血链球菌与牙周可疑致病菌混合培养研究──Ⅱ．扫描电镜观察和电子探针应用分析

运用扫描电镜技术分析血链球菌与牙周可疑致病菌混合培养的形态学变化。结果显示血链球菌能与牙周可疑致病菌中的长杆菌如具核梭杆菌、生痰二氧化碳噬纤维菌相互凝集形成玉米棒状结构，与短杆菌如牙龈紫质单胞菌、中间普氏菌、伴放线放线杆菌相互凝集。运用电子探针技术分析细菌细胞膜的离子变化，显示血链球菌与牙周可疑致病菌混合培养时，血链球菌细胞在离子无变化，牙周可疑致病菌细胞膜离子发生变化，钙、磷离子浓度降低，提示血链球菌抑制牙周可疑致病菌的机理与细胞的通透性改变有关。     

应用电化学测菌法检测牙龈卟啉单胞菌的初步研究

目的:探讨应用电化学测菌法检测牙龈卟啉单胞菌的可行性。方法:应用电化学阻抗谱方法测量去离子水溶液中特定细菌(牙龈卟啉单胞菌)的电化学阻抗,获得针对特定细菌的敏感阻抗谱,建立特定频率下细菌浓度与系统交流阻抗值之间的函数关系,依据函数关系和测得的电化学阻抗值分析待检样品内特定细菌的浓度。结果:当频率低于104Hz时,系统的交流阻抗值随去离子水溶液中牙龈卟啉单胞菌浓度的增加而减小;当设定频率为1.2 kHz、待测细菌(牙龈卟啉单胞菌)浓度为103～109/mL时,牙龈卟啉单胞菌浓度C的对数与系统阻抗值Z呈良好的线性关系(R2=0.98),logC(细胞数/mL)=-0.007 Z(kΩ)+10.792;单一浓度检测用时约40 m in。结论:基于电化学阻抗原理的电化学测菌法有可能成为简便、快速检测牙周致病菌的新方法。     

慢性牙周炎唾液牙龈卟啉单胞菌的定量PCR检测

目的:定量检测慢性牙周炎患者、牙周健康人群唾液中牙龈卟啉单胞菌的含量,比较其在各组人群分布的差异。方法:应用SYBR Green模式的实时荧光定量PCR技术,针对Pg特异基因Arg-gingipain设计引物,检测20例慢性牙周炎和20例牙周健康者唾液内Pg的含量,t检验分析比较在各组人群中Pg定植的差异。结果:慢性牙周炎患者唾液中,Pg的检出数目为(1.78×10³~1.99×10⁵),检出率为85%;牙周健康者唾液中,Pg的检出数目为(2.19×10³~2.30×10³),检出率为10%。Pg在慢性牙周炎和牙周健康者唾液中检出数目和检出率的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:慢性牙周炎唾液中,牙龈卟啉单胞菌较正常人群明显升高,在今后的研究及防治中,不仅要观察龈沟液中的牙龈卟啉单胞菌,也应注意其在唾液中含量的变化。     

黄芩对牙龈卟啉单胞菌生长、形态影响的体外实验

目的：探讨黄芩在牙髓、根尖周病治疗中的基础理论。方法：采用试管两倍稀释法测定黄芩对牙龈卟啉单胞菌的最低抑菌浓度（MIC）；用扫描电镜观察低于MIC的3个浓度的黄芩对牙龈卟啉单胞菌形态的影响。结果：黄芩对牙龈卟啉单胞菌MIC值为1mg/mL；黄芩改变了牙龈卟啉单胞菌菌体的正常形态。结论：黄芩对牙龈卟啉单胞菌的生长、形态有抑制作用。     

应用实时荧光定量PCR定量检测慢性牙周炎患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌

目的 检测慢性牙周交患者和牙周健康人龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌、总菌量和牙龈卟啉单胞菌所占比例,探讨牙龈卟啉单胞菌与牙周炎发生发展的关系.方法 采集经常规PCR方法检测牙龈卟啉单胞菌为阳性的76例慢性牙周炎患者和25例牙周健康者的龈下菌斑,应用TaqMan实时荧光定量PCR方法定量检测样本中牙龈卟啉单胞菌、总菌量;构建含有牙龈卟啉单胞菌和真细菌扩增片断的重组质粒,建立定量标准.结果 本研究设计的引物和探针具有良好的特异性及敏感性.病变位点龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌数量和总菌量均比健康位点高(P<0.001),两组位点牙龈卟啉单胞菌在菌斑中的比例没有差异(P>0.05);细菌数量与探诊深度间存在显著正相关关系(P<0.001),不同的探诊深度牙龈卟啉单胞菌所占比例无统计学差异(P>0.05).结论 龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的数量水平及细菌总量与牙周状况、牙周炎发展有密切关系,实时荧光定量PCR对牙周病学研究具有广泛的应用前景.     

