5-氮杂-2′-脱氧胞苷逆转RASSF1A基因甲基化对人乳腺癌MCF-7细胞的影响

目的：探讨启动子甲基化对乳腺癌MCF-7细胞RASSF1A基因的作用及5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）干预对启动子甲基化的影响,为临床治疗乳腺癌奠定理论基础.方法：用1,3,5,7,9μmol/L不同浓度的5-Aza-CdR处理MCF-7乳腺癌细胞株,通过MTT检测5-Aza-CdR对MCF-7乳腺癌细胞株存活率的影响;建立5μmol/L,10μmol/L的浓度梯度流式细胞仪检测5-Aza-CdR对MCF-7乳腺癌细胞株生长周期及凋亡率的影响,MSP（甲基化PCR）检测5-Aza-CdR处理前后RASFF1A抑癌基因的甲基化状态,RT-PCR检测处理前后抑癌基因RASSF1A mRNA表达情况.结果：5-Aza-CdR抑制体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞,诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡和细胞周期停滞在G0/G1期,呈浓度依赖性.经5-Aza-CdR处理人乳腺癌MCF-7细胞后,MSP检测RASSF1A基因发生了甲基化,RT-PCR检测RASSF1A mRNA恢复了表达.结论：RASSF1A基因启动子甲基化是导致其失活的主要原因,5-Aza-CdR可以逆转乳腺癌细胞株MCF-7细胞RASSF1A基因启动子甲基化状态,使其重新表达．     

Effect of Antisense MBD1 Gene Eukaryotic Expression Plasmid on Expression of MBD1 Gene in Human Biliary Tract Carcinoma Cells

DNAmethylationhasavarietyofimportantfunctionsintheregulationofgeneexpression[1].ManystudiesdemonstratedthatthepathogenesisofbiliarytractcarcinomawascloselyassociatedwiththeaberrantDNAmethylationstatusoftumorrelatedgenes.TheaberrantstatusofDNAmethylationincludedthehypomethylationofonco genesandthehypermethylationoftumorsuppres sorgenes(TSG).IncreasingtheexpressionofTSGandimprovingthefunctionofTSGbyelimi natingitshypermethylationstatusmaybeanewwaytotreatbiliarytractcarcinoma.Toexplorether…     

5-Aza-CdR对人肝癌细胞RASSF1 A甲基化的影响

目的：探讨5-氮杂-2ˊ-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对人肝癌细胞RASSF1A基因启动子甲基化以及mRNA表达的影响。方法体外培养人肝癌细胞株SMMC-7721,分别用0.5、5.0、30.0、50.0μmol/L的5-Aza-CdR与之孵育72 h,甲基化PCR检测处理前后启动子甲基化水平,RT-PCR检测RASSF1A mRNA表达。结果随着药物浓度的增加,甲基化RASSF1A含量逐渐降低,而未甲基化产物逐渐增高;5-Aza-CdR处理后,RASSF1A mRNA的含量随之增高。结论5-Aza-CdR可逆转SMMC-7721细胞株细胞中基因甲基化修饰状态。     

人食管鳞癌细胞株中RIZ1基因启动子区甲基化状态的研究

目的:探讨6种人食管鳞癌细胞株KYSE150,KYSE510,TE13,EC9706,CaEs17和EC109中RIZ1基因启动子区的甲基化状态;观察特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR对存在甲基化的细胞株RIZ1基因的转录调控作用及其对该细胞生长增殖的影响。方法:甲基化特异PCR(MSP)法检测6种人食管鳞癌细胞株中RIZ1基因启动子区的甲基化状态;实时定量PCR法检测5-Aza-CdR处理前后RIZ1基因启动子区CpG岛高度甲基化的人食管鳞癌细胞株TE13中RIZ1 mRNA表达量的变化;MTT法检测5-Aza-CdR对TE13细胞生长增殖的影响。结果:(1)6种人食管鳞癌细胞株中TE13,CaEs17,EC109三株细胞RIZ1基因启动子区存在甲基化;(2)5-Aza-CdR处理细胞株TE13后,RIZ1 mRNA表达量上调;(3)5-Aza-CdR能抑制TE13的生长增殖,并随时间的延长和浓度的增加抑制作用变明显。结论:启动子区CpG岛高度甲基化是人食管鳞癌细胞株TE13 RIZ1基因表达沉默的重要原因;5-Aza-CdR能使TE13 RIZ1 mRNA表达上调;并能抑制TE13细胞的生长增殖,并呈时间和浓度依赖性。     

