大鼠骨髓间充质干细胞与脂肪间充质干细胞生物学特性的比较

目的:本研究旨在比较同一个体来源的脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)和骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的生长特点和诱导分化能力。方法:取7～10 d SD大鼠的脂肪和骨髓,体外分离、纯化脂肪和骨髓来源间充质干细胞,分别从细胞形态、生长动力学、表面标志、分化潜能等方面进行鉴定和比较。结果:脂肪间充质干细胞的增殖速度明显大于骨髓间充质干细胞(P<0.05),两种细胞所表达的表面蛋白标志物基本相似,但脂肪间充质干细胞表面蛋白标志CD106呈阴性,而骨髓间充质干细胞CD106呈阳性。在成软骨分化中脂肪间充质干细胞弱表达Ⅱ型胶原,而骨髓间充质干细胞不表达。第5、10、15、20代ADSCs及BMSCs经成骨诱导后茜素红染色均呈阳性且有"矿化"结节形成,碱性磷酸酶活性以第5代最强,随着细胞代次的递增,碱性磷酸酶活性呈递减趋势。结论:ADSCs较BMSCs更易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨、成脂、成软骨能力较强,适合作为再生医学的种子细胞。     

人脐带Wharton's Jelly来源间充质干细胞与人牙周膜干细胞成骨分化能力的对比研究

目的:比较人脐带Wharton's Jelly来源间充质干细胞(human umbilical cord Wharton's Jelly-derived mesechymal stem ceils,hUCWJMSCs)与人牙周膜干细胞(periodontal mesenchymal stem cells,hPDLSCs)成骨分化能力.方法:体外培养hUC-WJMSCs和hPDLSCs.MTT法检测细胞增殖情况;成骨诱导后测定细胞的ALP活性,茜素红染色检测细胞矿化能力,Real-timePCR分析OPN和Runx2基因的表达.结果:hUCWJMSCs增殖能力高于hPDLSCs;经矿化诱导后hPDLSCs ALP表达、矿化结节形成高于hUCWJMSCs(P＜0.05);Runx2在hPDLSCs中表达高于hUCWJMSCs(P ＜0.05);而hUCWJMSCs中OPN表达高于hPDLSCs(P＜0.05).结论:hUCWJMSCs、hPDLSCs均具有成骨分化能力,hPDLSCs成骨分化能力较强.     

犬颌骨与髂骨两种骨髓间充质干细胞增殖和骨向分化能力比较

目的:比较犬颌骨与髂骨两种骨髓间充质干细胞增殖和骨向分化能力,为骨移植和组织工程骨的种子细胞获取提供理论基础。方法:体外组织块培养法和有限稀释法克隆化培养颌骨骨髓间充质干细胞(J-BMMSCs组);骨髓穿刺法和密度梯度离心法培养髂骨骨髓间充质干细胞(I-BMMSCs组)。取第3代细胞分别进行以下检测:①流式细胞仪鉴定细胞表面抗原标记;②计算克隆形成率;③MTT法检测生长曲线;④骨向诱导和RT-PCR检测成骨相关基因Runx-2、BSP mRNA表达情况。结果:①J-BMMSCs组和I-BMMSCs组均阳性表达CD44、CD29,阴性表达CD34;②J-BMMSCs组和I-BMMSCs组的克隆形成率分别为(24.5±2.3)%和(18.6±1.3)%(P<0.05);③MTT法检测生长曲线显示J-BMMSCs组增殖速度强于I-BMMSCs组(P<0.05);④成骨诱导7 d后,ALP染色结果显示J-BMMSCs组的成骨能力强于I-BMMSCs组;成骨诱导21 d后两组均出现不同程度矿化结节,定量分析显示J-BMMSCs组矿化能力强于I-BMMSCs组;成骨诱导0 d、7 d、14 d后,RT-PCR结果显示J-BMMSCs组各时间点Runx-2和BSP mRNA表达均明显高于I-BMMSCs组。结论:J-BMMSCs组增殖及成骨能力均强于I-BMMSCs组。颌骨是骨移植的理想供体位点,颌骨骨髓适于用作组织工程骨的成体干细胞来源。     

