miR-23c靶向调控MTDH抑制胶质瘤U87细胞增殖迁移与侵袭

目的探讨miR-23c对胶质瘤细胞U87增殖、迁移和侵袭的影响及初步机制。方法将miR-23c mimics转染于U87细胞中,用miR-无关序列转染于U87细胞做为Control组,采用MTT法、细胞划痕、Transwell侵袭实验观察miR-23 c对U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响;采用生物信息学软件分析miR-23c潜在的靶基因;采用Western blot、RT-PCR和萤光素酶报告基因检测miR-23c对靶基因的调控作用;在转染miR-23c mimics的基础上同时转染MTDH质粒,通过MTT法、细胞划痕、transwell侵袭实验观察转染MTDH对miR-23c抑制U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果 MTT实验显示,miR-23 c组U87细胞的OD值为(0. 668±0. 032),明显低于Control组的(1. 031±0. 060)(P 0. 01);细胞划痕实验显示,miR-23c组细胞划痕愈合率(0. 35±0. 02)明显低于对照组的(0. 59±0. 03)(P 0. 01); Transwell侵袭实验显示,miR-23 c组U87细胞穿过基质胶的细胞数(153. 2±8. 30)明显低于与对照组的(348. 4±12. 12)(P 0. 01); Western blot、RT-PCR和萤光素酶报告基因检测表明MTDH是miR-23 c直接调控的靶基因; MTT实验显示,miR-23 c+MTDH组U87细胞的OD值为(1. 025±0. 059),明显高于miR-23 c组的(0. 672±0. 024)(P 0. 01);细胞划痕实验显示,miR-23 c+MTDH组细胞划痕愈合率为(0. 45±0. 04),明显高于miR-23 c组的(0. 31±0. 03)(P 0. 05); Transwell侵袭实验显示,miR-23c+MTDH组U87细胞穿过基质胶的细胞数(260. 9±10. 23),明显高于miR-23c组的(148. 4±9. 4)(P 0. 01)。结论上调miR-23 c能明显抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,其机制可能与其下调MTDH表达有关。     

miR-92b对神经胶质瘤细胞U251增殖及迁移侵袭的 影响

目的 探究miR-92b对神经胶质瘤细胞U251增殖及迁移侵袭的影响以及其可能机制.方法 利用miRNA芯片筛选出在神经胶质瘤细胞U251和人脑正常胶质细胞HEB中差异表达的miRNA;化学合成法制备miR-92b抑制剂,转染后用real-time PCR技术验证表达变化;CCK-8实验检测转染后细胞的增殖能力;划痕实验和Transewll实验检测转染后细胞的迁移和侵袭能力;Western blot检测细胞中胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)、β-catenin和E-cadherin的表达;荧光酶素实验验证IGFBP-3是否为miR-92b的靶基因.结果 基因芯片结果显示miR-92b在神经胶质瘤细胞中表达水平高于人脑正常胶质细胞(P<0.05);CCK-8实验结果显示转染miR-92b抑制剂后,U251细胞增殖能力降低(P<0.05);划痕实验和Transwell实验结果显示转染miR-92b抑制剂后,U251细胞迁移和侵袭能力降低(P<0.05);Western blot结果显示抑制miR-92b后,IGFBP-3和E-cadherin蛋白表达增加(P<0.05),β-catenin表达减少(P<0.05);荧光素酶实验结果显示,miR-92b能直接靶向调控IGFBP-3.结论 miR-92b在神经胶质瘤中表达显著增加,其可能通过抑制IGFBP-3蛋白表达,从而促进肿瘤细胞的增殖及迁移侵袭.     

