人乳头瘤病毒6型E7与结核杆菌热休克蛋白70融合基因的构建及原核表达

目的：构建结核杆菌热休克蛋白(HSP)70与人乳头瘤病毒(HPV)6型E7抗原的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法：利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序后,再通过PCR方法扩增HPV6型E7基因片段．测序后插入HSP70基因的5’端,构建HPV6E7与结核杆菌HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX—E7-HSP70：在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,进行诱导表达和分离纯化。结果：成功地构建了pGEX—E7-HSP70原核表达质粒：在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,经异丙醇-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达相对分子质量约为108000的蛋白;经谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达系统纯化,得到E7与结核杆菌HSP70的可溶性融合蛋白。结论：成功获得HPV6型E7与结核杆菌HSP70的融合蛋白,为研究该融合蛋白疫苗在尖锐湿疣治疗中的作用奠定了基础。     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

人乳头状瘤病毒16 E6/E7基因稳定表达的永生化角质形成细胞的建立及鉴定

【摘要】 目的 构建人乳头状瘤病毒（HPV）16 E6/E7基因稳定表达的人永生化角质形成细胞（KC）,为研究HPV16 E6/E7诱导的细胞永生化及恶性转化机制提供细胞模型。方法 两步消化法分离培养原代人包皮角质形成细胞（HFK）,利用慢病毒感染技术对细胞稳定转染HPV16 E6/E7基因,连续培养30代以上,筛选出永生化KC,分为3组：①空白对照组：传代2次的原代HFK;②实验组：传代2次的原代HFK感染LV5-HPV16 E6/E7,感染细胞记录为A0代,感染后以传代次数记录（A1、A2……）;③阳性对照组：HPV16阳性宫颈癌细胞SiHa。应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western印迹实验分别检测空白对照组、实验组、阳性对照组HPV16 E6/E7 mRNA、蛋白及CK14蛋白的表达,CCK-8及Transwell Insert方法检测细胞的增殖及侵袭能力。裸鼠致瘤实验检测实验组A30、阳性对照组SiHa细胞的致瘤能力。结果 成功分离原代HFK。LV5-HPV16 E6/E7重组质粒感染原代HFK后,空白对照组细胞无荧光表达,连续传代后出现衰老表现,实验组A30细胞体积、形态较原代HFK无明显变化,且荧光表达率为100%。与空白对照组相比,实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E6 mRNA表达水平显著升高（t值分别为7.12、8.07、6.53、5.66;P值分别 < 0.001、 < 0.001、 = 0.001、 = 0.005）;与空白对照组相比,实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E7 mRNA表达水平也显著升高（t值分别为3.20、4.29、3.75、4.22;P值分别为0.024、0.008、0.013、0.014）。空白对照组未见HPV16 E6/E7蛋白的表达,而A30及SiHa细胞可见HPV16 E6/E7蛋白的表达。CCK-8实验显示,实验组A10、A20、A30细胞增殖水平显著高于空白对照组（t值分别为6.49、7.55、9.43;P值分别为0.003、0.002、0.001）,而A1的增殖水平与空白对照组比较,差异无统计学意义（t = 2.40,P = 0.074）。Transwell Insert侵袭实验显示,A30不能穿过基底膜,SiHa细胞可穿过基底膜被染成蓝色。裸鼠接种A30细胞2个月后无肉眼可见肿瘤,组织学亦显示无肿瘤形成,裸鼠接种SiHa细胞后可于皮下形成肿瘤。结论 通过采用慢病毒技术转染HPV16 E6/E7基因成功建立人永生化角质形成细胞,可作为HPV相关研究中的理想细胞模型。     

人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因的克隆和表达

目的 从尖锐湿疣皮损标本中扩增出人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因．并进行表达、纯化和鉴定。方法用PCR法，从尖锐湿疣标本中扩增出HPV11E7蛋白基因，与pGEX-6P-1载体连接成重组表达质粒pGEX-6P-1／E7；重组质粒转入BL21大肠杆菌，经诱导表达融合蛋白GST-E7；该蛋白经剪刀酶切除GST，Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化，SDS-PAGE和蛋白质印迹法检测鉴定。结果经酶切及序列分析鉴定，重组质粒pGEX-6P-1／E7成功构建．诱导后高表达GST-E7融合蛋白并得到纯化，蛋白质印迹证实表达蛋白为E7蛋白。结论获得高表达、高纯度的HPV11 E7蛋白，为该蛋白的功能及免疫学分析及尖锐湿疣疫苗研究打下了基础。     

16型人乳头瘤病毒E6、E7基因延长人黑素细胞生命期的初步研究

16型人乳头瘤病毒(HPV16)E6/E7基因能有效地使人上皮细胞、角质形成细胞永生化,为探讨HPV16E6/E7对黑素细胞的影响,本研究用Lipofectamine转染法将HPV16E6/E7基因导入正常人黑素细胞,观察其对黑素细胞生命期的影响,并就其意义进行了初步探讨.     

