断层皮片成纤维细胞原代培养法

目的在人成纤维细胞的生物学特性观察研究中,进行成纤维细胞的原代培养,以获得足够量的成纤维细胞.方法我们采用整形外科断层取皮技术,使用细胞刮刀,可相对简单获取有活力的成纤维细胞,并应用台盼蓝细胞活力染色排除法进行检测.结果该方法简单、经济可获取足够量的成纤维细胞,使得短期内即可获得大量的传代细胞.1 cm×2 cm的断层皮片可达到的细胞的数量级106左右.结论断层皮片成纤维细胞培养方法,较胰酶消化法和组织块贴壁法有明显的优越性,在进行成纤维细胞移植方面,值得加以推广和应用.     

大张皮片法与小皮条法培养表皮细胞的比较研究

目的　比较研究用大张皮片和小皮条培养表皮细胞的方法。　方法　将皮肤组织切成大张皮片 ,用锐刀网状切割真皮面 ,Dispase酶消化充分后用镊子分离真、表皮 ,然后消化表皮进行表皮细胞培养 (大张皮片法 )。将同样大小的皮肤组织切割成小皮条 ,消化充分后用镊子分离真、表皮 ,然后进行表皮细胞培养 (小皮条法 )。记录两种方法切割皮肤和分离真、表皮所需时间 ,比较培养出表皮细胞的数量和纯度。　结果　将 5 cm2 大小的皮肤切割成小皮条需要 8～10分钟 ,而将同样大小皮肤切割成大张皮片仅需 1～ 2分钟 ;从小皮条上分离真、表皮耗时 10～ 15分钟 ,大张皮片法仅需2分钟。通过对比培养发现 ,大张皮片法获得的表皮细胞较多 ,活力较强 ,发生成纤维细胞污染的机会少。　结论　大张皮片法较小皮条法操作更简便、快捷 ,培养获得的表皮细胞活性高 ,成纤维细胞污染机会明显减少     

人胃黏膜成纤维细胞原代培养条件的优化

目的 通过优化人胃黏膜成纤维细胞的原代培养条件,提高培养成功率,为进一步研究胃癌相关成纤维细胞奠定基础.方法 原代培养采用植块法,利用免疫组织化学、细胞形态学和电镜等方法进行细胞鉴定;分析不同培养表面、培养基和培养液pH值对原代细胞培养游出情况的影响,筛选适合的培养条件.结果 Logistic逐步回归分析提示RPMI 1640培养基的Waldχ2值=32.4533,P<0.01,标准化回归系数=0.7852,说明使用RPMI 1640培养基更利于原代成纤维细胞游出;pH=7.4的培养液的Waldχ2值=49.4756,P<0.01,标准化回归系数=0.4867,说明培养液pH值为7.4更利于原代成纤维细胞游出;不同水平的培养表面条件对成纤维细胞游出率的影响差异无统计学意义(P>0.05),而且各培养条件之间无交互作用.结论 通过优化培养表面、培养基种类和pH值等培养条件,可以提高人胃黏膜成纤维细胞原代培养的成功率.     

类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖及巨自噬的表达水平

目的:探讨体外原代培养的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RA-FLS)中是否存在巨自噬现象以及在类风湿关节炎(RA)中的发病机制.方法:培养原代RA-FLS,以骨关节炎(OA)患者膝关节滑膜组织中培养的骨关节炎滑膜成纤维细胞(OA-FLS)作为对照组.采用MTT法检测细胞增殖活力;流式细胞仪检测细胞凋亡;采用实时荧光定量聚...     

表皮细胞培养与移植研究——表皮细胞分离技术

表皮细胞培养量重要的一步就是分离过程,目前广泛使用的方法是用胰蛋白酶消化皮片。由于消化过程中真皮始终存在。因此不可避免地存在成纤维细胞的污染。为此我们设计了一种可获得全部基底细胞的改良表皮分离方法。材料与方法一、表皮细胞分离人表此细胞从烧伤病人(18～24岁)植皮手术后所剩中厚皮中分离。对 Rheinwald 法(Tr)、我们实验室常规方法(Tr-C)及 Dispase 方法(D-Tr)进行比较。1.Dispase 方法     