miR-23c靶向调控MTDH抑制胶质瘤U87细胞增殖迁移与侵袭

目的 探讨miR-23c对胶质瘤细胞U87增殖、迁移和侵袭的影响及初步机制。方法 将miR-23c mimics转染于U87细胞中,用miR-无关序列转染于U87细胞做为Control组,采用MTT法、细胞划痕、Transwell侵袭实验观察miR-23c对U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响;采用生物信息学软件分析miR-23c潜在的靶基因;采用Western blot、RT-PCR和萤光素酶报告基因检测miR-23c对靶基因的调控作用;在转染miR-23c mimics的基础上同时转染MTDH质粒,通过MTT法、细胞划痕、transwell侵袭实验观察转染MTDH对miR-23c抑制U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果 MTT实验显示,miR-23c组U87细胞的OD值为（0.668±0.032）,明显低于Control组的（1.031±0.060）（P<0.01）;细胞划痕实验显示,miR-23c组细胞划痕愈合率（0.35±0.02）明显低于对照组的（0.59±0.03）（P<0.01）;Transwell侵袭实验显示,miR-23c组U87细胞穿过基质胶的细胞数（153.2±8.30）明显低于与对照组的（348.4±12.12）（P<0.01）;Western blot、RT-PCR和萤光素酶报告基因检测表明MTDH是miR-23c直接调控的靶基因;MTT实验显示,miR-23c+MTDH组U87细胞的OD值为（1.025±0.059）,明显高于miR-23c组的（0.672±0.024）（P<0.01）;细胞划痕实验显示,miR-23c+MTDH组细胞划痕愈合率为（0.45±0.04）,明显高于miR-23c组的（0.31±0.03）（P<0.05）;Transwell侵袭实验显示,miR-23c+MTDH组U87细胞穿过基质胶的细胞数（260.9±10.23）,明显高于miR-23c组的（148.4±9.4）（P<0.01）。结论 上调miR-23c能明显抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,其机制可能与其下调MTDH表达有关。     

microRNA-613调控CDK14来抑制老年胶质瘤患者瘤细胞的增殖和侵袭作用

目的 探讨microRNA-613调控细胞周期蛋白依赖性激酶14(CDK14)通路来抑制老年胶质瘤患者瘤细胞增殖和侵袭的机制。方法 购自上海北诺生物科技有限公司的人脑胶质瘤细胞株U251共24株,分为shNC组、shmicroRNA-613组、Vector组、microRNA-613组,每组各6株; Western Blotting法和qRT-PCR法检测敲减microRNA-613和过表达microRNA-613后的人脑胶质瘤细胞株U251中CDK14蛋白表达水平,CCK-8细胞增殖实验、Transwell小室实验验证敲除microRNA-613和过表达microRNA-613后U251细胞的增殖、侵袭能力。结果 人胶质瘤细胞株U251敲减microRNA-613后CDK14蛋白表达增加(P<0.05); 人胶质瘤细胞株U251过表达microRNA-613后CDK14蛋白表达减少(P<0.05); 转染第24、36、48 h microRNA-613组U251细胞增殖率P<0.05); microRNA-613组U251细胞侵袭能力>Vector组,shNC组>shmicroRNA-613组(P<0.05)。结论 microRNA-613可通过调控CDK14信号转导通路来抑制人脑胶质瘤细胞U251增殖、转移。     

miR-106a抑制胶质瘤细胞增殖并诱导凋亡

目的胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,具有较高的病死率。现有的研究表明miR-106a在多种肿瘤中表达上调,并发挥着致癌性作用,但miR-106a在胶质瘤中的表达和作用却并不清楚。方法不同级别胶质瘤组织和胶质瘤细胞系(T98G,SHG44,U87,U251,U373)内的miR-106a水平通过实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定。转染miRNA寡聚核苷酸后的U87和U251细胞的增殖能力和细胞周期分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法和流式细胞仪测定,并且通过膜联蛋白/碘化丙啶(annexin V/PI)双染法测定了miR-106a对胶质瘤细胞的凋亡影响。结果miR-106a在胶质瘤组织和胶质瘤细胞系内表达水平相对正常脑组织显著下降,并且miR-106a表达水平与胶质瘤病理级别负相关。胶质瘤细胞转染miR-106a后,可检测到过表达的miR-106a可显著抑制胶质瘤细胞的增殖能力,阻滞细胞周期于G0/G1期,同时诱导胶质瘤细胞凋亡增加。结论 miR-106a可阻滞胶质瘤细胞细胞周期、抑制增殖和诱导凋亡。     