人类乳头瘤病毒16全基因在体外培养的正常人角质形成细胞中的瞬时表达

目的 利用含有人类乳头瘤病毒(HPV)16全基因的质粒转染正常人角质形成细胞,观察HPV16 mRNA在转染细胞的表达。方法 用FuGENE^TM6转染试剂,将携带HPV16全基因的质粒pSV2-neo/16转染体外培养的正常人角质形成细胞,在转染后24h提取细胞总RNA和DNA,进行RT-PCR和Southern印迹分析。结果 24h后,RT-PCR成功地扩增出110bp的片段,转染细胞中已出现HPV16 mRNA的表达,Southern印迹证实转染细胞中含有HPV16全基因7.9kb。结论 pSV2-neo/16转染正常人表皮角质形成细胞,24h内即可检测到HPV16mRNA表达。     

人类乳头瘤病毒16全基因在体外培养的正常人角质形成细胞 …

目的 利用含有人类乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６全基因的质粒转染正常人角质形成细胞,观察ＨＰＶ１６ｍＲＮＡ在转染细胞的表达。方法 用ＦｕＧＥＮＥ＾ＴＭ６转染试剂,将携带ＨＰＶ１６全基因的质粒ｐＳＶ２－ｎｅｏ／１６转染体外培养的正常人角质形成细胞,在转染后２４ｈ提取细胞总ＲＮＡ和ＤＮＡ,进行ＲＴ－ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹分析,结果 ２４ｈ后,ＲＴ－ＰＣＲ成功地扩增出１１０ｂｐ的片段,转染细胞中已出现Ｈ     

培养角质形成细胞构成性表达热休克蛋白72

目的 了解热休克蛋白７２（ＨＳＰ７２）在培养角质形成细胞中的表达情况。方法 无血清培养基培养原代角质形成细胞,免疫组织化学（ＳＡＢＣ）及核酸原位杂交技术检测ＨＳＰ７２的表达。结果 角质形成细胞的细胞中常见阳性染色,少数大细胞中ＨＳＰ７２表达增强,集中在细胞核周围。结论：普通条件培养的皮肤角质形成细胞即可构成性表达ＨＳＰ７２,可能对维持角质形成细胞的正常功能和活性方面个有重要作用。     

Expression of Heat Shock Protein 70 in Human Skin Cells as a Photoprotective Function after UV Exposure

BackgroundHuman skin is exposed to various environmental stresses, such as heat, cold, and ultraviolet (UV) radiation. Heat shock proteins (HSPs) induced by temperature elevations, as a physiologic response to mediate repair mechanisms and reduce cellular damage.ObjectiveThe purpose of this study was to investigate the induction of HSPs in human skin cells after UV exposure.MethodsWe performed immunoblotting using a specific monoclonal antibody to the HSP70 family, one of the best-conserved stress proteins in humans, with cultured normal human keratinocytes, A431 cells, human melanocytes, SK30 cells, and human dermal fibroblasts (HDF).ResultsOur results indicated that high expression of HSP70 in the unstressed state was noted in epidermal cells, including normal human keratinocytes, A431 cells, human melanocytes, and SK30 cells, but epidermal cells showed no additional up-regulation of HSP70 after UV irradiation. On the other hand, HDF expressed very small amounts of HSP70 at baseline, but significantly higher amounts of HSP70 after UV exposure.ConclusionThese findings suggest that constitutive expression of HSP70 in epidermal cells may be an important mechanism for protection of the human epidermis from environmental stresses, such as sunlight exposure.     

热休克蛋白70在过敏性紫癜中的表达及其临床意义

目的探讨热休克蛋白70表达在过敏性紫癜发病机制中的作用及其与临床的关联。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测了66例过敏性紫癜患者和30例正常对照组外周血单一核细胞中热休克蛋白70表达,采用免疫速率散射比浊法检测患者血沉、C反应蛋白和血清IgA。结果过敏性紫癜患者治疗前热休克蛋白70的表达明显高于治疗后和对照组,其在肾型表达明显高于其他类型,治疗后其表达与对照组无明显差异,治疗前热休克蛋白70表达与血沉、C反应蛋白、血清IgA明显正相关,其表达和上呼吸道感染、腹痛、关节痛、蛋白尿、血尿明显相关。结论热休克蛋白70表达在过敏性紫癜活动期明显升高,恢复期则明显下降,且与临床表现密切相关,提示其在该病发生发展中具有一定的作用,可作为疾病活动的指标之一。     

