分泌抗重组葡激酶单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

目的 建立分泌抗重组葡激酶（r-SAK)单克隆抗体杂交瘤细胞株。方法 采用3种方法以r-SAK免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞做细胞融合。结果 经筛选和克隆化后获得10株抗r-SAK单克隆抗体杂交瘤细胞。结论 建立的分泌抗r-SAK单克隆抗体杂交瘤细胞株具有高度特异性，在r-SAK的研制中有很高的应用价值。     

抗苗勒管激素的单克隆抗体制备与鉴定

目的表达高纯度的抗苗勒管激素蛋白,以该蛋白作为抗原制备单克隆抗体,并鉴定抗体亚型,为进一步开发优质的抗苗勒管激素诊断试剂盒做技术储备。方法在表达载体pET-28a(+)质粒中接入经密码子优化的抗苗勒管激素基因(AMH)片段,转化于BL21细菌中,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白大量表达,对上清中可溶性蛋白进行纯化。使用SDS-PAGE分析纯化蛋白的纯度。经纯化的抗原蛋白3次皮下免疫小鼠,挑选产生高效价的抗体的小鼠,取其脾细胞,制备悬液。经细胞杂交技术与骨髓瘤细胞进行融合,筛选能稳定持久分泌抗AMH抗体的杂交瘤细胞株,并制备腹水抗体。通过亲和层析技术、BCA蛋白检测方法等测定手段,纯化抗体、检测抗体浓度。结果筛选到2株能持久分泌抗AMH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为克隆细胞株3F6和4E7,分泌抗体均为IgG1亚型。结论筛选出稳定分泌高纯度的抗苗勒管激素抗体的2株杂交瘤细胞,并制备单克隆抗体。下一步将其应用于AMH检测试剂盒的开发。     

2型登革病毒NS1蛋白单克隆抗体的生物学特性研究

目的制备抗2型登革病毒NSl蛋白的单克隆抗体（mAb），并鉴定其特性。方法以重组NS1蛋白免疫Balb／c小鼠，采用杂交瘤技术制备抗M蛋白的mAb，采用间接ELISA方法和Westernblot进行mAb特异性鉴定；同时采用间接ELISA方法鉴定mAb相对亲和力。结果获得9株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞Ⅲ1A6andU13D2；相对亲和力均在10^6以上。Westernblot显示9株mAb能特异识别重组NS1蛋白。结论成功地制备出抗登革病毒2型病毒NS1蛋白的9株mAb，为建立快速特异检测登革病毒的实验方法提供了有力的工具。     

利用荧光免疫层析技术检测新冠病毒IgG抗体

目的 建立新冠病毒IgG抗体的快速检测方法.方法 制备并纯化重组新冠病毒N蛋白,将获得的重组N蛋白免疫家兔,获得多克隆抗体.将鼠抗人IgG单克隆抗体和兔抗新冠病毒N蛋白多克隆抗体分别喷于硝酸纤维素膜的检测线和控制线,用重组N蛋白标记荧光纳米颗粒作为标记抗原,建立荧光免疫层析方法.结果 重组新冠病毒N蛋白经表达纯化后,纯...     

H7N9禽流感病毒血凝素线性B细胞抗原表位单克隆抗体的制备和鉴定

目的研制用于H7N9禽流感病毒诊断的血凝素线性B细胞抗原表位单克隆抗体。方法采用H7N9禽流感病毒血凝素特异性线性B细胞抗原表位免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术和间接ELISA法筛选、鉴定获得稳定分泌抗H7N9禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株;通过SDS-PAGE、间接ELISA和斑点免疫印迹技术鉴定其亚型、效价、纯度等生物学特征。结果共获得2株单克隆抗体(7C8H8和8E9E2),其中7C8H8抗体亚类为IgG2a,腹水抗体效价>1∶512000,且可以特异性结合H7N9禽流感病毒血凝素。8E9E2仅具有较低的H7N9禽流感病毒血凝素蛋白结合力。结论获得1株可分泌高效价、高特异性的抗H7N9禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株7C8H8。     

