改进的PCR模板制备及DNA回收方法

直接用煮沸的细菌裂解液中的ＤＮＡ作为ＰＣＲ模板，扩增效果与用酚／氯仿抽提纯化的质粒ＤＮＡ作模板的结果一致，缩短了实验时间，利用简单材料因收酶切片段，省去了有机溶剂反复抽提和沉淀的步骤，回收率达了９０％，效果很好。     

三种血痕DNA抽提方法的比较研究

在用聚合酶链反应技术进行基因扩增研究过程中，采用／氯仿常规方法从人血痕中抽提ＤＮＡ，所抽提ＤＮＡ数量不足用于ＰＣＲ扩增。为提高模板ＤＮＡ的数量，昼避免抽提过程所用试剂对ＰＣＲ的干扰，先后采用裂解法，水煮法抽提ＤＮＡ。结果表明，此两种方法要比酚／氯仿法简便，迅速，效果好。而在后两种方法比较下，水煮法要比裂解法更具优越性，是一种从血痕中提取ＤＮＡ的良好方法。     

PCR法检测耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌的mecA基因

临床标本进行ＤＮＡ抽提后，用聚合酶链反应（ＰＣＲ）将具有６２３个ｂｐ的耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌（ＭＲＳＡ）的ｍｅｃＡ基因扩增，经琼脂糖电泳及ＤＮＡ印迹杂文（ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ），并用ＥＣＬ３’寡核苷酸标记增强化学发光进行检测，其结果与ＭＲＳＡ常规培养方法作比较。结果显示，７３份临床标本中，１５份常规培养法ＭＲＳＡ和ＰＣＲ法ｍｅｃＡ基因均为阳性，另１份ｍｅｃＡ基因扩增阳性的标本，常规培养ＭＲＳＡ为阴性。作者认为，由于ＰＣＲ对检测ＭＲＳＡ的ｍｅｃＡ基因具有快速、较强的特异性和敏感性等特点，作为检测临床标本中的ＭＲＳＡ的方法是可行的。     

直接用细菌重组体进行聚合酶链反应及其在克隆鉴定中的应用

作用不需提纯ＤＮＡ模，可直接从质粒的宿主菌中扩增插入片段的方法进行扩增和克隆鉴定。结果说明，该方法不但在扩增的灵敏度和特异性与经用酚氯仿抽提纯化的质粒ＤＮＡ作模板一致，使质粒鉴定的时间由原来４８－７２ｈ缩短至２－８ｈ，而且节省了细胞培养及质粒纯化过所用的试剂及器械。特别是对于无法用酶切法鉴定的克隆有特殊意义。     

HLA—DR基因分型中三种DNA提取法的比较

目的：寻找简便快速的ＨＬＡ－ＤＲ基因分型方法。方法：比较了标准酚－氯仿抽提法、ＮＰ－４９０法及快速盐析法抽提ＤＮＡ对ＨＬＡ－ＤＲ基因分型的影响。结果：３种方法抽提的ＤＮＡ含量、纯度、琼脂糖凝胶电泳结果及用于ＨＬＡ－ＤＲ基因分型的效果无差异,但酚－氯仿抽提法抽提ＤＮＡ所需时间比ＮＰ－４０法及快速盐析工。结论：ＮＰ＝４０法及快速盐析法可作为ＨＬＡ＿ＤＲ快速基因分型时提取ＤＮＡ的方法。     

转化生长因子α第四外显子基因的克隆和序列分析

作以正常人脑组织基因组ＤＮＡ为模板，用自行合成的一对引物和聚合酶链反应方法体外扩增了转化生长因子α基因第四外显子，将此扩增片段克隆入Ｍ１３ｍｐ１８并对此片段进行了序列分析，结果表明：所克隆基因片段正确。     