人乳头瘤病毒11型E6的原核表达

目的　构建、克隆人乳头瘤病毒 11型 (HPV11)E6蛋白基因 ,并进行表达、纯化和鉴定。方法　用PCR法 ,从尖锐湿疣 (CA)标本中扩增出HPV 11型E6蛋白基因 ,与 pET3 2a载体连接成重组表达质粒pET3 2a/E6;重组质粒转入BL2 1大肠杆菌 ,经诱导表达硫氧还蛋白E6融合蛋白 (Trx E6) ;该蛋白经 3SNTAResin纯化柱纯化 ,SDS PAGE和WesternBlotting检测鉴定。 结果　经酶切及序列分析鉴定 ,重组质粒 pET3 2a/E6成功构建 ,诱导后高表达Trx E6融合蛋白 ,WesternBlotting鉴定证实表达蛋白分子量为 3 60 0 0D的Trx E6融合蛋白。结论　获得高表达、高纯度的HPV11E6蛋白 ,为该蛋白的功能及免疫学分析及CA的疫苗研究打下了基础。     

表达人乳头瘤病毒6b和11型E6/E7基因的小鼠肿瘤细胞株的建立

目的 构建含有人乳头瘤病毒(HPV)6b和11型E6/E7基因的表达质粒和建立这些基因的转染细胞株。方法 分别将HPV6bE6、HPV6bE7、HPV11E6和HPV11E7克隆于含绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA3.1,经脂质体介导转染B16细胞,以G418筛选阳性克隆,荧光显微镜观察,RT-PCR鉴定mRNA转录。结果 通过酶切鉴定和基因测序证实,构建质粒中目的基因片段序列完全正确。转染后荧光显微镜下可观测到B16细胞发出绿色荧光。以G418筛选的抗性细胞克隆提取RNA并经RT-PCR扩增出与目的基因大小一致的基因片段。结论 建立的小鼠肿瘤细胞B16表达HPV6bE6、HPV6bE7、HPV11E6和HPV11E7基因。提示转染的细胞株可移植于小鼠,利于体内研究这些基因的生物学作用和免疫学机制。     

Induction of the 72-kD Heat Shock Protein in Human Skin Melanoma and Squamous Cell Carcinoma Cell Lines

Heat shock proteins (HSPs) or stress proteins comprise a characteristic group of proteins synthesized in cells exposed to heat or other environmental stimuli. Of the many HSPs, the 72-kD heat shock protein (HSP72) is the most stress-inducible one. In the present study, we examined the effects of heat, chemicals (azetidine and sodium arsenite), ultraviolet (UV) light, and γ-ray irradiation on the induction of HSP72 in cultured human skin melanoma cell lines (P-39 and G-361), a human skin squamous cell carcinoma cell line (HSC-1), and an SV40-transformed human lung fibroblast cell line (WI38VA13) as a control. In these cell lines, heat treatment induced HSP72 more rapidly and intensely than did chemical exposure. Compared with the SCC cell line, the two melanoma cell lines produced less HSP72 with heat treatment. UVC irradiation (20 J/m²) induced HSP72 only in the WI38VA13 cells. After γ-ray irradiation, no HSP72 induction was detected in any of the cell lines examined. These observations suggest that, in cultured cells, inducibility of HSP72 depends not only on the inducer but also on the origin of each cell line.     

北京地区人乳头瘤病毒16E6E7基因变异和序列分析

目的 了解北京地区人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7结构特点，为研制HPV16疫苗奠定基础。方法 从HPV感染组织中提取DNA，PCR鉴别其型别，从单独HPV16感染的标本中分离HPV16 E6E7基因，克隆入载体pGEM-3ZF，进行双向测序，与德同标准株进行比较。结果 构建了北京地区HPV16E6E7的重组质粒。测序结果表明该基因全长为776bp，与已发表的德同标准株长度相等，3处核苷酸发生变异，同源性99．7％。分别位于第60、96和565nt(相当于HPV16全长序列中第142、178和647nt)，2处位于F6区，1处位于E7，其对应氨基酸分别为第20、32和188个氨基酸，分别由Pro(CCA)、Asp(GAT)和Asn(AAT）变异为Pro(CCG)、Glu(GAG)和Ser(AGT)。结论 北京地区HPV16E6E7基因结构与德国标准株存在差异。     

发夹状RNA对人乳头瘤病毒16型E6表达的影响

目的 研究发夹状RNA对人乳头瘤病毒(HPV)E6基因表达的影响。方法 构建发夹状RNA、正义RNA及反义RNA表达质粒,重组体转入人宫颈癌细胞株CaSKi,应用RT-PCR及蛋白印迹法检测其对CaSKi细胞E6mRNA及蛋白表达的影响。结果 发夹状RNA表达质粒的导入明显下调了E6mRNA及蛋白表达,发现含有发夹状RNA的HPV-E6mRNA表达水平相当于空白对照组的14.6%,蛋白表达水平相当于空白对照组的23.3%,此效果优于传统的反义RNA。结论 利用发夹状RNA的干扰技术可有效抑制靶基因的表达。