成纤维细胞体外培养、冻存及复苏的实验研究

目的：探讨正常皮肤和瘢痕疙瘩组织成纤维细胞在体外培养情况下其生物学特性的差异，以及与细胞冻存和复苏的方法及其应用价值。方法：对8例正常皮肤和8例瘢痕疙瘩组织标本分别进行体外成纤维细胞的原代培养、传代培养，观察培养的成纤维细胞形态，并作生长曲线比较细胞增殖情况。选取处于对数生长期的培养细胞梯度降温后置入液氮（-196℃）中保存4—6个月，进行细胞复苏培养，以2％台盼蓝确定细胞活力，并观察复苏的成纤维细胞形态学状况。结果：体外培养的正常皮肤和瘢痕疙瘩组织成纤维细胞形态和生长曲线基本相同，但瘢痕疙瘩原代成纤维细胞萌出生长较正常皮肤快，生长融合后成纤维细胞排列紊乱，极性消失，有明显的交叉重叠现象；体外培养的成纤维细胞，经冷冻保存4～6个月后，复苏率超过80％，细胞形态无明显改变。结论：体外培养的正常皮肤和瘢痕疙瘩组织成纤维细胞形态与生长特性基本相同。瘢痕疙瘩成纤维细胞可成功冻存和复苏。     

表皮细胞培养与移植研究──表皮细胞分离技术

表皮细胞培养与移植研究──表皮细胞分离技术苏波，赵雪莲，张仕敏，张素贞，葛绳德表皮细胞培养量重要的一步就是分离过程，目前广泛使用的方法是用胰蛋白酶消化皮片。由于消化过程中真皮始终存在。因此不可避免地存在成纤维细胞的污染。为此我们设计了一种可获得全部基...     

PRP促进光老化人皮肤成纤维细胞胶原与透明质酸合成的研究

目的体外研究人皮肤成纤维细胞（HSFs）发生光老化时,富血小板血浆（PRP）对其合成胶原与透明质酸的影响。方法使用紫外线（UVA）照射体外培养的原代人皮肤成纤维细胞,并检测光老化细胞的细胞增殖情况及细胞倍增时间。用含不同浓度PRP（10%、30%、50%）的培养液培养光老化细胞,正常培养的光老化细胞为阴性对照,原代人皮肤成纤维细胞为阳性对照。ELISA检测各组细胞外液中胶原蛋白与透明质酸含量。结果经紫外线照射后,细胞增殖减弱,加入PRP后,伴随PRP浓度的增加,细胞倍增时间缩短;ELISA检测发现,经过UVA照射的成纤维细胞COL1、COL3及透明质酸合成量,显著低于正常培养的成纤维细胞（P〈0.01）。在PRP作用后,成纤维细胞的COL1、COL3及透明质酸合成量均明显增加（P〈0.01）。结论PRP能显著促进光老化人皮肤成纤维细胞胶原与透明质酸合成,可应用于皮肤抗衰老的研究。     

心瓣膜组织工程中种子细胞原代联合培养的验研究

我们采用人大隐静脉组织块法原代联合培养人血管内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞,对其培养、扩增条件加以摸索,对细胞进行鉴定,获得TEHVs所需的种子细胞.     

角质形成细胞和成纤维细胞两步法培养的实验观察

目的应用中性蛋白酶和胰蛋白酶两步消化法原代培养角质形成细胞和成纤维细胞，并进行传代培养。方法取乳鼠背部皮肤，分离出表皮和真皮，加入中性蛋白酶和胰蛋白酶消化，进行原代和传代培养，通过倒置显微镜观察细胞的生长情况。结果原代培养的角质形成细胞和成纤维细胞长成单层且分布均匀；传代培养后排列规律、生长良好。结论两步消化法可以培养出角质形成细胞和成纤维细胞，并且比以往的培养方法更加方便快捷。     

人膀胱癌组织中成纤维细胞的培养和鉴定

目的:探索人膀胱癌组织中成纤维细胞的培养和鉴定方法,为其功能的研究奠定基础。方法:分别应用组织块法、消化法进行人膀胱癌组织中成纤维细胞的原代培养,细胞铺满培养瓶底后首次传代,通过胰酶消化法和反复贴壁法进行成纤维细胞的纯化;通过倒置显微镜观察细胞形态、透射电镜观察细胞内部结构和免疫组化方法检测细胞膜波形蛋白(vimentin)、角蛋白(keratin)表达情况对细胞进行鉴定。结果:组织块法原代培养约1周可见纤维样细胞从组织块周围游出,消化法4天后可见细胞贴壁,均于5周左右细胞基本长满培养瓶底。首次传代时应用胰酶消化法进行成纤维细胞的初次纯化,第二次转种时先后应用酶消化法和反复贴壁法再次进行细胞纯化,第3、4代基本可获纯的含单个核的长梭形纤维样细胞。取第5、6代状态良好的细胞常规准备后进行透射电镜检查和免疫组化染色:电镜提示细胞内可见明显的粗面内质网、高尔基体和(或)微丝结构,线粒体数量少,分布不均;免疫组化结果为vimentin染色阳性,keratin染色阴性。结论:只要给细胞创造良好的生长条件并正规操作,组织块法和消化法均可成功地进行人膀胱癌组织中成纤维细胞的原代培养;因与恶性肿瘤细胞相比,成纤维细胞的优势生长并不明显,故细胞的纯化工作极为重要。     