锌指蛋白403对人U251胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的研究锌指蛋白403(gametogenetin-binding protein 2,GGNBP2)表达水平对人胶质瘤细胞增殖,侵袭,迁移能力的影响。方法培养人U251胶质瘤细胞,慢病毒转染构建稳定过表达GGNBP2的U251胶质瘤细胞后,q RT-PCR及Western Blot检测转染效率;CCK8检测细胞细胞增殖能力;Transwell小室法检U251胶质瘤细胞侵袭和迁移能力变化;Western Blot检测AKT,p-AKT,PCNA,MMP9表达水平的改变。结果成功构建稳定过表达GGNBP2的人U251胶质瘤细胞株,与对照组和空载组比较,过表达组细胞增殖(P0.05),侵袭力(57±6 vs.203±6,205±7,F=512.4,P0.05),迁移力(74±7 vs.254±14,248±13,F=242.5,P0.05)明显抑制;Western Blot结果显示,与对照组和空载组比较,过表达组p-AKT(F=45.4,P0.05),PCNA(F=348.5,P0.05),MMP9(F=88.7,P0.05)表达水平明显降低。结论 GGNBP2可能通过抑制AKT的磷酸化水平,并经过相应的信号通路下调PCNA,MMP9表达水平,从而抑制胶质瘤细胞增殖,侵袭和迁移,提示GGNBP2可能成为胶质瘤治疗的潜在靶点。     

CD81, a cell cycle regulator, is a novel target for histone deacetylase inhibition in glioma cells

Recent advances in cancer cell biology have focused on histone deacetylase inhibitors (HDACi's) because they target pathways critical to the development and progression of disease. In particular, HDACi's can induce expression of epigenetically silenced genes that promote growth arrest, differentiation and cell death. In glioma cells, one such repressed gene is the tetraspanin CD81, which regulates cytostasis in various cell lines and in astrocytes, the major cellular component of gliomas. Our studies show that HDACi's, trichostatin and sodium butyrate, promote growth arrest and differentiation with negligible cell death in glioma cells and induce expression of CD81 and cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21(CIP/WAF-1)), another regulator of cytostasis in astrocytes. Interference RNA knock-down of CD81 abrogates cytostasis promoted by HDAC inhibition indicating that HDACi-induced CD81 is responsible for growth arrest. Induction of CD81 expression through HDAC inhibition is a novel strategy to promote growth arrest in glioma cells.     

The internal time-giver role of melatonin. A key for our health

Daily rhythms in physiological and behavioural processes are controlled by a network of circadian clocks. In mammals, at the top of the network is a master clock located in the suprachiasmatic nuclei (SCN) of the hypothalamus. The nocturnal synthesis and release of melatonin by the pineal gland are tightly controlled by the SCN clock. Several roles of melatonin in the circadian system have been identified. As a major hormonal output, melatonin distributes temporal cues generated by the SCN to the multitude of tissues expressing melatonin receptors. In some target tissues, these melatonin signals can drive daily rhythmicity that would otherwise be lacking. In other target structures, melatonin signals are used for the synchronization (i.e., adjustment of the timing of existing oscillations) of peripheral oscillators. Due to the expression of melatonin receptors in the SCN, endogenous melatonin is also able to feedback onto the master clock. Of note, pharmacological treatment with exogenous melatonin can synchronize the SCN clock. From a clinical point of view, provided that the subject is not exposed to light at night, the daily profile of circulating melatonin provides a reliable estimate of the timing of the human SCN. During the past decade, a number of melatonin agonists have been developed. These drugs may target the SCN for improving circadian timing or act indirectly at some downstream level of the circadian network to restore proper internal synchronization.     