铍对口腔链球菌细胞膜元素含量及过氧化氢产量的影响

目的:研究铍离子(Be2+)对口腔链球菌细胞膜元素含量及抗菌性能的影响,探讨镍铬合金修复体对牙周损伤的微生物学机制.方法:含有不同浓度(5mg/L、10mg/L、20mg/L和40mg/L)Be2+的口腔链球菌培养液厌氧培养24h.X线能谱仪分析细胞膜元素含量变化,ABTS-HRP法检测细菌产生H2O2的能力.采用SPSS11.0软件包对数据进行单因素方差分析.结果:口腔链球菌细胞膜钙元素含量减少,钠元素先升高后降低,磷元素升高.Be2+浓度为40mg/L时,口腔链球菌H2O2产量显著下降(P＜0.05).结论:Be2+会改变口腔链球菌细胞膜元素含量,降低H2O2产量,从而导致修复体周围正常微生态环境失衡,引起牙周疾病.     

对氨基苯甲酸对牙龈卟啉单胞菌生长代谢影响的研究

目的 通过对氨基苯甲酸（para-aminobenzoic acid,PABA)对牙龈卟啉单胞菌生长代谢的影响，研究血链球菌在龈下菌斑生态平衡中的作用。方法 在培养基中加入不同浓度的PABA，对牙龈卟啉单胞菌行常规厌氧培养，测定培养后的细菌浓度吸光度（A）值和胰酶样蛋白酶活性，并用扫描电镜观察菌细胞形态。结果 PABA能促进牙龈卟啉单胞菌的生长和胰酶样蛋白酶的活性，当PABA浓度为1mg/L时，其促进作用最强，随着PABA浓度的升高，促进作用降低，当PABA浓度为100mg/L时，无明显的促进作用。PABA还能对菌细胞的形态和粘附产生影响。结论 PABA能影响牙龈卟啉单胞菌的生长代谢，提示血链球菌可能对龈下菌班的微生态平衡具有调节作用。     

牙龈卟啉单胞菌在龈下菌斑和颊黏膜中的检测

目的　检测牙周健康者及牙周炎患者在颊黏膜和龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的阳性率,探讨其与牙周炎发生和发展的关系。方法　选取40例牙周健康者和39例慢性牙周炎患者,分别收集颊黏膜和龈下菌斑样本,提取细菌DNA,设计细菌通用引物和牙龈卟啉单胞菌的特异引物用于PCR扩增,检测牙龈卟啉单胞菌的阳性率。结果　牙周健康组菌斑样本和颊黏膜样本牙龈卟啉单胞菌的阳性率分别为37·5%和32·5%,而牙周炎组菌斑样本和颊黏膜样本牙龈卟啉单胞菌的阳性率分别为69·23%和46·15%。牙周炎组菌斑的牙龈卟啉单胞菌阳性率高于牙周健康组,颊黏膜的牙龈卟啉单胞菌阳性率在组间无统计学差异;牙周炎组菌斑牙龈卟啉单胞菌阳性率高于颊黏膜, 牙周健康组两部位阳性率无统计学差异。结论　牙龈卟啉单胞菌除在菌斑中有高检出率外,在颊黏膜中也有较高的检出率,提示颊黏膜也是牙周细菌在口腔定植的重要部位,牙龈卟啉单胞菌也可在健康人群中检出,提示其有可能是口腔内固有菌群之一。     

鞣花酸对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的体外抑菌效果

目的 观察鞣花酸对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的生长、黏附的影响。方法 将鞣花酸单体溶于二甲基亚砜（DMSO）,用二倍梯度稀释法测定最低抑菌浓度和最低杀菌浓度。0.5 g/L氯己定作为阳性对照组,无药液组为阴性对照组,采用紫外分光光度计测定细菌黏附能力及生长曲线;通过生物膜结晶紫染色法测定生物膜抑制浓度和生物膜清除浓度。结果 石榴皮生物活性成分鞣花酸对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌最低抑菌浓度均为1 g/L,最低杀菌浓度均为2 g/L。在1 g/L时鞣花酸对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的细菌粘附能力的抑制率为80.68%和83.53%(P<0.05)。鞣花酸对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的生长影响为将牙龈卟啉单胞菌对数生长期由8 h推迟至12 h,将具核梭杆菌的对数生长期由4 h推迟至12 h。鞣花酸对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的生物膜抑制浓度及生物膜清除浓度均为4 g/L和8 g/L。结论 鞣花酸对牙周主要致病菌牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌都有显著的抑制作用,有望成为一种牙周病防治的辅助治疗药物。     