牙髓、牙周膜及脐带间充质干细胞三系分化能力的体外比较研究

目的:比较牙髓、牙周膜和脐带三种不同来源间充质干细胞的(Mesenchymal stem cells,MSCs)三系分化潜能.方法:培养分离人脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)、牙髓干细胞(Dental pulp stem cells,DPSCs)和牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs);倒置显微镜观察细胞形态,体外诱导这3种MSCs向成骨、成脂和成软骨方向分化,通过茜素红染色、油红O染色、阿尔辛蓝染色分别鉴定细胞成骨、成脂和成软骨分化能力,进一步实时荧光定量PCR检测比较3种细胞成骨相关基因OCN和RUNX2及成脂相关基因PPAR-γ的表达水平.结果:这3种MSCs细胞形态略有不同,三者均可向成骨、成脂和成软骨方向分化,但其分化潜能有所差异,DPSCs成骨和成脂向分化能力强,UCMSCs则更适于成脂和成软骨向分化,而PDLSCs成软骨向分化较具优势.结论:DPSCs,PDLSCs和UCMSCs三系分化潜能不同,本研究为干细胞临床转化中选择理想细胞来源提供实验依据.     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养与鉴定

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的体外培养方法及其生物学特性。方法:体外分离、培养大鼠BMSCs,进行细胞形态学观察、生长曲线测定、细胞表面标记物检测;并采用体外诱导分化方法对BMSCs多向分化潜能进行鉴定。结果:大鼠BMSCs传代后细胞生长状态相对稳定,呈梭形;流式细胞仪鉴定CD90阳性率为88.2%,CD29阳性率为98%,CD34阴性率为2.8%,CD45阴性率为2.7%。成骨诱导21 d后,茜素红染色后可在显微镜下观察到矿化结节形成。成脂诱导14 d,油红O染色后显微镜下可见红色脂滴形成。结论:BMSCs在体外培养中贴壁生长,增殖较快;表达骨髓组织来源干细胞的表面标记物CD29、CD90;诱导后能向成骨细胞、脂肪细胞分化。     

组蛋白去甲基化酶KDM6A促进骨髓间充质干细胞成骨分化研究

目的研究组蛋白去甲基化酶KDM6A对骨髓间充质干细胞成骨定向分化能力的影响。方法构建Flag-KDM6A慢病毒表达质粒。利用慢病毒转染构建稳定过表达KDM6A的骨髓间充质干细胞。碱性磷酸酶活性实验检测成骨分化早期指标-碱性磷酸酶活性。茜素红染色及钙离子定量分析检测干细胞体外矿化能力。实时：毫量RT-PCR检测成骨分化相关基因．骨桥蛋白和骨钙素的表达。结果过表达KDM6A促进骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性、骨髓间充质干细胞体外矿化能力以及骨桥蛋白和骨钙素的表达。结论组蛋白去甲基化酶KDM6A具有促进骨髓间充质干细胞成骨分化的潜能,可以作为一个候选的靶基因用于骨组织工程技术,促进骨组织再生。．     