结核分枝杆菌Rv3428c重组蛋白表达与纯化及其单克隆抗体的制备

目的 制备并鉴定Rv3428c的单克隆抗体，为结核分枝杆菌快速特异性抗原检测奠定基础。方法 同源重组得到pET28a-Rv3428c表达载体，转入E.coli BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达，用Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白。重组蛋白免疫小鼠后进行细胞融合，间接ELISA、Western Blot筛选阳性杂交瘤细胞系，以筛选获得的阳性杂交瘤细胞诱导小鼠产生腹水，蛋白A亲和层析法纯化抗体，BCA法测定浓度，ELISA和SDS-PAGE进行单克隆抗体的鉴定及亚型和效价的测定。结果 成功构建pET28a-Rv3428c表达载体、表达并纯化出目的蛋白。Rv3428c蛋白免疫小鼠使小鼠产生致敏B淋巴细胞，在聚乙二醇作用下，淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。筛选得到的阳性杂交瘤细胞株，通过体内诱生法制备获得Rv3428c单克隆抗体。该单抗属于IgG2a亚类，κ型轻链，效价约为1∶128 000,浓度为4 mg/ml。结论 本研究制备并纯化了Rv3428c重组蛋白，获得了抗Rv3428c单克隆抗体，为Rv3428c用于结核分枝杆菌快速特异性抗原检测奠定基础。     

胸腺肽α1单克隆抗体的制备及其鉴定

目的:研制胸腺肽α1(Tα1)单克隆抗体，为Tα1作用机制的阐明奠定基础。方法:用戊二醛将Tα1和牛血清白蛋白进行交联，以其交联物为抗原，按常规淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体，并采用间接酶联免疫吸附(ELISA)法和Western免疫印迹来鉴定单克隆抗体的特异性。结果:建立了分泌抗Tα1抗体的杂交瘤细胞株，能特异性地与Tα1结合，但与单纯牛血清白蛋白、酵母抽提物和转染Tα1酵母未诱导表达产物无反应。其抗体效价为1：10240，Ig亚类为IgG2b。结论：本研究建立了针对Tα1高效价、高特异性单克隆抗体细胞株。     

具备中和中东呼吸综合征冠状病毒活性的单克隆抗体的制备

目的制备并鉴定对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)具有中和活性的单克隆抗体,为进一步开展MERS-CoV感染与免疫保护机制研究,以及发展诊断与治疗手段奠定基础。方法 MERS-CoV S蛋白受体结合区与人IgG Fc片段融合表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过ELISA筛选出阳性克隆,随后通过多次亚克隆筛选出稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单抗腹水并进行抗体效价测定及亚类鉴定;通过MERS-CoV假病毒及活病毒中和试验筛选出中和单抗。结果获得了10株能够稳定分泌抗原特异性单抗的杂交瘤细胞株。制备的腹水单抗亚类均为IgG1;其中7株单抗抗体ELISA效价达到10 000以上,并有1株单抗对MERS-CoV具有良好的中和活性。结论本研究获得了1株对MERSCoV具有良好中和活性的单克隆抗体。     

对氧磷单克隆抗体的研制及鉴定

重氮化法使对氧磷（Ｅ６００）与牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、血蓝蛋白偶合合成人工抗原。用人工抗原Ｅ６００－ ＢＳＡ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,然后将ＳＰ２／０小鼠骨髓瘤细胞和Ｅ６００－ ＢＳＡ免疫的Ｂａｌｂ／ｃ小鼠脾脏细胞融合,成功的建立了能分泌抗对氧磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株。并分析了该细胞株的染色体及对其产生的单克隆抗体的类型、特异性、亲和力进行了鉴定和检测。上述杂交瘤细胞连续传代或冻存１０周,其分泌抗体水平稳定     

酶联免疫吸附试验间接抗体夹心检测SARS-CoV抗原方法的建立和应用

目的制备和鉴定严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳(N)蛋白单克隆抗体(rnAb)和多克隆抗体建立SARS—CoVN抗原捕获抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)方法用于SARS-CoV感染的早期诊断。方法用基因重组SARS-CoV N蛋白免疫BALB/c小鼠和新西兰大白兔制备mAb和多克隆抗体，采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定，用单克隆抗体与兔多克隆抗体进行配对试验，建立抗原捕获抗体夹心ELISA法测定SARS-CoV N抗原。结果获得9株特异性针对SARS-CoV N蛋白的mAb和高效价的兔多克隆抗体，通过高亲和力的mAb与兔多抗的配对试验，筛选出3株单抗N1E8、N8E1和N10E4混合作为捕获抗体，与兔多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG组合作为测定抗体，建立了抗体夹心ELISA法，测定重组SARS-CoV N蛋白最高灵敏度为50pg／ml，特异性达99．86％，测定420份血清学确诊的SARS患者血清，其中发病1—10天阳性检出率为90.1％，11—20天检出率为23％，21天以上均为阴性，与其他呼吸道病毒和冠状病毒无交叉反应。结论获得特异性好、亲和力高的单克隆抗体和高效价的兔多克隆抗体，经过抗体的配对和优化，建立了一种灵敏度高、特异性强的SARS-CoV抗原的ELISA捕捉法．可应用于SARS早期诊断、溯源及流行病学研究。     

