脑中风提供实验和理论依据。方法 30只SD大鼠,随机分为假手术组(sham组)、质粒组(VEGF组)和对照质粒组(vehicle组),采用左侧大脑中动脉线栓(MCAO)模型,侧脑室给药,免疫印迹、免疫荧光三标染色及激光共聚焦扫描技术等方法检测P-MeCP2的表达。结果再灌2周VEGF质粒组P-MeCP2、BrdU和NeuN同时表达于缺血侧大脑皮质神经元,而缺血对侧没有找到,VEGF质粒组皮质内P-MeCP2的表达较对照组、假手术组显著增高(p<0.01)。结论脂质体介导的VEGF质粒能促进成年大鼠脑缺血神经元的新生,可能与上调P-MeCP2的表达有关。