5-Aza-CdR体外诱导人肺癌细胞株p16基因去甲基化

目的观察人肺癌细胞株H719p16基因启动子区甲基化状态,并探讨去甲基化制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)诱导H719细胞株高甲基化失活的pl6基因重新表达的可能性。方法MSP法检测体外培养的人肺癌细胞株p16基因启动子区甲基化状态,并应用不同浓度的5-Aza-CdR处理人肺癌细胞株H719,MSP法检测用药后细胞中p16基因的甲基化状态,并用RT-PCR方法及Western Blot方法检测用药前后细胞中p16基因mRNA和蛋白水平变化。结果p16基因在人肺癌细胞株H719中启动子区呈甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,p16基因启动子区呈去甲基化状态,并且其mRNA及蛋白恢复表达。结论启动子区异常甲基化是人肺癌细胞株p16基因失活的可能原因,5-Aza-CdR能逆转p16基因甲基化状态。     

Relationship between the Expression of RASSF1A Protein and Promoter Hypermethylation of RASSF1A Gene in Bladder Tumor

To investigate the relationship between the expression of RASSF1A protein and promoter hypermethylation of RASSF1A gene, RASSF1A protein expression was measured by Western blotting in 10 specimens of normal bladder tissues and 23 specimens of bladder transitional cell carcinoma （BTCC）. The promoter methylation in BTCC and normal bladder tissues was detected by methylation-specific PCR （MSP）. The results showed that the expression level of RASSF1A protein was significantly lower in BTCC tissues than that in normal bladder tissues. However, it was not correlated with its clinical stages and pathological grades. The frequency of promoter methylation of RASSF1A gene was higher in BTCC tissues than that in normal bladder tissues. In 14 patients with the aberrant promoter methylation, 13 showed loss or low expression of RASSF 1A protein. It is concluded that RASSF1A gene promoter methylation may contribute to the low level or loss of RASSF1A protein expression, the inactivation of RASSF1A gene and the genesis of BTCC. But, it may bear no correlation with its clinical stages and pathological grades.     

５ 氮杂 ２′ 脱氧胞苷诱导肝癌细胞株ＳＬＩＴ２基因去甲基化的实验研究

目的：观察肝细胞癌（HCC）细胞株SUN449、BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B及epG2中SLIT2基因在5-Aza-CdR作用后,其启动子区甲基化状态及表达的变化,探讨HCC细胞株中SLIT2基因调控规律及甲基化调节抑制剂5-Aza-CdR对SLIT2基因转录的影响。方法对上述 HCC 细胞株体外培养,MSP法检测 HCC 细胞株中 SLIT2启动子相关区域的甲基化状况。应用10 mmol／L浓度的5-Aza-CdR处理体外培养的5种HCC细胞后,MSP法检测用药前后细胞中SLIT2基因的甲基化状态,RT-PCR法检测用药前后细胞中SLIT2 mRNA的变化。结果 SLIT2基因在各细胞株中启动子区呈异常高甲基化状态,mRNA低表达。经过5-Aza-CdR处理后,SLIT2基因启动子区呈显著去甲基化状态,其mRNA表达增强。结论启动子区异常甲基化是HCC细胞SLIT2基因失活的主要原因之一,去甲基化制剂5-Aza-CdR能逆转SLIT2基因甲基化状态,从而调控SLIT2基因表达。     

地西他滨对裸鼠子宫内膜癌移植瘤的作用及机制研究

目的 探究去甲基化药物地西他滨对裸鼠子宫内膜癌移植瘤的作用及其机制。方法 建立子宫内膜癌裸鼠移植瘤模型后随机分为地西他滨组（AZA组）、顺铂组（DDP组）、醋酸甲羟孕酮组（MPA组）、AZA+DDP组、AZA+MPA组、DDP+MPA组、模型组,每组3只,各实验组给予相应药物（1 μg/g单用或各1 μg/g联合）,模型组给予生理盐水,每3 d一次尾静脉注射给药,共给药8次。处理后观察各组裸鼠瘤体生长情况;取出瘤体后,计算抑瘤率;采用甲基化特异性PCR（MSP）、Western blot和TUNEL染色法分别检测移植瘤组织细胞中RASSF1A基因启动子区域甲基化状态、蛋白表达及肿瘤细胞的凋亡情况。结果 AZA+DDP组抑瘤率最高,而AZA组抑瘤率最低。AZA组、AZA+DDP组、AZA+MPA组RASSF1A基因启动子区域甲基化水平明显降低,显示明显的非甲基化条带,其余组则主要显示甲基化条带。AZA组、AZA+DDP组、AZA+MPA组这三组之间RASSF1A蛋白的表达量差异无统计学意义（P>0.05）,但均高于模型组（P<0.05）;DDP组、MPA组、DDP+MPA组与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。凋亡指数为模型组<3个单药组<3个联合用药组（P<0.05）。结论 地西他滨可逆转内膜癌中RASSF1A基因启动子区域的异常甲基化,恢复RASSF1A蛋白生物学功能,增强DDP与MPA的药效,对临床子宫内膜癌的治疗有很大的潜在应用价值。     