甘草酸对牙龈卟啉单胞菌生长影响的体外研究

目的研究甘草酸对体外培养的牙龈卟啉单胞菌的抗菌活性。方法采用微量液体稀释法测定甘草酸对牙龈卟啉单胞菌的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）和最低杀菌浓度（minimal bactericidalconcentration,MBC）。用不同浓度的甘草酸培养牙龈卟啉单胞菌,分别于培养0、4、8、12、24、48 h测定细菌悬液600 nm波长处的光密度值,绘制牙龈卟啉单胞菌的生长曲线。结果甘草酸对牙龈卟啉单胞菌的MIC和MBC分别为1.57 g/L和12.5 g/L,甘草酸对牙龈卟啉单胞菌生长的抑制作用随药液浓度的增加而增强。结论甘草酸对体外培养的牙龈卟啉单胞菌的生长有抑制作用。     

不同龈下楔状缺损充填材料对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的影响

目的：探讨常用龈下楔状缺损充填材料对牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）生物膜形成的影响。方法：在48颗离体前磨牙颊侧牙颈部制备同一规格V类洞,将其随机分为A、B、C 3组,每组16颗,分别采用通用纳米固体树脂、通用纳米流体树脂、玻璃离子充填、抛光后,使用Isomet 4000 精密切割机制成包含全部充填材料的试件（近远中径5 mm、龈径3 mm、颊舌向深度 2 mm）。将上述3组试件置于P.gingivalis菌液中培养24 h,采用结晶紫染色法观察P.gingivalis的黏附量,使用激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy, CLSM）观察P.gingivalis生物膜的形成情况。采用SPSS 22.0 软件包对所得数据进行Kruskal-Wallis 秩和检验。结果：结晶紫染色实验显示,玻璃离子表面黏附P.gingivalis的量显著少于通用纳米固体树脂与通用纳米流体树脂（P<0.05）。CLSM扫描可见,3组间P.gingivalis生物膜内的活菌比例及生物膜厚度无显著差异（P>0.05）;玻璃离子表面P.gingivalis生物膜稀疏,呈小团块状,未聚集成片;通用纳米固体树脂组的P.gingivalis生物膜则呈大块片状,立体结构明显。结论：与通用纳米树脂材料相比,玻璃离子表面更不利于P.gingivalis生物膜的形成。对牙周健康而言,玻璃离子更适用于龈下楔状缺损的充填治疗。     

二十碳五烯酸对人牙龈成纤维细胞生物学活性及炎症因子表达的影响

目的:探索二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)对人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)生物学活性及炎症因子表达的作用.方法:分别通过活-死细胞染色、免疫荧光染色、流式细胞术观察EPA对HGFs细胞活性、形态、细胞周期的影响,采用牙龈卟啉单胞菌(P...     

外源性ATP对牙龈成纤维细胞NLRP3炎症小体活化的影响

目的: 观察外源性三磷酸腺苷（ATP）对牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)和热灭活牙龈卟啉单胞菌(HP.gingivalis)感染的人牙龈成纤维细胞NLRP3 炎症小体（inflammasome）的活化以及下游因子IL-1β分泌的影响。方法: 组织块法体外培养人牙龈成纤维细胞（hGFs）获取原代细胞,经5 mmol/L ATP预处理,用100 MOI P.gingivalis、100 MOI HP.gingivalis体外刺激hGFs,实时定量PCR检测NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β的基因表达;Western免疫印迹技术检测细胞内NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白的表达;ELISA法检测白细胞介素1β（IL-1β）的分泌。采用Graphpad prism 6软件包对数据进行t检验或单因素方差分析。结果: 与对照组相比,P.gingivalis 下调NLRP3 、ASC mRNA,上调IL-1β基因表达,下调NLRP3 、IL-1β胞内蛋白水平。HP.gingivalis 诱导NLRP3 、IL-1β、ASC基因和胞内蛋白的表达,P.gingivalis或者 HP.gingivalis单独刺激对Caspase-1 mRNA水平及IL-1β分泌均无影响。ATP/P.gingivalis或ATP/HP.gingivalis 共刺激均明显上调NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β基因及胞内蛋白水平,增加上清液中IL-1β的分泌水平。结论: 外源性ATP可调控牙周主要致病菌P.gingivalis感染的人牙龈成纤维细胞 NLRP3炎症小体的激活,介导炎症因子IL-1β的成熟与分泌。     