三种不同原理的间接酶联免疫吸附试验方法在严重急性呼吸道综合征诊断中的比较研究

目的比较不同原理的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法在严重急性呼吸道综合征(Severeacuterespirato-rysyndrome,SARS)诊断中的应用,以便研制开发更先进的诊断试剂,应对可能发生的SARS再次流行。方法对山西省疾病预防控制中心(CDC)送检的正常成年人血清标本44份,首都医科大学附属宣武医院住院SARS患者血清标本62份,宁夏回族自治区CDC送检SARS患者及疑似患者血清28份,分别采用三种不同原理的间接ELISA试剂进行抗体检测:①美国CDC采用全病毒灭活抗原包被,检测血清IgA、IgM、IgG抗体的试剂;②国内某公司采用全病毒灭活抗原包被,检测血清IgG及IgM抗体试剂;③基因工程表达并纯化刺突蛋白(spikeprotein,S蛋白)和核衣壳蛋白(nucleocapsidprotein,N蛋白)抗原包被,检测血清中IgM及IgG抗体的试剂。结果通过比较研究显示:试剂①与试剂③的特异性较高,3种试剂的敏感性有较高的一致性。结论由于全病毒裂解抽提液作包被抗原其生产过程存在生物安全隐患,要求条件高,所以基因工程表达并纯化的蛋白来制备SARS冠状病毒抗体检测试剂有自身的优越性。由于N蛋白具有较强的免疫原性,在各毒株之间的变异又很小,因此以体外基因重组N蛋白代替全病毒裂解液蛋白,是SARS抗体检测试剂的发展方向。     

SARS患者7年随访血清抗体变化规律及胃肠道免疫组化研究

目的 连续7年随访严重急性呼吸综合征(SARS)患者血清特异性IgM、IgG及N蛋白抗体滴度变化,应用胃肠镜观察胃肠道的病理改变并进行免疫组织化学研究.方法 应用免疫荧光(IFA)和双抗原夹心ELISA方法,对SARS患者发病1年后采用每隔1年检测一次血清SARS病毒(SARS-CoV)特异性IgM、IgG及N蛋白抗体滴度;用抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体对SARS恢复期患者胃肠道组织进行免疫组化研究.结果 14例SARS患者特异性IgG抗体1年后平均滴度为1/71(95%CI:1/58～1/85),连续追踪7年呈下降趋势,7年后大部分患者IgG抗体滴度消失,特异性IgM抗体1年后消失,N蛋白抗体1年后平均滴度为1/146(95%CI:1/122～1/171),与IgG抗体变化同时呈下降趋势.7年后其中9例患者检测N蛋白抗体全部为阴性,另5例临床症状较重的患者,N蛋白抗体仍检测阳性,其中3例N蛋白抗体滴度维持在1/156～1/210之间,2例N蛋白抗体滴度接近正常.该5例患者行胃肠镜检测和细胞免疫组化试验,血中N蛋白抗体检测阳性的3例患者胃组织黏液腺上皮细胞免疫组化呈阳性表达,大部呈胞浆着色.其中1例患者在肠组织浆液柱状上皮及间质细胞亦有表达,另2例血清N蛋白抗体检测接近正常的患者,细胞免疫组化为阴性.5例患者病理活检:1例明确诊断为"胃印戒细胞癌并直肠多发转移"、1例"胃息肉"、1例"浅表性胃窦炎",其余2例正常.结论 SARS患者血清特异性IgM、IgG、N蛋白抗体在恢复期呈下降趋势,7年后大部分消失;N蛋白抗体变化规律与病情轻重程度有关.     