兔下颌骨来源骨髓间充质干细胞的体外培养及鉴定

目的:探讨兔下颌骨来源的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)体外分离、培养并对下颌骨来源的BMMSCs进行鉴定.为骨组织工程提供种子细胞.方法:取兔下颌骨中的骨松质,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁培养,取P2或P3代BMMSCs进行检测.倒置显微镜下观察细胞形态;MTT法测定细胞增殖并绘制细胞生长曲线;克隆形成实验计算克隆形成率;向成骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞多向诱导分化;流式细胞仪检测细胞表面抗原标记.采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析.结果:细胞经传代后形态一致,呈梭形或三角形;细胞生长曲线显示,下颌骨BMMSCs经历潜伏期、对数生长期和平台期;克隆形成率为37％;成骨及成脂诱导形成钙结节及脂滴,茜素红及油红O染色呈阳性;成骨骼肌诱导desmin抗原标记阳性;流式细胞仪检测结果显示,所获得的下颌骨BMMSCs纯度较高.CD90和CD146表面标记阳性率分别为98.7％、98.1％.结论:从兔下颌骨分离的BMMSCs纯度较高,有强大的自我复制、增殖特性和体外多向诱导分化潜能,有望成为骨组织工程的种子细胞.     

兔髁突来源骨髓间充质干细胞体内对骨缺损修复的实验研究

目的:研究兔下颌骨髁突来源骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)的体外分离、培养、鉴定及其体内成骨情况。方法:从兔下颌骨髁突中分离干细胞进行培养,对BMMSCs向成骨、成骨骼肌细胞的分化进行鉴定。实验组将BMMSCs复合于载黄芪多糖(APS)支架材料上,植入骨缺损区;对照组1植入单纯珊瑚羟基磷灰石(CHA)材料;对照组2植入APS/CHA复合材料;空白组不植入任何材料。应用组织学和扫描电镜观察,并比较植入材料与骨组织交界处的成骨修复情况。结果:细胞经过传代后形态一致,呈梭形;ALP染色呈阳性,成骨诱导后形成钙结节;成骨骼肌诱导后desmin免疫细胞化学染色阳性。植入体内修复骨缺损12周,实验组见大量新生骨及活跃的骨细胞;对照组1仅在材料表面见少量新骨形成;对照组2材料内有部分新骨形成;空白组基本未见骨修复。结论:从兔下颌骨髁突中分离、培养出的BMMSCs,具有体内、体外成骨的能力。     

大白鼠骨髓间质干细胞体外培养体系的建立及分化研究

目的：建立大鼠骨髓间质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)体外培养体系，对大白鼠BMMSCs体外培养的条件，供体大白鼠鼠龄等进行了研究。对体外培养的大白鼠BMMSCs的形态学，增殖动力学，成骨的表面标记及体外钙化能力进行了系列研究，方法：取2月龄SD大鼠胫骨和股骨骨髓进行体外培养，取第二代BMMSCs,绘制生长曲线并计算群体倍增时间，对经成骨诱导剂诱导的BMMSCs的ALP表达及体外钙沉积进行了研究。结果：细胞呈长梭形或多角形，细胞表面有不规则的细胞突起，秀射电镜可见胞浆有大量的粗面内质网及线粒体，细胞表面可见突起，细胞生长曲线呈S形，群体倍增时间为72小时，经诱导分化的BMMSCs可见碱性磷酸酶的表达。von Kossa染色可见散在深染的钙沉积班块。结论：来源于年轻大鼠股骨骨髓的间质干细胞体外培养并经诱导后可分化为具有部分成骨特性的细胞，可以为体内骨组织工程提供组织细胞。     

同期神经化增强髂骨瓣术后骨髓间充质干细胞的活性

目的： 比较神经化髂骨瓣和传统髂骨瓣重建下颌骨缺损术后,移植骨块骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）的干细胞活性。方法： 游离血管化髂骨瓣移植修复下颌骨缺损术后半年,从移植骨骨髓体外分离、培养BMMSCs,通过集落形成观察、Brdu摄入实验、群体倍增时间、体外成骨茜素红染色法、裸鼠皮下成骨法检测BMMSCs增殖、自我更新及成骨分化能力。采用SPSS 24.0软件包对数据进行统计学分析。结果： 神经化髂骨移植术后分离、培养的BMMSCs的集落形成、增殖、群体倍增时间、体外及体内成骨分化能力均显著高于非神经化组（P<0.05）。结论： 神经化髂骨瓣重建下颌骨缺损可以增强BMMSCs的自我更新、增殖、成骨分化等潜能,有助于维持移植骨的术后内环境稳定,减少术后移植骨吸收。     

