Doks PTB结构域与EGFR特异性结合

目的:探讨Doks家族的PTB结构域在识别上游分子时的特异性.方法:利用裂解大量内源性表达表皮生长因子受体(EGFR)的COS-7传代细胞株获取EGFR,利用大肠杆菌表达GST融合蛋白GST1PTB、GST4PTB和GST5PTB,采用GST共沉淀技术检测Dok1、4和5的PTB结构域能否与EGFR结合.结果:Dok1的PTB结构域,而非Dok4和Dok5的PTB结构域,能够特异性地与被激活的EGFR结合,不能与未激活的EGFR结合.结论:Doks家族的PTB结构域功能有差别,即PTB结构域在识别上游分子时具有特异性.     

Dok4和Dok5 PTB结构域融合蛋白的表达和纯化

目的 :制备Dok4和Dok5PTB结构域的GST融合蛋白。方法 :用PCR方法分别扩增编码Dok4、Dok5PTB结构域的cDNA ,并将其克隆入表达载体pGEX 4T 3中 ,转化大肠杆菌BL 2 1,构建成表达GST PTB融合蛋白的菌株。经IPTG诱导表达后 ,经Glutathion Sepharose 4B亲和层析柱纯化 ,用SDS PAGE进行分析 ,该融合蛋白的表达量超过菌体总蛋白的 2 5 %。结果 :获得重组的GST 4PTB和GST 5PTB融合蛋白 ,纯度在 95 %以上 ,产物得率约 75 %。结论 :成功制备高纯度Dok4和Dok5PTB结构域的GST融合蛋白 ,为进一步研究磷酸化酪氨酸结合结构域 (PTB)的结构和生物学功能奠定基础     

Dok1与表皮生长因子受体之间相互作用的酵母双杂交研究

目的:研究downstream of kinases(dok1)与表皮生长因子受体(EGFR)之间的相互作用,寻找EGFR的可能底物或调控蛋白,以深入认识EGFR下游信号转导机制.方法: 将EGFR胞内域与LexA蛋白融合作为DNA结合蛋白,分别将dok1、dok1PTB及dok1ΔPTB与B42AD蛋白融合作为激活域蛋白,共转化酵母菌后,通过β-半乳糖苷酶活性检测、生长实验以及免疫共沉淀实验分析它们之间的相互作用.结果: dok1及dok1PTB与EGFR之间在酵母中存在结合,而dok1ΔPTB不与EGFR结合. 结论: 首次证实EGFR与dok1之间具有相互作用,dok1的PTB结构域在介导此相互作用的过程中非常重要.     

Dok6促进神经营养因子3诱导的过表达原肌球蛋白相关激酶C的PC12细胞突起生长

目的 探讨胞浆接头蛋白Dok6对PC12细胞突起生长的影响.方法 将Dok6的不同功能模体片段构建至TrkC/Y516F突变体中形成融合克隆.利用Western blot法验证各个融合克隆在细胞内是否稳定表达.利用瞬时转染的方法将融合克隆导入PC12细胞进行过表达,之后用NT-3刺激PC12细胞突起生长,检测不同Dok6片段的效应.结果 各个融合克隆均能在细胞内稳定表达.融合了Dok6 PTB结构域+C末端以及单纯C末端的融合克隆均可以挽救由于TrkC受体516位酪氨酸突变导致的PC12细胞突起生长减少,而融合单纯的Dok6 PTB结构域则无此效应.结论 Dok6可以促进NT-3诱导的过表达TrkC的PC12细胞突起生长,并且此效应与其C末端密切相关.     

层黏连蛋白α4链中αvβ3整合素结合肽的精细鉴定与功能分析

目的 利用点突变、缺失突变及功能实验确定αvβ3整合素在已鉴定人层黏连蛋白α4链(human laminin alpha4,LNα4)G19肽段中的最小结合位点及关键氨基酸残基.方法 采用同源序列比较确定G19肽中的保守氨基酸残基,点突变确定其中的关键氨基酸残基,缺失突变确定αvβ3整合素结合的最小肽段,并通过人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)管样结构形成实验及鸡胚尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)实验验证鉴定肽的生物学功能.结果 同源性比较分析发现,G19肽中共存在10个保守性氨基酸残基位点.点突变分析发现第4位的I、第10位的H及第16位的Y是αvβ3整合素结合的关键位点,缺失突变分析确定G1124-1137肽段(G14肽)是αvβ3整合素结合的最小肽段, 合成的G14肽可以浓度依赖性地促进HUVEC管样结构的形成及CAM的血管生成.结论 成功鉴定了αvβ3整合素在LNα4中的最小结合位点及关键氨基酸残基.所鉴定的肽段具有促HUVEC成管样结构及促CAM血管生成的生物学功能.     