SARS患者7年随访血清抗体变化规律及胃肠道免疫组化研究

目的 连续7年随访严重急性呼吸综合征(SARS)患者血清特异性IgM、IgG及N蛋白抗体滴度变化,应用胃肠镜观察胃肠道的病理改变并进行免疫组织化学研究.方法 应用免疫荧光(IFA)和双抗原夹心ELISA方法,对SARS患者发病1年后采用每隔1年检测一次血清SARS病毒(SARS-CoV)特异性IgM、IgG及N蛋白抗体滴度;用抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体对SARS恢复期患者胃肠道组织进行免疫组化研究.结果 14例SARS患者特异性IgG抗体1年后平均滴度为1/71(95%CI:1/58～1/85),连续追踪7年呈下降趋势,7年后大部分患者IgG抗体滴度消失,特异性IgM抗体1年后消失,N蛋白抗体1年后平均滴度为1/146(95%CI:1/122～1/171),与IgG抗体变化同时呈下降趋势.7年后其中9例患者检测N蛋白抗体全部为阴性,另5例临床症状较重的患者,N蛋白抗体仍检测阳性,其中3例N蛋白抗体滴度维持在1/156～1/210之间,2例N蛋白抗体滴度接近正常.该5例患者行胃肠镜检测和细胞免疫组化试验,血中N蛋白抗体检测阳性的3例患者胃组织黏液腺上皮细胞免疫组化呈阳性表达,大部呈胞浆着色.其中1例患者在肠组织浆液柱状上皮及间质细胞亦有表达,另2例血清N蛋白抗体检测接近正常的患者,细胞免疫组化为阴性.5例患者病理活检:1例明确诊断为"胃印戒细胞癌并直肠多发转移"、1例"胃息肉"、1例"浅表性胃窦炎",其余2例正常.结论 SARS患者血清特异性IgM、IgG、N蛋白抗体在恢复期呈下降趋势,7年后大部分消失;N蛋白抗体变化规律与病情轻重程度有关.     

SARS患者7年随访血清抗体变化规律及胃肠道免疫组化研究

目的 连续7年随访严重急性呼吸综合征(SARS)患者血清特异性IgM、IgG及N蛋白抗体滴度变化,应用胃肠镜观察胃肠道的病理改变并进行免疫组织化学研究.方法 应用免疫荧光(IFA)和双抗原夹心ELISA方法,对SARS患者发病1年后采用每隔1年检测一次血清SARS病毒(SARS-CoV)特异性IgM、IgG及N蛋白抗体滴度;用抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体对SARS恢复期患者胃肠道组织进行免疫组化研究.结果 14例SARS患者特异性IgG抗体1年后平均滴度为1/71(95%CI:1/58～1/85),连续追踪7年呈下降趋势,7年后大部分患者IgG抗体滴度消失,特异性IgM抗体1年后消失,N蛋白抗体1年后平均滴度为1/146(95%CI:1/122～1/171),与IgG抗体变化同时呈下降趋势.7年后其中9例患者检测N蛋白抗体全部为阴性,另5例临床症状较重的患者,N蛋白抗体仍检测阳性,其中3例N蛋白抗体滴度维持在1/156～1/210之间,2例N蛋白抗体滴度接近正常.该5例患者行胃肠镜检测和细胞免疫组化试验,血中N蛋白抗体检测阳性的3例患者胃组织黏液腺上皮细胞免疫组化呈阳性表达,大部呈胞浆着色.其中1例患者在肠组织浆液柱状上皮及间质细胞亦有表达,另2例血清N蛋白抗体检测接近正常的患者,细胞免疫组化为阴性.5例患者病理活检:1例明确诊断为"胃印戒细胞癌并直肠多发转移"、1例"胃息肉"、1例"浅表性胃窦炎",其余2例正常.结论 SARS患者血清特异性IgM、IgG、N蛋白抗体在恢复期呈下降趋势,7年后大部分消失;N蛋白抗体变化规律与病情轻重程度有关.     

