活体柞蚕蛹复壮北虫草菌种初探

针对野生菌种在人工培养基上容易丢失产生子实体的能力,稳定性差,且野生型菌种虫草菌素等生理活性物质含量较低等影响北虫草规模化人工栽培的问题,本文探索利用紫外线对出发菌株P进行诱变处理,以生物转化率、虫草素、腺苷含量为指标,筛选出高产菌株89,其有性子实体中虫草素含量和腺苷含量分别是出发菌株的2.5倍和3.6倍.进一步对其进行传代稳定性试验测试后,可用于大规模工厂化北虫草培育用菌种.     

储存时间对腺苷和虫草素在柞蚕蛹虫草中分布和含量的影响

目的:研究储存时间对腺苷和虫草素在柞蚕蛹虫草中分布和含量的影响。方法:采用RP-HPLC法分别测定柞蚕蛹虫草子实体、菌核及整草中腺苷和虫草素含量,并与相同储存时间的米饭虫草进行比较。结果:储存1年的柞蚕蛹虫草腺苷和虫草素的含量顺序为子实体菌核;总量顺序为菌核子实体。储存2年的柞蚕蛹虫草腺苷和虫草素含量有所降低,其分布规律以及总量顺序没有明显变化。储存1年的柞蚕蛹虫草中腺苷总含量高于2年的,差异有统计学意义(P0.05),但其虫草素的含量差异无统计学意义(P0.05)。米饭虫草中腺苷含量是柞蚕蛹虫草的1.6倍,虫草素的含量是柞蚕蛹虫草5倍。结论:储存时间对腺苷和虫草素分布规律以及总量顺序无明显影响,但对其腺苷总含量有明显影响。     

RP-HPLC法测定不同北虫草子实体和培养基中腺苷和虫草素含量的比较

目的:比较九种北虫草子实体以及3种培养基中腺苷和虫草素的含量。方法:超声水提法提取样品中腺苷和虫草素,用RP-HPLC法测定其含量。结果:九种北虫草子实体腺苷和虫草素含量都存在差异,腺苷含量为(1.054±0.259)-(2.931±0.356)mg·g-1;虫草素含量差异较大,为(0.435±0.016)-(4.981±0.212)mg·g-1。3种不同培养基中虫草素和腺苷也存在差异,其中3号培养基虫草素含量最高,达1.046 mg·g-1,1号培养基腺苷最高,为0.612 mg·g-1。结论:九种北虫草子实体腺苷和虫草素含量差异较大;三种培养基中腺苷和虫草素含量也存在差异。     

新疆虫草与冬虫夏草中腺苷和虫草素的HPLC法测定比较

目的：建立测定虫草类药材腺苷和虫草素含量的HPLC方法,比较新疆虫草和不同地区冬虫夏草中腺苷和虫草素的含量差异。方法：采用反相高效液相色谱法,色谱柱：DikmaTM C18（4.6mm×250mm,5μm）;流动相：甲醇-水（15：85）;柱温为30℃,流速：1.0ml/min;检测波长：260nm。结果：新疆虫草和冬虫夏草中均含有腺苷和虫草素,其中新疆虫草中腺苷含量为237.7μg/g,介于3个冬虫夏草样品（145.2～307.4μg/g）之间;虫草素含量为38.9μg/g,明显高于冬虫夏草（4.2～11.3μg/g）的3～10倍左右。结论：本方法具有简便、快捷、准确等特点,适用于虫草类药材中腺苷和虫草素含量的测定,本研究提示新疆虫草可作为冬虫夏草新资源。     

人工培育北冬虫夏草主要有效成分分布特点的研究

目的:研究人工培育北冬虫夏草主要有效成分的分布特点。方法:以虫草素、腺苷和虫草多糖的含量为主要评价指标,采用HPLC和苯酚-硫酸法,分别研究了这三种活性物质在人工北冬虫夏草子实体上部、中部、下部和培养基中的分布情况。结果:人工北冬虫夏草整个生长过程中,腺苷、虫草素和虫草多糖在培养基中的含量都远远低于其他三个部分。结论:人工北冬虫夏草子实体的活性物质主要分布在子实体中,在培养基中的含量极少。     