Mouse mandible contains distinctive mesenchymal stem cells

Although human orofacial bone-marrow-derived mesenchymal stem cells showed differentiation traits distinctly different from those of mesenchymal stem cells (MSCs) derived from long bone marrow (BMMSCs), mouse MSCs derived from orofacial bone have not been isolated due to technical difficulties, which in turn precludes the use of mouse models to study and cure orofacial diseases. In this study, we developed techniques to isolate and expand mouse orofacial bone/bone-marrow-derived MSCs (OMSCs) from mandibles and verified their MSC characteristics by single-colony formation, multi-lineage differentiation, and in vivo tissue regeneration. Activated T-lymphocytes impaired OMSCs via the Fas/Fas ligand pathway, as occurs in BMMSCs. Furthermore, we found that OMSCs are distinct from BMMSCs with respect to regulating T-lymphocyte survival and proliferation. Analysis of our data suggests that OMSCs are a unique population of MSCs and play an important role in systemic immunity. Abbreviations: BMMSC, bone marrow mesenchymal stem cell; HA/TCP, hydroxyapatite/tricalcium phosphate; OMSC, orofacial mesenchymal stem cell; OVX, ovariectomized.     

外周血作为骨组织工程种子细胞来源的初步研究

目的：研究外周血作为骨组织工程种子细胞来源的可能性。方法：密度离心法分离兔外周血单个核细胞,冲洗收集长骨内骨髓,将两者在体外进行培养。检测两种来源细胞的表面分子标志物及成脂、成骨能力差异。结果：骨髓原代培养细胞集落形成早,细胞形态均一。传代后CD29阳性,CD34阴性;成脂诱导时脂滴出现早且多;成骨诱导时碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原表达早,矿化结节数量多且体积大。外周血原代培养细胞集落形成晚,形态不一,种类多。传代后CD29阳性,CD34弱阳性;成脂诱导时脂滴出现晚且少;成骨诱导时碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原表达较晚,有散在的矿化结节和管样结构形成。结论：外周血内含有间充质干细胞、内皮祖细胞等多种干细胞,可以作为血管化组织工程骨的种子细胞来源,但需要进一步优化培养方法。     

兔骨髓干细胞和脂肪干细胞体外成骨能力的比较

目的:评价两种不同来源的间充质干细胞,即骨髓干细胞(BMSC)和脂肪干细胞(ADSC)的体外成骨能力,为其将来应用于细胞治疗和组织工程研究提供一定的理论依据。方法:分别取同一只兔的髂骨骨髓和腹股沟脂肪作为BMSC和ADSC的来源,分离培养后比较成骨、成脂分化潜能,细胞表面抗原标记物;成骨诱导后检测碱性磷酸酶(ALP)活性,RT-PCR分析其成骨相关基因的表达情况。结果:BMSC和ADSC都具有向成骨、成脂分化的潜能;在成骨诱导分化后,BMSC有较高的ALP活性和较多的钙结节形成。RT-PCR结果显示:BMSC表达较高的BMP-2、OCN和OPN等成骨基因。结论:BMSC和ADSC都具有向成骨、成脂分化的潜能,ADSC有较好的成脂分化能力,BMSC有较好的成骨分化能力;两者都可以作为组织工程的种子细胞。     