侵袭性垂体腺瘤成纤维细胞的体外培养及其生物学特性

目的建立人侵袭性垂体腺瘤成纤维细胞分离培养的方法，探讨其生物学特性及其在垂体瘤侵袭性生长中的作用。方法差速贴壁筛选法分离培养侵袭性垂体腺瘤成纤维细胞，进行原代及传代培养，倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞形态及生长特性，免疫组化染色进行成纤维细胞鉴定，MTT法绘制传代细胞的生长曲线，电镜观察其超微结构。结果侵袭性垂体腺瘤成纤维细胞体外培养生长状况良好，具有活跃的增殖能力。细胞胞体较大，形态不规则，细胞质中可见丰富的粗面内质网和核糖体，高尔基复合体发达，Ⅰ型胶原及波形蛋白表达率在95％以上。结论应用差速贴壁筛选法成功培养出侵袭垂体腺瘤成纤维细胞，其具有旺盛的增殖能力，可能在垂体瘤侵袭性生长过程中起重要作用。     

组织块贴壁法成纤维细胞培养的体会

增生性瘢痕疙瘩是整形外科的棘手问题。就此问题的研究,目前尚缺乏理想动物模型,大多数实验研究仍基于成纤维细胞的体外培养。在细胞培养中,如何简化操作步骤、降低耗费,培养出活力及状态良好的细胞显得尤为重要。下面就我们运用组织块贴壁法培养增生性瘢痕及瘢痕疙瘩成纤维细胞工作中的一些成功的体会作一简要介绍。     

消化法培养成年猴许旺细胞

目的　探讨猴许旺细胞在标准条件下的培养、扩增与传代。　方法　根据Wallerian变性后许旺细胞增殖的原理 ,利用双酶消化法及阿糖胞苷 (Ara c)抑制成纤维细胞生长分裂的方法获取许旺细胞。用S 10 0抗体鉴定所培养的细胞并用MTT法检测这些细胞的增殖能力。　结果　猴许旺细胞培养 15d后可达 5× 10 6,纯度为 92 % ,MTT测定证实该细胞生长良好。　结论　神经预变性后 ,通过消化法和Ara c处理能获取量大纯度高、活力良好的许旺细胞 ,可用于组织工程化人工神经的种子细胞。     

α-促黑素细胞激素在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达和作用

目的检测α－MSH在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达和作用,为研究瘢痕疙瘩的形成机理提供新的理论依据.方法将取自患者躯干部位的瘢痕疙瘩皮肤,用组织块培养法进行成纤维细胞原代培养,DMEM培养液传代、扩增培养,以细胞形态学鉴定成纤维细胞.应用免疫组织化学染色方法检测α－MSH在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达,并应用流式细胞仪从细胞生长及增殖特性方面分析α－MSH对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长和增殖的影响.结果α－MSH能够在瘢痕疙瘩成纤维细胞中得到高表达,浓度为10－6 mmol/L的α－MSH可明显促进瘢痕疙瘩成纤维细胞生长、增殖.结论α－MSH能够在瘢痕疙瘩成纤维细胞中得到高表达,瘢痕疙瘩成纤维细胞对α－MSH的反应性增强表明α－MSH可能在促进瘢痕疙瘩的形成中起着重要的作用.     