工业化培育北虫草生物活性成分含量变化的研究

目的:明确工业化培育北虫草的主要生物活性成分在不同生长时期含量变化的规律.方法:采用HPLC和苯酚硫酸法,分别对不同生长时期的工业化培育的北虫草的虫草素、腺苷和虫草多糖含量的变化进行了跟踪.结果:培养周期内虫草素含量随生长期增长而不断增高,而腺苷和虫草多糖含量均在第40d达到最高值.结论:本研究结果对工业化生产,合理有...     

工业化培育北虫草生物活性成分含量变化的研究

目的:明确工业化培育北虫草的主要生物活性成分在不同生长时期含量变化的规律.方法:采用HPLC和苯酚硫酸法,分别对不同生长时期的工业化培育的北虫草的虫草素、腺苷和虫草多糖含量的变化进行了跟踪.结果:培养周期内虫草素含量随生长期增长而不断增高,而腺苷和虫草多糖含量均在第40d达到最高值.结论:本研究结果对工业化生产,合理有效地控制北虫草产品生物活性成分的含量,具有一定指导意义.     

高效液相色谱法测定人工虫草菌丝中腺苷和虫草素的含量

为定量测定蛹虫草菌丝体中腺苷和虫草素的含量，用ＹＷＧＣ_１８不锈钢柱，磷酸二氢钠氢氧化钠缓冲液（ｐＨ６.８，加１％四氢呋喃）为流动相，高效液相色谱法同时分离和测定了人工蛹虫草菌丝中腺苷和虫草素，并考察了提取方法。二组分的线性关系良好，回收率满意。     

培养北虫草子实体与野生冬虫夏草子实体主要活性成分比较

目的:比较和评价培养北虫草子实体与野生冬虫夏草子实体的特征性化学活性成分。方法:运用现代化学分析技术,对人工低温培养的北虫草的子实体与野生冬虫夏草的主要化学成分虫草酸、虫草多糖、腺苷、超氧化物岐化酶、氨基酸组分等进行了比较分析。结果:培养北虫草子实体中虫草素含量(12.700±0.544) g/kg,为野生冬虫夏草子实体的302倍,腺苷含量为(0.037%±0.010)%,为野生冬虫夏草子实体的1.42倍,虫草多糖(5.680%±1.500%)高于野生冬虫夏草46%。培养北虫草子实体中可溶性蛋白总量(34.200%±8.090%)为野生虫草的1.31倍,且SOD活性达1616 U/g,但野生冬虫夏草中SOD活性极低。氨基酸分析结果显示,培养北虫草子实体中具有17种必需氨基酸,除甘氨酸和甲硫氨酸外,其它氨基酸含量均高于野生冬虫夏草子实体。结论:人工培养北虫草子实体,具有高含量活性成分,可以深度开发替代野生冬虫夏草作为药用材料和食品保健开发。     

用蛹虫草固体发酵法高效生产虫草素的研究

目的：研究并建立用蛹虫草固体发酵方式高效生产虫草素的最佳方法。方法：通过对不同菌株在固体发酵过程中各生长期的虫草素含量变化进行跟踪测定以及正交旋转组合设计、正交试验设计等方法，对影响虫草素产量和含量的各影响因子(包括菌种、生长期、培养基配方和环境条件等)进行系统优化。结果：JF-1是虫草素生产的最佳菌株，现蕾期是收获提取虫草素的最佳时期；最佳的培养基配方为水料比1.1∶1(mL·g^-1)，营养水中酵母膏、蛋白胨、葡萄糖的用量分别为22.6，6.0，25.4 g·L^-1，营养水pH 6.6；最佳的环境条件为：光照强度4 400 lx，每日光照时间18 h，温度18～22 ℃。结论：用以上方法固体发酵生产虫草素，经过约13 d的培养，培养基中虫草素达到0.60%，比传统液体发酵方法的最高产量高近2倍，并且培养时间缩短2 d。     