一种简便快速制备多聚酶链反应模板的方法

在多聚酶链反应时采用一种快速简便的模板ＤＮＡ制备方法。组织块在冰浴中剪碎和匀浆，再用蛋白酶Ｋ降解；细胞则直接用蛋白酶Ｋ处理。离心后，取上清则可直接作为ＰＣＲ的模板。采用此方法制备的模板，经ＰＣＲ扩增，检测宫颈细胞、细胞培养物、口腔肿瘤活检组织中ＨＰＶ６、１１和ＨＳＶ的感染，取得了满意的结果。揭示该方法能从各种细胞和组织中制备ＰＣＲ的模板，而无需用ＳＤＳ－苯酚－氯仿抽提ＤＮＡ。     

EBV－DNA酶全基因扩增克隆和鉴定

根据Ｂｅａｒ的ＥＢ病毒（ＥＢＶ）基因全序列，设计包括ＥＢＶ特异性ＤＮＡ酶全基因的一对引物，在引物上设计有一个ＳａｌⅠ切点，以便于克隆。选用蛋白酶Ｋ裂解的Ｒａｊｉ细胞ＤＮＡ为模板，扩增出一条１４６０ｂｐ的特异条带，纯比后经ＴａｑⅠ酶切形成１１９８ｂｐ和２６２ｂｐ的两个片段，证实该扩增片段即为ＥＢＶ特异性ＤＮＡ酶的全基因片段。以ＪＭ１０３为宿主菌，以高效表达质粒ＰＢＶ２２１为载体，按常规方法作酶切、连接、转化，最后在含氨中青霉素的培养基上挑取单菌落扩大培养，用快速法少量制备质粒ＤＮＡ。根据质粒电泳结果粗筛，再行ＢａｍＨⅠ酶切初步鉴定，确定质粒大小为５１１７（１４５１＋３６６６）ｂｐ的菌落为阳性克隆。先后用ＢａｍＨⅠ和ＴａｑⅠ消化阳性重组体，以形成１２００ｂｐ和３９１７ｂｐ两片段的确定为正向连接重组体。本实验首次将ＥＢＶ－ＤＮＡ酶全基因片段克隆到高效表达载体ｐＢＶ２２１上获得成功     

TaqDNA聚合酶一步法获得TGF—β1基因片段的RT—PCR扩增产物

以组织细胞中提取的总ＲＮＡ为模板，加入ＴａｑＤＮＡ聚合酶和一对以ＴＧＦ－β１ｃＤＮＡ为模板设计的引物，经变性，退火，延伸共３０次循环后，可以得到ｃＤＮＡ为模板的扩增产物，实验证实ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有逆转录酶活性，用一步常规聚合酶锭反应即可获取逆转录聚合酶链反应的ＴＧＦ－β１４６８ｂｐ扩增产物。     

不经抽提DNA的PCR模板快速制备法研究

不经抽提ＤＮＡ的ＰＣＲ模板快速制备法研究石奇珍，吕联煌，张学敏关键词多聚酶链反应，脱氧核糖核酸，模板多聚酶链反应（ＰＣＲ），对脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）质量要求不高［１］，可源于单个淋巴细胞或精子，单根头发等［２］。曾溢涛等用于血提取ＤＮＡ进行基因扩增［...     

16S rDNA序列分析在临床不常见细菌鉴定中的初步应用

目的建立细菌16S rDNA序列分析技术并探讨其在临床不常见细菌鉴定中的应用价值。方法收集经全自动微生物分析系统鉴定其可靠率在99%及以上的常见细菌10株和常规方法难以鉴定或少见菌17株,通过PCR扩增16S rDNA v3-v4区基因片段并进行序列测定,序列与16SpathDB 2.0数据库上已知细菌的16S rDNA序列进行比对分析确定细菌种属。当v3-v4序列片段不能明确鉴定细菌时,结合16S rDNA长片段测序及管家基因dnaJ和rpoB的序列做进一步分析。结果经16S rDNA v3-v4区序列分析,10株(100%)临床常见菌都能鉴定到种水平,其可靠性大于98.0%。17株不常见菌株中,10株(58.8%)细菌只与1种菌相似性大于98.0%,成功鉴定到单个种水平;6株(35.3%)细菌与不止1种菌的相似比大于98.0%;1株菌与已知菌相似性在96.0%~98.0%之间只能鉴定到属(棒状杆菌)。进一步结合16S rDNA长片段及管家基因dnaJ和rpoB的序列分析,所有菌株均可鉴定到单个种水平。结论结合16S rDNA和管家基因序列分析,可用于临床常见及不常见细菌的分子鉴定。     