间接免疫荧光抗体试验在传染性非典型肺炎诊断中的应用

目的：评价应用间接免疫荧光抗体试验(IFA)在传染性非典型肺炎[严重急性呼吸综合征(SARS)]诊断中的可靠性，探讨SARS患者发病后血清抗体在体内的产生规律。方法：采用IFA方法检测不同发病时间的临床确诊SARS病例、疑似病例和其他人群的血清SARS病毒抗体，同时对每一个研究对象采用调查表进行一般情况调查。结果：在发病10天内，SARS患者血清IgG阳性率为55.1％，IgM阳性率为16．3％；发病10天后SARS患者IgG阳性率达89．8％，IgM阳性率达65．3％；发病25天以后SARS患者IgG、IgM阳性率均为90．9％。对发病时间与抗体阳性率采用趋势x^2检验，结果：显示SARS患者血清IgG、IgM抗体阳性率随着发病时间而上升(IgG趋势检验x^2＝16．376，P＝0．00005；IgM趋势检验x^2＝28．736，P＝0．000 00)。IFA法用于检测SARS患者发病10天后血清抗体，结果：显示灵敏度、特异度及与临床诊断的符合率均在90％以上。结论：IFA法适于SARS发病10天后作为实验室辅助诊断方法。     

The development of vaccines against SARS corona virus in mice and SCID-PBL/hu mice

We have investigated to develop novel vaccines against SARS CoV using cDNA constructs encoding the structural antigen; spike protein (S), membrane protein (M), envelope protein (E), or nucleocapsid (N) protein, derived from SARS CoV. Mice vaccinated with SARS-N or -M DNA using pcDNA 3.1(+) plasmid vector showed T cell immune responses (CTL induction and proliferation) against N or M protein, respectively. CTL responses were also detected to SARS DNA-transfected type II alveolar epithelial cells (T7 cell clone), which are thought to be initial target cells for SARS virus infection in human. To determine whether these DNA vaccines could induce T cell immune responses in humans as well as in mice, SCID-PBL/hu mice was immunized with these DNA vaccines. As expected, virus-specific CTL responses and T cell proliferation were induced from human T cells. SARS-N and SARS-M DNA vaccines and SCID-PBL/hu mouse model will be important in the development of protective vaccines.     

非典型肺炎患者免疫结果的分析

目的通过检测非典型肺炎患者血清10项免疫指标,探讨其临床意义。方法采用金标法测定肺炎衣原体IgM和军团菌IgM,明胶凝集法测定肺炎支原体IgM,酶联免疫法测定腺病毒IgM、免疫比浊法测定免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、补体C3、C4和C-反应蛋白。结果 68例非典型肺炎患者,肺炎衣原体IgM阳性率为7．35％;军团菌IgM阳性率为2．94％;腺病毒IgM阳性率为1．47％;肺炎支原体IgM漓度1:80-1:640阳性率为36．76％;C-反应蛋白阳性率为86．76％;IgA、IgM和C3均值明显高于正常人组。结论血清10项免疫指标的检测对非典型肺炎患者的诊治,具有一定的临床意义。     

间接免疫荧光法在检测SARS冠状病毒特异性抗体中的应用

目的 利用间接免疫荧光技术(IFA)建立SARS冠状病毒(SARS—CoV)特异性抗体血清学诊断方法。方法 采用组织培养技术，用SARS病人的咽漱液样本，在Vero—E6细胞中培养，分离SARS冠状病毒；用已制备的SARS病毒抗原片与临床确诊为SARS的病人双相血清和正常人对照血清作用，再用荧光标记羊抗人IgM/IgG抗体与之结合，在荧光显微镜下观察荧光图像。结果 通过建立检测SARS冠状病毒特异性抗体的间接免疫荧光方法，在44份SARS临床病例标本中，检出IgG抗体阳性3l份，与临床诊断符合率为70．45％。31份IgG阳性者的急性期血清中IgM检出率为38．70％，IgM最早产生于发病第3天，发病7d以上的6例的IgM抗体均为阳性，滴度在发病12～15d达到高峰(1：80)；恢复期血清中IgG抗体最早产生于发病第8天，滴度在发病15～20d达到高峰(1：320～1：640)。97份正常人的血清标本中IgG抗体阳性率为3．09％，IgM抗体为阴性。结论 利用此方法，证实被SARS冠状病毒感染后，在机体中产生有特异性的IgM／IgG抗体；本方法检测结果与临床诊断符合率较高，可以用于早期临床诊断SARS病毒感染和辅助临床做出鉴别诊断。     

四川省首起传染性非典型肺炎病例的病原学及血清学研究

目的：对四川省首起传染性非典型肺炎病例病原学及血清学进行研究。方法：病原分离及血清学检测。结果：细胞及鸡胚培养未分离到相应病原；病例甲、病例乙的SARS冠状病毒IgM和IgG抗体阳性，病例丙的肺炎衣原体IgM抗体阳性。结论：两例患者为SARS冠状病毒感染，另一例可能合并肺炎衣原体感染。