改良“贴壁法”颈椎后纵韧带骨化成纤维细胞的培养

目的改良颈椎后纵韧带骨化（ossification of posterior longitudinal ligament,OPLL）成纤维细胞的培养方法。方法采集OPLL患者和非OPLL患者的后纵韧带组织,用＂贴壁法＂进行体外原代培养,传代后常规苏木素伊红染色,倒置显微镜观察成纤维细胞形态,波形蛋白免疫组化鉴定。结果分离的成纤维细胞可在体外迅速贴壁生长、增殖,波形蛋白免疫组化染色为阳性。结论改良＂贴壁法＂可以较好、较快的获得稳定培养的OPLL成纤维细胞,为研究OPLL的发病机理等提供生物学基础。     

肿瘤相关成纤维细胞促进原代胰腺癌细胞生长及人源性异种移植瘤模型体内成瘤

目的优化人原代胰腺导管癌(PDAC)细胞及肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)的分离及培养方法,验证CAFs对原代PDAC细胞的体外生长以及其对高度免疫缺陷模型NOG小鼠体内成瘤的影响,以探索人源性异种移植瘤(PDX)模型构建的新方法。方法首先原代培养手术切除的PDAC组织。以原代PDAC细胞单独培养为对照,观察CAFs和原代PDAC细胞共培养对PDAC细胞传代生长活性的影响。最后在NOG小鼠肩胛部注射混合培养的原代PDAC细胞和CAFs,观察PDX模型建模情况。结果原代PDAC细胞在体外单独培养传代少,均在5代及以内停止生长;与CAFs共培养可促进原代PDAC细胞生长活性,可稳定传至10代以上。NOG小鼠体内注射混合细胞(原代PDAC细胞+CAFs)建模2~3周即可形成肿瘤,而注射CAFs无肿瘤形成。混合细胞法建模有13例(92.9%)成瘤,单一细胞法有9例(64.3%)成瘤,可能因为样本量少,二者成瘤率比较差异无统计学意义(P=0.167);并且肿瘤细胞注射后2、4、6、8周时混合细胞法建模的肿瘤体积均明显大于对应观察时间点单一细胞法建模的肿瘤体积(P<0.01)。结论CAFs对原代PDAC细胞生长传代具有促进作用,原代PDAC细胞与CAFs共培养法可显著提高PDAC原代培养稳定传代,原代PDAC细胞与CAFs混合培养的细胞注射可提高NOG小鼠PDX建模成功率。     

机械应力作用成纤维细胞的研究进展

用机械应力作用于培养的细胞,研究其受应力作用后的各种变化,是目前细胞生物学领域发展十分迅速的一种研究方法,在机械应力作用于体外培养细胞的相关实验研究中,目前比较活跃的领域为骨细胞(研究骨延长技术)、血管平滑肌细胞(研究高血压)、肾小球系膜细胞(研究肾小球高血压)以及肺上皮细胞等,其中对成纤维细胞研究亦比较多,由其心血管系统成纤维细胞在该领域的研究报道较多,但与整形外科关系比较密切的皮肤成纤维细胞研究报道相对较少。本文结合应力作用培养成纤维细胞在心血管领域和肺等方面的研究结果,对和整形外科有密切关系的成纤维细胞在应力作用下所发生的变化的相关研究进展综述如下:     

瘢痕疙瘩成纤维细胞低密度培养的克隆能力分析

目的：比较瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFs）和正常真皮成纤维细胞（NFs）间克隆形成能力的差异,探讨瘢痕疙瘩中病理性干细胞是否存在,及其对瘢痕疙瘩发生发展的影响。方法利用酶消化法获得瘢痕疙瘩和正常皮肤组织的原代细胞,以4000个/皿的密度接种,进行低密度培养,2周后观察细胞克隆的形成及形态变化。结果低密度培养条件下的瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞都可形成克隆,但KFs可形成明显的克隆集落,NFs形成的克隆不明显且松散。KFs克隆形成率高于NFs,为（0.80±0.21）%,而NFs为（0.18±0.06）%,两者间差异显著（P〈0.05）。结论低密度培养条件下,瘢痕疙瘩成纤维细胞的克隆形成能力高于正常皮肤成纤维细胞,可能与瘢痕疙瘩组织中存在病理性瘢痕疙瘩干细胞有关。     

普奈洛尔抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞生长机制的实验研究

目的:探讨普奈洛尔抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞生长的机制。方法:选择本院瘢痕疙瘩患者病理组织,分离培养,获取成纤维细胞,并分别于含有普萘洛尔的培养基(实验组)和单纯培养基(对照组)中进行培养,应用CCK-8法检测两组瘢痕疙瘩成纤维细胞生长曲线,酶标仪检测450~630nm的吸光度值。结果:实验组瘢痕疙瘩成纤维细胞生长能力明显受到抑制,且吸光度值明显低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:普萘洛尔可明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长,为整形外科中瘢痕疙瘩的预防及治疗提供了新方向。