HBsAg和GM-CSF融合表达质粒的构建

目的：构建乙肝HBsAg和GM-CSF的融合表达质粒，借助GM—CSF的免疫佐剂作用，提高乙型肝炎DNA疫苗的免疫效果。方法：用PCR方法分别从pEcob6和pCD-hGM—CSF中扩增出基因S和GM-CSF，克隆到真核表达质粒pcDNA3．1( )中，构建pcDNA3．1-S及融合表达质粒pcDNA3．1-GM-CSF-S，然后以重组质粒转染真核细胞，研究重组质粒体外表达。结果：经酶切鉴定及DNA序列证实重组质粒构建正确，细胞转染试验表明重组质粒能在COS-7及HepG-2内表达。结论：乙肝HBsAg和GM-CSF的融合表达质粒构建成功，重组质粒能在真核细胞内表达。     

多重半套式PCR检测细菌16srRNA基因方法的建立

（1）目的 设计并建立多重半套式聚合酶链反应（PCR）快速检测临床标本中感染病原菌DNA方法。（2）方法 通过对多数病原菌16srRNA基因保守区和变异区序列分析,设计通用引物和革兰阴性菌及革兰阳性菌的特异性引物分别作为外侧和内侧引物,分两步先后加入同一反应体系中对不同细菌的DNA进行扩增。（3）结果金黄色葡萄球菌和大肠无纪律希菌经扩增后均有长度为1032bp的DNA片段产生;金黄色葡萄球菌另有一长度为336bp的特异性产物,大肠埃希菌另有一长度为127bp的特异性产物。（4）结论 该方法可以特异、敏感、快速检测出临床感染的病原菌。     

肺炎克雷伯菌与双歧杆菌裂解物的免疫调节作用对比研究

目的:对肺炎丸雷伯菌与双歧杆菌裂解物的免疫调节作用做对比研究。方法:上述2种菌经培养后,采用超声破碎法获得其细菌裂解物。对细菌裂解物采用淋巴细胞转化试验和溶血空斑试验检测具对免疫功能的影响。结果:0.625g/L肺炎克雷伯菌和双歧杆菌裂解物对T细胞和B细胞的激活最显著,与对照组相比有显著性差别(P<0.01)。结论:肺炎克雷伯菌裂解物具有良好的免疫增强作用,在感染性疾病的防治中有良好的应用前景。     

聚合酶链反应法扩增宫颈癌c-Ha-ras癌基因100bp片段

富颈癌 DNA 在两种特异引物和 DNA 聚合酶的存在下,经35轮循环的变性、退火和链的延伸反应,c-Ha-ras 癌基因100bp 片段被放大约10~6倍。反应产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳可见清晰的扩增带。     

恶性疟P190抗原保守区Ⅰ、Ⅴ基因的亚克隆及在大肠杆菌中高效表达

作者采用PCR方法克隆了我国海南省FCC1/HN株P190抗原两个保守区基因,分别定名为P190CRI和P190CRV。基因片段经纯化后连接到pUC18载体中进行DNA序列分析,结果显示:除了P190CRV中有5个碱基变换外,其余序列均与MAD20型序列一致。经序列分析的两个基因片段分别与pGEX-2T载体连接,经双酶切鉴定后转化感受态JM109(DE_3)大肠杆菌进行高效融合表达,并且用Sepharose 4B-谷胱甘肽层析柱进行亲和纯化,结果为:两个插入基因片段均得到高效融合表达,经一步亲和纯化后就取得高纯度的重组蛋白。     