冬虫夏草及其代用品中腺苷和虫草素的LC-MS-MS定量分析研究

目的：建立定量测定冬虫夏草及其代用品中腺苷和虫草素的LC-MS-MS方法。方法：HPLC-ESI-MS-MS法,用90%甲醇为提取溶剂,采用多反应监测(MRM)模式测定。结果：腺苷的回归方程Y＝89.04X+506.85,r=0.999 7,虫草素的回归方程Y＝99.66X+1 251.34,r=0.998 8,线性范围均为5.0～1 000.0 μg·L-1；腺苷和虫草素的检出限(LOD)分别为0.44,0.31 μg·L^-1,加样回收率分别为98.12%,97.94%。结论：该法灵敏、选择性好、快速,可用于冬虫夏草及其代用品中腺苷和虫草素的定量测定和质量控制。     

HPLC-ESI-MS测定冬虫夏草和蚕蛹虫草中腺苷和虫草素含量

目的 :建立测定冬虫夏草及蚕蛹虫草中腺苷和虫草素的方法。方法 :HPLC-ESI-MS法 ,用甲醇为提取溶剂 ,采用选择性离子检测 (SIM)和电喷雾离子化 (ESI) ;色谱条件 :ShimadzuVP-ODS色谱柱 ;流动相水 甲醇 甲酸(94∶5∶1) ,以 2 氯腺苷为内标。结果 :腺苷回归方程Y=0 .1346X +0.0129,r=0.9984 ,线性范围 0.5～124.5mg·L^-1;虫草素回归方程Y=0.2164X +0.0215 ,r=0.9991,线性范围 0.5～ 136 .5mg·L^-1;腺苷和虫草素加样回收率分别为 95 .8%及 98.1%。结论 :方法灵敏、快速和选择性好 ,可用于冬虫夏草及其代用品中腺苷和虫草素的分析及质量控制。     

多指标优选蛹虫草提取工艺

目的:优选蛹虫草的提取工艺。方法:用多指标综合评分法,采用L9(34)正交试验设计,以虫草素、腺苷、尿苷、多糖及出膏率为检测指标,考察了4种因素(溶剂用量、乙醇体积分数、提取时间、提取次数)对其提取工艺的影响。结果:蛹虫草最佳提取工艺条件为加8倍量水,煎煮3次,每次1 h。结论:本研究优化了蛹虫草的提取工艺,并为蛹虫草的进一步利用和产品开发提供了实验依据。     

复方虫草片对小鼠抗体力性疲劳影响的实验研究

目的 :通过小鼠游泳试验、爬杆试验以及相应的生化指标 :血尿素、血乳酸、肝糖原、及脑内谷氨酸(Glu)和 γ-氨基丁酸 (GABA)含量变化对复方虫草片进行抗疲劳功能的研究。方法 :分光光度法分别测定血尿素、血乳酸、肝糖原含量 ,高效液相 (HPLC)测定小鼠脑内谷氨酸 (Glu)和 γ-氨基丁酸 (GABA)含量。结果 :给予不同剂量受试物 2 8d后 ,与对照组相比爬杆时间和游泳时间显著提高 ;血清尿素氮明显降低 ;肝糖原含量显著性提高 ;运动后 0 min和 15 min血乳酸含量分别降低并趋于正常对照。脑内谷氨酸 (Glu)和γ-氨基丁酸 (GABA)含量高于对照组 ,以上结果均有显著性差异。结论 :复方虫草片配方中虫草与其他药物的配伍可能具有调整体内代谢作用并能快速加强机体恢复 ,具有抗体力性疲劳作用     

HPLC法测定蛹虫草中腺苷和虫草素的含量

目的建立HPLC法测定蛹虫草中腺苷和虫草素的含量。方法采用SinochromODS Cl8柱,以磷酸盐缓冲液-甲醇(85:15)为流动相;流速为1.0 mL·min-1;检测波长为260 nm。结果腺苷在8.92~44.6μg·mL-1范围内线性关系良好,r=0.999 9;虫草素在6.23~31.15μg?mL-1范围内线性关系良好,r=0.999 9;腺苷平均加样回收率为97.80%,RSD为1.1%(n=5)。虫草素平均加样回收率为97.46%,RSD为1.5%(n=5)。结论本法专属性强,准确度高,重现性好,可作为蛹虫草质量控制的方法。     