敲低WTAP表达抑制脑胶质瘤干细胞的增殖、迁移和侵袭

目的 探讨敲低Wilms肿瘤抑制因子（WTAP）表达对脑胶质瘤干细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及机制。方法 从手术切除胶质瘤标本中提取胶质瘤干细胞（GSC）,应用lipofectamine2000转染WTAP shRNA质粒敲低WTAP表达,以shRNA为阴性对照;PCR检测WTAP mRNA水平分析敲低效率;MTT法检测细胞增殖能力,Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力,免疫印迹法检测细胞AKT磷酸化水平。结果 从胶质瘤标本中成功提取GSC,其SOX2表达显著降低（P<0.001）,而α-SMA和PDGFRb的表达上调（P<0.001）。与阴性对照组相比,WTAP敲低组GSC细胞WTAP mRNA水平明显降低（P<0.05）,细胞增殖、迁移和侵袭能力均显著下降（P<0.05）,细胞AKT的磷酸化水平显著降低（P<0.05）。结论 敲低WTAP表达可抑制GSC的增殖、迁移和侵袭能力,其机制可能与抑制AKT磷酸化有关。     

褪黑素通过下调SLC7A11表达来诱导胶质瘤细胞SH-SYSY铁死亡的机制研究

目的 探讨褪黑素(Melatonin, MT)通过下调溶质载体家族7成员11(Solute carrier family 7member 11,SLC7A11)表达对胶质瘤细胞(Glioma cell, SH-SYSY)铁死亡的影响。方法 使用不同水平的MT处理人胶质瘤SH-SY5Y细胞,采用细胞计数试剂盒-8(Cell counting kit-8,CCK-8)法检测细胞活性,进而选择合适的MT水平;实验分组为二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)组(加入常规培养基)、MT组(加入1 mmol/L的MT)、凋亡抑制剂氟甲基酮(Z-VAD-FMK)+MT组(加入1 mmol/L的MT和20μmol/L的凋亡抑制剂Z-VAD-FMK)、坏死性凋亡抑制剂Necrosulfonamide(Nec-1)+MT组(加入1 mmol/L的MT和1μmol/L的坏死性凋亡抑制剂Nec-1)、自噬抑制剂Chloroquine+MT组(加入1 mmol/L的MT和5 mmol/L的自噬抑制剂Chloroquine)、特异性铁死亡抑制剂Deferoxamine(DFO)对照组(加入...     

肉桂醛对神经胶质瘤U251细胞生物学行为的影响

目的 探讨肉桂醛对胶质瘤细胞生物学行为的影响及其分子机制。方法 体外培养胶质瘤细胞系U251细胞,分为对照组、低剂量肉桂醛组（40μmol/L）和高剂量肉桂醛组（80μmol/L）。采用平板克隆和CCK-8试验检测细胞增殖水平;流式细胞术分析细胞凋亡率;Transwell小室实验和细胞划痕试验评估细胞迁移和侵袭水平;免疫印迹法分析凋亡相关蛋白、PI3K/Akt和Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达。结果 肉桂醛明显抑制胶质瘤U251细胞增殖、侵袭、迁移能力（P<0.05）,促进细胞凋亡（P<0.05）;抑制Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、cycling D、C-Myc、β-catenin表达（P<0.05）,促进Cleaved-Caspase-3、Bax表达（P<0.05）;而且,随剂量增大,肉桂醛的作用明显增强（P<0.05）。结论 肉桂醛抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移,促进细胞凋亡,其机制可能与下调PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信号通路有关。     