低强度脉冲超声对不同钛表面骨髓间充干细胞成骨分化的影响

目的:观察低强度脉冲超声(LIPUS)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在钛片表面成骨分化的影响.方法:将体外培养的BMSCs分别接种于光滑钛表面和大颗粒喷砂酸蚀(SLA)钛表面,进行矿化诱导并实施超声干预和假刺激.于矿化诱导后3、7d进行碱性磷酸酶(ALP)定量检测,14 d进行ALP染色观察;矿化诱导21 d后行茜素红染色;于矿化诱导14、21 d检测成骨相关基因及蛋白表达.结果:矿化诱导后3、7d超声组ALP活性较对照组高(P＜0.05),14 d超声组与对照组相比钛片表面ALP染色明显深染;茜素红染色显示,21 d后超声组的染色更明显且形成更多的矿化结节;超声组的成骨相关蛋白成骨转录因子2、骨形成蛋白、骨桥蛋白表达增高;RT-PCR检测到成骨相关基因、ALP、成骨转录因子2、骨形成蛋白、骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白均有不同程度表达增高(P＜0.05).结论:LIPUS可以促进光滑及SLA钛表面BMSCs的成骨分化.     

高糖对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：探讨不同葡萄糖浓度培养环境对人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSC）增殖和成骨分化的影响。方法用含不同葡萄糖浓度的基础培养基培养,在1、4、7、10 d进行CCK?8细胞增殖检测;用含不同葡萄糖浓度的成骨诱导分化培养基培养细胞7 d,观察hBMSC分化情况;实时荧光定量PCR法检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、骨钙素（osteocalcin,OC）、I型胶原蛋白（collagen type I, Col?1）基因表达水平;在7 d进行钙茜素红染色显示矿化结节形成。结果10 mM葡萄糖有助于hBMSC细胞增殖,高浓度葡萄糖（＞30 mM）能够抑制hBMSC增殖（P＜0.05）;成骨诱导液能诱导hBMSC成骨分化,但葡萄糖浓度升高会减少hBMSC的矿化结节形成、抑制成骨标志基因ALP、OC和Col?1表达（P＜0.05）。结论在高糖环境培养下,抑制hBMSC增殖、下调成骨标志性基因Col?1、ALP、OC的表达,同时高糖可以减弱干细胞的成骨矿化能力,间接影响骨形成和代谢。     

bFGF重组慢病毒对羊骨髓间充质干细胞成骨功能影响的研究

目的:探讨碱性成纤维生长因子(basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)基因转染对体外培养的骨髓间充质干细胞(Bone Marrow mesenchymal Stem Cells, BMSCs)的增殖和骨向分化的影响,为构建组织工程骨的种子细胞做理论依据。方法:构建携带人bFGF基因的慢病毒载体,转染诱导后羊的BMSCs,得到bFGF转染组,选择未转染的BMSCs为对照组。两组细胞采用实时定量PCR技术和蛋白质印迹法技术检测Collagen-Ⅰ、OC、OPN等成骨相关基因的mRNA水平及蛋白水平相对表达量的变化情况。结果:bFGF组OPN和Collagen-Ⅰ基因mRNA水平表达量较对照组增高,差异有统计学意义(P<0.05),两组细胞在OC基因mRNA水平表达量上差异无统计学意义;bFGF组细胞在OPN、OC和Collagen-Ⅰ基因蛋白水平上表达量均高于对照组,且差异有统计学意义。结论:bFGF基因转染能增强羊BMSCs增殖和骨向分化的能力,可作为组织工程骨的种子细胞。     

三七总皂苷对兔BMSCs的成骨分化及TGF-β1表达的影响

目的:观察三七总皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)对兔骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)成骨分化及TGF-β1在基因水平表达变化的影响。方法:体外分离培养兔BMSCs,观察不同浓度PNS(50、100、200 mg/L)对兔BMSCs的影响,采用MTT法检测细胞增殖,茜素红染色观察钙结节形成,qRT-PCR检测TGF-β1表达水平。结果:各浓度PNS培养下的细胞增殖无明显差异(P>0.05);100、200 mg/L PNS组的钙结节数量和TGF-β1的表达水平均高于阴性组(P<0.05)。结论:PNS可促进兔BMSCs的成骨分化并刺激其分泌TGF-β1,但无明显促细胞增殖作用。