SNT1与RET之间相互作用的酵母双杂交研究

目的:研究sucl-binding neurotrophic target(SNT1)与RET之间的相互作用,寻找RET受体下游的结合蛋白,以深入认识RET下游信号转导机制.方法:将RET胞内域与LexA蛋白融合作为DNA结合蛋白,分别将SNT1、SNT1PTB及SNT1△PTB与B42AD蛋白融合作为激活域蛋白,共转化酵母菌后,通过β-半乳糖苷酶活性检测以及氨基酸营养缺陷生长实验分析它们之间的相互作用.结果:SNT1及SNT1PTB与RET之间在酵母中存在结合,而SNT1△PTB不与RET结合.结论:证实RET与SNT1之间具有相互作用,SNT1的PTB结构域在介导此相互作用的过程中非常重要.     

Dok1与TrkA之间相互作用的酵母双杂交研究

目的:研究downstream of kinases1(dok1)与TrkA之间的相互作用,寻找TrkA的可能底物或调控蛋白,以深入认识TrkA下游信号转导机制.方法:将TrkA胞内域与LexA蛋白融合作为DNA结合蛋白,分别将dok1、dok1PTB及dok1ΔPTB与B42AD蛋白融合作为激活域蛋白,共转化酵母菌后,通过β-半乳糖苷酶活性检测以及氨基酸营养缺陷生长实验分析它们之间的相互作用.结果:dok1及dok1PTB与TrkA之间在酵母中存在结合,而dok1ΔPTB不与TrkA结合.结论:证实TrkA与dok1之间具有相互作用,dok1的PTB结构域在介导此相互作用的过程中非常重要.     

EGFR靶向药物在恶性肿瘤中的应用

表皮生长因子受体(epidermal growth factor re-ceptor,EGFR)存在于所有正常上皮和部分间叶来源的细胞,EGFR及EGFR家族的过表达或点突变与乳腺癌,胃肠道肿瘤,卵巢癌,宫颈癌等上皮源性肿瘤密切相关。而且,EGFR失调与肿瘤许多特性有关,如肿瘤细胞的增殖、新生血管形成、侵袭、转移及抗凋亡等。因而研究EGFR及针对EGFR的靶向药物,成为近年来抗肿瘤治疗的主要热点。1EGFR结构、功能和信号传导1.1结构和功能EGFR属于受体型酪氨酸激酶家族的成员之一。该受体有四个成员,即erbB1/EGFR、erbB2/neu、erbB3、erbB4癌基因编码蛋白产物。它们结构相似,均由胞外配体结合区、跨膜区和胞内区3部分组成。未被激活时均以单体的形式存在,当与生长因子结合后,形成二聚体(同源或异源),二聚化后受体构象发生改变,使胞内区的酪氨酸激激酶被激活,胞内区数个酪氨酸残基位点发生自身磷酸化。磷酸化的酪氨酸残基成为带有SH2的信号蛋白分子的结合位点,进而激活Ras-Raf-MAPK、PI3K/AKT等多条信号传导途径。最终影响基因的表达,产生细胞增殖、分化等生物效应。1.2信号传导通路活...     

APPL1与胰岛素抵抗

Adaptor protein containing PH domain,PTB domain and leucine zipper motif 1(APPL1)是一种具有多个功能结构域的细胞内转接蛋白,包含PH结构域、PTB结构域以及亮氨酸拉链基序.研究发现,APPL1可与多个蛋白结合,参与细胞内多条信号转导通路,与前列腺癌、结肠癌、神经系统相关疾病以及排卵等过程有关.     

人N-甲基-D-门冬氨酸受体主亚基受体激活相关多肽的理化特性与抗原性分析

目的　分析人N 甲基 D 门冬氨酸受体 (NMDAR)主亚基NR1a上两个受体激活相关多肽P1、P2的抗原性及其理化特性。方法　用GOLDKEY软件从蛋白质数据库中调出人NR1a分子的氨基酸序列 ,分别在其第一、第三跨膜域前后逆向、顺向截取 15 1和 14 4个氨基酸长度的多肽片段P1与P2 ,选取Hopp&Woods与Kyte亲水性、Janin表面可及性、Karplus Schulz主链柔韧性及Welling抗原性等参数予以多参数分析 ,采用Prosite程序与Chou Fasman方法比较其氨基酸位点与二级结构特征 ,以此为基础综合判定P1与P2片段的抗原位点并与已有的实验结果相比较。结果　P1、P2多肽片段上可能分别有 6和 7个 8～ 15aa长序列具有良好的抗原性。P1相关序列主要分布于其氨基端 ,与配体结合关键氨基酸残基相距较远。P2上的相关序列分布较均匀 ,包含有受体激活重要相关位点或与配体结合关键氨基酸残基距离较近。P2片段的总体抗原性、亲水性与可及性均强于P1,尤以其近膜的 15个残基为著。P1、P2多肽片段均含有一定数量的 β 转角 ,但P1片段含有较多的半胱氨酸残基和无规卷曲 ,而P2片段则含有较多的芳香族残基并以α螺旋结构为主。结论　人NMDAR主亚基NR1a上的两个受体激活相关多肽P1、P2均具有一定数量的抗原位点 ,与P1相比较 ,P2可能更易成为NMDAR免     