Syndecan-1基因沉默抑制胶质瘤A172细胞增殖和侵袭

目的探讨多配体蛋白多糖-1(Syndecan-1,SDC1)在不同胶质瘤细胞株中的表达水平及其沉默对A172细胞的增殖和侵袭的影响。方法通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和Western Blotting分析SDC1在不同胶质瘤细胞株中的表达水平;将携带SDC1 sh RNA的慢病毒载体感染A172细胞,稳定沉默的细胞株为干扰组,未转染为阴性对照组,转染scramble序列为空白对照组;采用MTT法、台盼蓝拒然法和流式细胞术检测细胞增殖能力,Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭力;q RT-PCR和Western Blotting检测相关蛋白变化。结果SDC1在不同的胶质瘤细胞株中表达强度不同,差异具有统计学意义(P0.05)。成功构建稳定沉默SDC1的A172细胞株;与阴性对照组和空白对照组相比,干扰组细胞增殖受到抑制(P0.05),迁移力(58.40±5.24 vs.255.8±16.09、226.5±22.84,F=126.4,P0.05)和侵袭力(61.67±16.26 vs.233.70±17.24、244.30±28.15,F=69.87,P0.05)明显抑制;SDC1、PCNA和MMP-9 m RNA和蛋白表达水平明显降低(P0.05)。结论沉默SDC1基因的表达可抑制胶质瘤A172细胞的增殖、迁移和侵袭,提示SDC1可能成为胶质瘤生物治疗的新靶点。     

DLC1基因在人脑胶质瘤组织中的表达

目的 探讨抑癌基因DLC1在人脑胶质瘤组织中的表达和功能.方法 收集广州医学院第二附属医院神经外科自2007年1月至2009年6月手术切除的胶质瘤标本39例及同期行颅脑减压术治疗的颅脑损伤患者的正常脑组织10例,实时荧光定量PCR检测DLC1 mRNA的表达;将质粒pCS2-DLC1转染体外常规培养的人胶质瘤细胞株U251,同时用空载体pCS2-MT转染作为对照组,转染后36 h应用Western blot检测DLC1表达标签蛋白Mvc,应用MTT检测U251细胞增殖能力的变化.结果实时荧光定量PCR结果显示胶质瘤组织中DLC1 mRNA表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P=0.000),且Ⅰ级胶质瘤组织DLC1 mRNA的表达水平高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级,差异有统计学意义(平均秩次分别为44.20、30.23、32.25、31.0,H=18.818,P=0.001);Western blot检测结果显示DLC1标签蛋白Mvc在pCS2-DLCI转染组细胞呈过表达,在pCS2-MT转染组细胞无明显表达;MTT检测显示pCS2-DLC1转染组U251细胞吸光度值高于pCS2-MT转染组,差异有统计学意义(P=0.002).结论 高表达的DLC1可能促进胶质瘤的形成和发展.     

Chemokine production and chemokine receptor expression by human glioma cells: role of CXCL10 in tumour cell proliferation

The expression of chemokine receptors and chemokine production by adult human non-transformed astrocytes, grade III astrocytoma and grade IV glioblastoma tumour cell lines were determined. Here, we show an increased expression of CXCR3 and CXCR4, and a decreased expression of CXCR1 and CCR4 by glioma cells compared to adult human astrocytes. Glioma cells showed increased production of CXCL10, whereas production of other chemokines was decreased (CXCL8, CCL2, CCL5, and CCL22). CXCL10 induced an ERK1/2-dependent increase in [(3)H] thymidine uptake. These results suggest that expression of chemokine receptor/ligand pairs such as CXCR3/CXCL10 have an important role in the proliferation of glioma cells.     

siRNA靶向沉默组织蛋白酶D对胶质瘤细胞生物学行为的影响

目的 探讨小分子干扰RNA(siRNA)靶向沉默胶质瘤细胞系U87中组织蛋白酶D(CD)对胶质瘤细胞生物学行为的影响. 方法 采用脂质体介导的CD siRNA、scramble siRNA、空白对照siRNA转染体外常规培养的胶质瘤细胞株U87,RT-PCR、Western blotting分别检测转染后U87细胞CD mRNA和蛋白的表达;MTT法检测转染CD siRNA、scramble siRNA 1～5 d后U87细胞的增殖;细胞侵袭实验检测转染CD siRNA、scramble siRNA 48 h后细胞侵袭能力的变化. 结果 转染48 h后CD siRNA组细胞CD mRNA、蛋白的表达明显低于转染scramble siRNA和空白对照siRNA组,差异有统计学意义(P＜0.05);转染后2、3、4、5d转染CD siRNA组U87细胞吸光度(A)值低于转染scramble siRNA组,差异有统计学意义(P＜0.05);细胞侵袭实验结果表明转染CDsiRNA组滤膜细胞数低于转染scramble siRNA组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 CD可能是具有广泛应用前景的胶质瘤分子生物治疗的靶点.     