应用BSP联合TA克隆测序检测胰腺癌中RASSF1A基因启动子区异常甲基化

目的:检测Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)在胰腺癌细胞株中的甲基化和表达状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病过程中的作用?方法:采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)联合TA克隆测序检测胰腺癌细胞株PANC-1及胰腺癌组织?癌旁组织及正常胰腺组织中RASSF1A启动子区CpG岛的甲基化状态,以甲基化酶抑制剂5-aza-2-deoxycitydine(5-aza-dC)处理PANC-1,观察处理前后甲基化率变化情况,逆转录PCR观察RASSF1A 的mRNA表达情况?结果:在PANC-1细胞中RASSF1A启动子的甲基化率平均为100.00%,在正常胰腺?癌旁及癌组织中平均分别为1.79%?93.75%和100.00%,与正常胰腺组织相比,胰腺癌旁及癌组织的RASSF1A启动子甲基化率明显增高(P < 0.01),而癌旁及癌组织之间无明显差异(P > 0.05)?在PANC-1细胞?胰腺癌组织及癌旁组织中RASSF1A基因无表达,在正常胰腺组织中RASSF1A基因呈阳性表达;PANC-1细胞经5-aza-dC处理后,RASSF1A的甲基化率下降(88.89%,P < 0.05),mRNA表达无变化?结论:胰腺癌细胞株PANC-1及癌组织?癌旁组织RASSF1A基因表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化导致PANC-1中RASSF1A基因的表达沉默?该基因异常甲基化有望成为胰腺癌的早期诊断指标和治疗靶点?     

食管癌细胞中T钙黏蛋白基因启动子区异常甲基化的研究

目的 探讨食管癌细胞中T钙黏蛋白( T-cadherin)基因启动子区甲基化状态,以及5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)作用对食管癌细胞生长、侵袭以及T-cadherin基因甲基化状态与表达的影响.方法 采用甲基化特异性PCR分析经5-Aza-CdR处理前后食管癌细胞EC1和EC109中T-cadherin启动子甲基化状态,Western印迹检测经5-Aza-CdR处理前后两种细胞中T-cadherin蛋白表达,以MTT比色法与侵袭实验测定细胞增殖与侵袭能力的变化.结果 EC1和EC109细胞中T-cadherin基因启动子区域存在异常甲基化现象,经5-Aza-CdR作用后可逆转启动子异常甲基化,显著上调食管癌细胞中T-cadherin的蛋白表达,同时显著抑制肿瘤细胞的增殖与侵袭能力(P＜0.01).结论 启动子区异常甲基化是导致食管癌细胞中T-cadherin表达水平下调的重要机制,应用5-Aza-CdR可恢复T-cadherin表达并抑制肿瘤细胞的恶性表型.     

DNA修复相关基因启动子甲基化和肿瘤化疗耐药的进展

肿瘤细胞DNA修复能力与化疗药物敏感性密切相关,而DNA启动子甲基化可导致DNA修复相关基因转录失活、基因沉默、蛋白表达量改变等影响DNA的修复能力,继而导致肿瘤对化疗药物的固有性或获得性耐药。该文着重阐述DNA修复相关基因O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）、人类mut1同源物（hMLH1）和范科尼贫血互补基团F （FANCF）启动子甲基化与肿瘤化疗耐药之间的关系。     

食管癌组织RASSF1A的表达及其与基因启动子甲基化的关系

目的探讨RASSF1A表达及其基因启动子甲基化在食管癌发生中的作用。方法取40例食管癌患者肿瘤组织及癌旁组织,用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测RASSF1A的mRNA表达,用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测RASSF1A基因启动子的甲基化。结果 RASSF1A mRNA在食管癌组织、癌旁组织表达缺失率分别为77.5%（31/40）、2.5%（1/40）,差异有统计学意义（P〈0.05）。癌旁组织均未发现甲基化,而癌组织中甲基化率为67.5%（27/40）。所有甲基化的食管癌组织RASSF1A mRNA表达缺失。结论食管癌的发生与RASSF1A基因表达缺失有关联,而RASSF1A基因启动子区甲基化是RASSF1A基因表达缺失的原因。     

EGCG抑制卵巢癌细胞RASSF1A基因甲基化并上调其表达

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对卵巢癌细胞系A2780Ras相关区域家族1基因（RASSFl）甲基化及其表达的影响。方法体外培养A2780细胞,用0、10、30和50μmol／LEGCG与A2780细胞孵育24-72h,采用甲基化特异性PCR（MSP）检测RASSFlA基因启动子区域的甲基化改变情况;提取EGCG处理后A2780细胞的RNA,用逆转录PCR（RT-PCR）检测RASSFlA的表达水平。结果静息状态下,MSP结果显示A2780细胞可检测出RASSFlA基因启动子区域有明显的甲基化条带,当与50μmol／LEGCG孵育72h后,甲基化水平有所减弱,而非甲基化基因增多。RT-PCR显示EGCG呈剂量和时间依赖性地促进A2780细胞RASSFlA基因mRNA和蛋白表达。结论EGCG能使RASSFlA基因去甲基化,并上调其非甲基化基因和蛋白的表达水平,这可能是其抗肿瘤的奄耍机制。     