细菌-酵母穿梭表达质粒pGBKT7-LMP1 的构建与鉴定

[目的]构建能在酵母中表达EBV潜伏膜蛋白1(LMPl)的穿梭表达质粒pGBKT7-LMP1.[方法]RT-PCR方法扩增EB病毒LMP1全外显子片段,利用DNA重组技术将其定向插人细菌-酵母穿梭质粒pGBKT7的T7启动子下游.[结果]限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT-PCR获得的LMP1 cDNA片段与GenBank中的数据完全吻合;LMP1准确克隆人pGBKT7的多克隆位点,未改变读码框架.[结论]成功构建了穿梭质粒pGBKT7-LMP1.     

大肠杆菌偏嗜性Osteostat胞外段编码基因的克隆

目的采用基因工程的手段研制人Osteostat胞外蛋白，通过大肠杆菌偏嗜性人Osteostat胞外段编码基因的克隆，为重组蛋白的研发作初步准备。方法按照氨基酸密码子的简并性原则将人Osteostat胞外段编码系列全部替换成大肠杆菌偏嗜性密码子，并将其分成三段扩增，再通过重叠延伸PCR将三个片段连接起来。然后，将回收的人Osteostat基因片段和pQE-30Xa表达载体相连，转化大肠杆菌感受态细胞，进行初步的诱导表达，表达产物行SDS-PAGE分析。结果通过重叠延伸PCR获得了大肠杆菌偏嗜性的编码序列，通过测序验证了其序列的正确性。对重组表达载体转化菌进行诱导表达，SDS-PAGE分析证实获得预期分子量的目标蛋白。结论大肠杆菌偏嗜性的人Osteostat胞外段编码基因表达载体的构建为重组蛋白的研发打下基础。     

菌液SYBR实时荧光PCR快速检测金黄色葡萄球菌

目的建立菌液SYBR荧光PCR法快速检测金黄色葡萄球菌的方法。方法根据金黄色葡萄球菌的特异基因耐热核酸酶nuc设计引物,PCR方法和SYBR荧光PCR溶解曲线法验证引物的特异性;建立菌液SYBR荧光PCR快速检测方法,奶粉加标实验和菌株特异性实验评价方法的特异性,制备基因组浓度梯度和菌落梯度检验方法的灵敏性。结果利用引物对实验室的3个标准菌株进行PCR扩增,出现的条带均为单一条带,且与目的片段长度一致。16株金黄色葡萄球菌菌株的熔解曲线均呈单峰,特异性良好,无非特异性扩增。建立的菌液SYBR荧光PCR方法对金黄色葡萄球菌有很好的特异性和灵敏性,灵敏度达1pg／山DNA浓度,并可检测1 CFU／ml的复杂样品。结论本研究建立的菌液SYBR荧光PCR方法快速、特异性好、灵敏性高,对快速检测样品中金黄色葡萄球菌有重要意义。     

CD3AK细胞冻融提取液的抗肿瘤活性研究

为研究ＣＤ３ＡＫ细胞冻融提取液的抗肿瘤作用,作者采集正常人外周血分离单个核细胞（ＰＢＭＣ）,先用抗ＣＤ３的单克隆抗体（ＣＤ３ＭｃＡｂ）的ｒＩＬ－２诱导和激活,使之成为ＣＤ３ＭｃＡｂ激活的杀伤细胞（ＣＤ３ＡＫ）,再制备ＣＤ３ＡＫ的冻融提取液,然后进行体内,外抗肿瘤实验。结果;低剂量的ＣＤ３ＭｃＡｂ和ｒＩＬ－２能明显诱导ＰＢＭＣ的活化和增殖;激活后的ＣＤ３ＡＫ细胞冻融提取液可抑制小鼠肝癌实体瘤细胞Ｈ２