RNAi下调PIK3 CB表达抑制U251胶质瘤细胞生长的体内外研究

目的 探讨应用RNAi技术靶向磷酸肌醇酯-3-激酶β催化亚单位(PIK3CB)抑制恶性胶质瘤细胞系U251的PIK3CB表达后在体内外对U251细胞生长抑制作用.方法 将短发夹RNA(shRNA)表达载体psiRNA-PIK3CB进行脂质体介导的U251人脑恶性胶质瘤细胞系表达,检测细胞转染前后的细胞增殖能力和凋亡的变化.应用裸鼠皮下荷瘤模型观察脂质体介导shRNA基因治疗对U251细胞生长抑制作用,对肿瘤组织应用免疫荧光双染色和免疫组化的方法分析结果.结果 靶向PIK3CB的shRNA转染后U251细胞生长受到抑制,细胞周期出现G2/M阻滞,细胞明显凋亡.裸鼠皮下荷瘤模型实验显示psiRNA-PIK3CB显著抑制皮下肿瘤生长(P＜0.01).结论 靶向PIK3CB的shRNA基因治疗可以成为胶质瘤治疗的新策略.     

细胞因子在脑胶质瘤中的作用

细胞因子在癌症的发生、发展和治疗中扮演着重要角色。癌症患者的免疫系统无法识别恶性肿瘤细胞、无法产生有效应答可能与其异常的细胞因子表达有关。胶质瘤的微环境存在异质性,肿瘤细胞、正常脑细胞、免疫细胞和干细胞通过复杂的细胞因子网络相互作用。现对目前在胶质瘤中已知的重要细胞因子的功能进行综述,并展望这些细胞因子的潜在治疗价值。     

内抑制素对人脑胶质瘤细胞增殖的实验研究

目的观察内抑制素对人脑胶质瘤细胞增殖的影响。方法①细胞培养：体外培养人脑胶质瘤细胞并进行光镜观察;②抑制因子试验：设立对照组与内抑制素实验组,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法来判定该抑制因子对人脑胶质瘤细胞有无抑制作用;③细胞内游离Ca2＋浓度测定：将特异性ca2＋荧光指示剂-Fluo-3用来负载人脑胶质瘤细胞,应用激光共聚焦显微镜检测细胞内游离钙的浓度。结果对照组光密度（OD）值明显高于各实验组（P〈0．05）;内抑制素能明显增加细胞内游离Ca2＋的浓度,并且随药物浓度的增加而增加。结论内抑制素能够抑制人脑胶质瘤细胞的增殖且呈剂量依赖性,同时也能够增加胶质瘤细胞内游离ca2＋的浓度。     

血管生成因子2在胶质瘤模型中的表达与shRNAs靶向治疗

目的 检验血管生成因子2(angiopoietin-2,Ang-2)在胶质瘤模型中的表达,应用RNA干扰技术靶向Ang-2,观察胶质瘤治疗效果.方法 建立荷瘤小鼠颅内U87胶质瘤模型,检测Ang-2和PCNA的表达;转染shRNAs表达质粒进入U87细胞,比较受试动物生存期,MRI观察肿瘤体积;脑组织行HE染色及免疫组化检测.结果 颅内模型中Ang-2在胶质瘤边缘的表达强于肿瘤内部(P<0.05),围绕于新生血管周围;靶向Ang-2的shRNAs基因治疗可延长受试动物生存期,降低新牟血管数量,但PCNA表达无统计学意义(P>0.05).结论 Ang-2主要表达于胶质瘤侵袭边缘,与肿瘤新生血管形成密切相关;靶向Ang-2的shRNAs技术可有效降低胶质瘤的侵袭能力.