甲基化调控microRNA表达影响胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的研究

目的 研究基因启动子区甲基化对胰腺癌相关microRNA（miR34a、miR34b、miR148a、miR203a）表达水平的调控,及其对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。方法 通过5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR)去甲基化处理胰腺癌细胞MIAPaca-2,使用甲基化特异性PCR (methylation-specific PCR,MSP)法检测60 μmol/L 5-Aza-CdR处理组及0 μmol/L对照组 MIAPaca-2细胞目标microRNA启动子甲基化水平的变化;用荧光实时定量PCR检测处理组及对照组目标microRNA表达水平的改变;CCK-8法、划痕实验以及Transwell法检测胰腺癌细胞去甲基化处理后处理组和对照组增殖、迁移、侵袭能力的变化。结果 MSP法结果显示处理组较未处理组目标microRNA甲基化M条带灰度值减弱,非甲基化U条带灰度值增强,处理组目标microRNA启动子甲基化程度较对照组减弱。荧光实时定量PCR结果显示处理组较未处理组目标microRNA相对表达量升高（ P<0.05）,处理组microRNA的表达水平随去甲基化处理而升高。CCK-8法显示随着药物处理浓度的增加,处理组细胞抑制率增高,去甲基化处理抑制了胰腺癌细胞的增殖能力。划痕实验结果显示处理组较未处理组细胞伤口愈合率降低（ P<0.01）,去甲基化处理降低了胰腺癌细胞的迁移能力。Transwell法结果显示处理组较未处理组穿膜细胞数减少（ P<0.01）, 去甲基化处理降低了胰腺癌细胞的侵袭能力。结论 肿瘤细胞去甲基化处理,导致4种目标microRNA高表达,抑制了胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。     

人子宫内膜癌细胞株HEC-1-B中RASSF1A基因的甲基化及其表达

目的:研究Ras相关结构域家族1A基因(RASSF1A)启动子区域在子宫内膜癌细胞株HEC-1-B中的甲基化状态及其与RASSF1A基因表达的关系。方法:采用甲基化特异性PCR(Methylation specialPCR,MSP)技术检测HEC-1-B细胞RASSF1A基因甲基化状态;采用逆转录PCR(RT-PCR)技术检测HEC-1-B细胞RASSF1A mRNA表达;并观察去甲基化药物5-杂氮脱氧胞苷(5-Aza-CdR)作用后RASSF1A基因甲基化状态和RASSF1A mRNA表达。结果:子宫内膜癌细胞株HEC-1-B存在RASSF1A高甲基化,RASSF1A mRNA表达缺失或低表达。结论:子宫内膜癌细胞株HEC-1-B中的RASSF1A基因启动子区域DNA存在高甲基化,可能在子宫内膜癌的发生发展中起作用。     

5－氮杂－2′－脱氧胞苷对肺癌 SPC －A －1细胞RAR －β基因去甲基化及其表达的作用

目的：观察5－氮杂－2′－脱氧胞苷（5－Aza－CdR）对肺腺癌SPC－A－1细胞视黄酸受体β（ RAR－β）基因甲基化状态的影响,探讨不同浓度5－Aza－CdR对RAR－β基因表达缺陷的调控机制。方法将体外培养的人肺腺癌SPC－A－1细胞株分为4组,分别是A组（未加药）及B、C、D组（分别加入3、6、12μmol／L的5－Aza－CdR）。采用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测4组细胞RAR－β基因甲基化状态的差异,RT－PCR法检测4组细胞RAR－βmRNA表达水平的差异,Western blot检测4组细胞RAR－β蛋白表达水平的差异,流式细胞仪技术检测各组细胞周期及细胞凋亡率的差异。结果 A组标本检测出RAR－β基因为甲基化状态,而B、C、D组均检测出RAR－β为去甲基化状态。肺腺癌SPC－A－1细胞RAR－βmRNA及RAR－β蛋白表达水平低下,经5－Aza－CdR处理后,其表达水平明显增强（P＜0．01）。5－Aza－CdR处理后（B、C、D组）的细胞凋亡率均较A组明显提高,差异有统计学意义（ P＜0．01）。结论肺癌RAR－β基因因甲基化出现表达缺陷,5－Aza－CdR具有明显去甲基化作用,可诱导RAR－β基因重新激活表达,促进肺癌细胞凋亡及抑制癌细胞增殖,从而发挥抗癌作用。