虫草菌丝中3种活性成分对血管新生与内皮细胞功能的影响

目的探讨虫草菌丝中的3种活性成分(虫草素、腺苷、麦角甾醇)对血管新生和肝内皮细胞功能的影响。方法采用鸡胚绒毛尿囊膜实验和转基因斑马鱼实验分别观察虫草素、腺苷、麦角甾醇对新生血管面积、功能血管数量及碱性磷酸酶变化的影响;MTT法测定3个化合物对人肝癌SK-HEP-1细胞的细胞毒活性;采用血管内皮生长因子(VEGF)诱导SK-HEP-1细胞增殖为模型,以索拉非尼为阳性对照药,MTT法测定3个化合物对细胞增殖的影响,Transwell法观察细胞迁移,Matrigel管腔形成实验观察细胞管腔形成情况,荧光探针法检测胞内一氧化氮(NO)的量和一氧化氮合酶(NOS)活性。结果虫草菌丝中腺苷、麦角甾醇能够显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管新生、减少转基因斑马鱼功能血管数量,而虫草素能够促进鸡胚绒毛尿囊膜血管新生;与对照组相比,VEGF可诱导SK-HEP-1细胞增殖,促进细胞迁移和管腔形成,并可使其胞内NO水平和NOS活性显著升高;与模型组相比,虫草素、腺苷、麦角甾醇呈剂量依赖性地抑制SK-HEP-1细胞增殖,腺苷、麦角甾醇能抑制SK-HEP-1细胞迁移,3者均可不同程度地抑制SK-HEP-1细胞管腔形成,且剂量依赖性地降低胞内NO水平和NOS活性。结论虫草菌丝中的虫草素、腺苷、麦角甾醇对SK-HEP-1细胞增殖、迁移、管腔形成有不同程度的抑制作用,其中腺苷的作用尤为明显;其机制与抑制细胞内NO水平和NOS活性有关。     

人工培育北虫草培养基的筛选及优化

目的：为工厂化培育北虫草提供优质液体发酵菌种,保证并提高人工培育北虫草的质量。方法：以生物转化率、虫草素和腺苷含量为指标,从碳源、氮源、C/N比、微量元素硒的影响等因素,通过正交实验确定优化培养基的组成成分。结果：优化培养基的组成成分为：土豆汁20%、葡萄糖2%、蛋白胨1%、蚕蛹粉0.5%、KH2P04 0.1%、MgS04·7H2O 0.05%、FeSO4·7H2O 0.002%、VB18mg·L-1,发酵初始pH7.0。结论：采用优化后的培养基,提高了北虫草子实体培育的生物转化率和子实体中的有效成分含量。     

基于转录组测序的冬虫夏草虫草素生物合成研究

目的对冬虫夏草进行转录组测序,为虫草素生物合成提供依据。方法利用Illumina/Solexa Hi Seq 2500高通量测序平台对冬虫夏草菌丝体和子实体转录组进行测序、数据组装,分析并预测虫草素生物合成途径、相关基因及差异表达量,发现代谢途径中多数酶在菌丝体发育阶段的表达水平较高。采用c DNA克隆技术从新鲜冬虫夏草子实体中克隆到核糖核苷酸还原酶(RNR)基因亚基。结果其中RNR是腺苷代谢的关键酶,从转录组数据中挖掘到RNR大、小亚基各1条,及4条RNR同源序列。RNR大亚基(RNRL)c DNA全长2 733 bp,编码910 aa,RNR小亚基(RNRM)c DNA全长1 257 bp,编码418 aa。通过保守区域和功能结构域分析发现主要催化活性位点位于RNRL,RNRM含有铁结合蛋白保守位点,大小亚基均含有二聚体和亚基结合区域。结论基于转录组测序预测,以RNR为切入点研究虫草素合成途径,为最终揭示虫草素生物合成机制提供数据支持。