p62Dok PTB结构域融合蛋白的表达和纯化

目的 :制备p6 2DokPTB结构域的GST融合蛋白。方法 :用PCR方法扩增编码p6 2DokPTB结构域的cD NA ,并将其克隆入表达载体pGEX 4T 3中 ,转化大肠杆菌BL 2 1,构建成表达GST PTB融合蛋白的菌株。经IPTG诱导表达后 ,经Glutathion Sepharose 4B亲和层析柱纯化 ,用SDS PAGE进行分析 ,该融合蛋白的表达量超过菌体总蛋白的 2 5 %。结果 :获得重组GST PTB融合蛋白 ,纯度在 95 %以上 ,产物得率约 75 %。结论 :成功制备高纯度p6 2DokPTB结构域的GST融合蛋白 ,为进一步研究p6 2DokPTB结构域的结构和生物学功能奠定了基础。     

信号分子Doks识别酪氨酸蛋白激酶型受体的分子与结构基础

The Dok proteins (downstream of tyrosine kinases) represent a family of adaptor proteins that play an important role in regulating signal transduction in cell growth, proliferation and differentiation. Five Dok proteins with distinct functions have been identified thus far .     

EGFR基因在肺腺癌中突变的研究

目的:探讨表皮生长因子受体(EGFR)基因酪氨酸激酶域体细胞在肺腺癌患者中突变的相关因素。方法:分析和检测64例肺腺癌石蜡包埋标本EGFR基因突变状况,采用PCR和序列分析技术进行EGFR基因18、19和21外显子突变分析。结果:64例PAC患者中有16例(25%)酪氨酸激酶域存在体细胞突变。其中2例(3.1%)为18外显子,7例(10.93%)为19外显子,7例(10.93%)为21外显子。结论:肺腺癌(PAC)患者肿瘤组织中EGFR基因突变主要集中于19、21外显子突变,女性高于男性。     

非小细胞肺癌中PTB对肿瘤抑制基因ceacam1选择性拼接的调控研究

目的：研究在非小细胞肺癌及癌旁组织中ceacam1通过选择性拼接而产生的两种转录产物的调控机制。方法：将用PCR方法获得ceacam1基因中从内含子5至外显子8长1606bpDNA片段插入到真核表达载体pCMV中,构建成ceacam1迷你基因模型并与ptb基因共转染,用PCR法鉴定转染后的产物变化;根据外显子7序列设计的探针GAE（16-nt）及ACE（8-nt）进行凝胶阻滞分析实验。分离与探针结合的蛋白并进行质谱分析。结果：ptb3种cDNA与ceacam1迷你基因共转染后,CEACAMIL表达水平下降,其中ptb4对迷你基因的表达产物影响最大。仅转染迷你基因的细胞中ceacam1L在两条带中所占比例为76．7％,而与ptb3种重组质粒共转染后,比例分别下降至58．3％、64．8％和54．0％。凝胶阻滞实验表明,探针GAE能与核蛋白结合,而ACE基本不能与核蛋白结合,与GAE结合的蛋白经质谱分析为PTB。结论：PTB过表达与ceacam1低表达有明显的相关性,拼接因子PTB参与ceacam1的选择性拼接。     

抗表皮生长因子受体单克隆抗体抑制和杀伤肺癌细胞的机理

目的：探讨表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）单克隆抗体（ｅｇｆ／ｒ３ ＭｃＡｂ）抑制和杀伤肺癌细胞机理。方法：细胞毒活性检测采用ＭＴＴ法，移植瘤膜表面ＥＧＦＲ的检测采用免疫组化法。     

选择性EGFR酪氨酸激酶抑制剂-吉非替尼

吉非替尼（Gefitinib,ZD1839,Iressa）是一种口服选择性表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂。表皮生长因子受体在一些类型的人类肿瘤细胞中存在过度表达,吉非替尼通过抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶的ATP结合位点发挥抗肿瘤作用。2003年明经FDA批准上市,用于一线化疗失败的局部晚期或转移性非小细胞肺癌的治疗。