正畸治疗中牙龈蛋白K与牙龈炎性反应的关系

目的分析牙龈蛋白K（gingipain K,Kgp）在正畸治疗中对牙龈炎性反应的影响。方法选择青少年牙龈健康者45例,分别取矫治器戴入前与矫治器戴入后3个月的龈沟液,应用16S rDNA PCR技术检测各样本中的牙龈卟啉单胞菌（P.g）及Kgp,采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果矫治器戴入前Kgp检出率为35.71%,矫治器戴入后Kgp检出率为67.86%,两者之间差异显著（P<0.05）。结论正畸治疗患者在矫治器戴入后Kgp检出率增加,出现牙龈炎性反应。     

等离子体电解氧化法制备不同锌含量的钙磷活性涂层与抗菌性能的关系

目的：利用等离子体电解氧化技术,在纯钛表面制备不同锌含量的钙磷活性涂层,比较纯钛表面不同锌含量活性涂层的理化性能差异及其对牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis,Pg)及伴放线放线杆菌（A.actinomycetemcomitans,Aa）抗菌性能的影响。方法 在等离子体电解氧化的电解液中,每组各加入0.08 mol/L钙和0.06 mol/L磷,再分别向各组加入0.01、0.03、0.05 mol/L锌处理纯钛片,制成低、中、高3种不同锌含量的钙磷活性涂层,以不加锌组作为对照组。利用电子万能测试机检测涂层与钛基底的结合力,扫描电镜(SEM)观察钛片表面形貌,X线衍射(XRD)分析材料表面晶相结构,X射线光电子能谱仪(XPS)分析材料表面化学组成及元素成分。材料表面培养Pg和Aa后,应用扫描电镜和贴膜法评价锌含量与抗菌性能的关系。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果 随着锌含量的提高,涂层的孔径及粗糙度随之增加;低锌组结晶优于高锌组;低锌组HA和Zn₃P₂含量较多,高锌组ZnO含量多。扫描电镜观察,随着锌含量的提高,材料表面Pg和Aa细菌数量逐渐减少,高锌组部分细菌出现裂解、坏死。通过贴膜法观察,随着锌含量的提高,材料表面Pg和Aa细菌数量逐渐减少,且4组间差异显著。结论 锌含量的变化会改变涂层的理化性能。高含量锌的钙磷涂层,抗菌性能最佳。     

赤藓糖醇对牙周致病菌抗菌性能的影响

目的 研究赤藓糖醇对牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)、 伴放线聚集杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Aa)和粘性放线菌（Actinomyces viscous,Av）生长的影响,探讨不同浓度赤藓糖醇作用后的Pg对牙周膜细胞炎症相关细胞因子mRNA表达水平的影响。方法 将Pg、Aa、Av 3种致病菌接种于0、2、4、8、16、32、64、128 g/L的赤藓糖醇-BHI液中,37℃厌氧培养一定时间,检测其最低抑菌浓度。将Pg分别接种于MIC、1/2、1/4、1/8 MIC 4个赤藓糖醇质量浓度的培养基以及不含赤藓糖醇的培养基,离心并清洗后,加入细胞DMEM培养基重悬,与培养至第4代的人牙周膜细胞共培养24 h,弃上清,裂解细胞,提取总RNA,反转录,实时荧光定量PCR检测IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA相对表达量。采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果 赤藓糖醇对3种细菌的最低抑菌浓度分别为Pg：64 g/L,Aa：128 g/L,Av：128 g/L。不同浓度赤藓糖醇条件下培养的细菌,刺激牙周膜细胞产生IL-1β、IL-6 、TNF-α的能力不同。赤藓糖醇浓度为8 g/L时,炎症因子量与不加赤藓糖醇的对照组无显著差别;浓度升高达到16 g/L时,IL-1β、IL-6 、TNF-αmRNA的相对表达量有所降低,且浓度越高,炎症因子释放越少;但所有实验组炎症因子量始终高于未加细菌的空白对照组（P<0.05）。结论 赤藓糖醇对Pg、 Aa、 Av的生长能力有抑制作用,且在一定范围内,赤藓糖醇质量浓度越高,抑制效果越明显。赤藓糖醇还可通过某种方式对致病菌毒力因子起抑制作用,进而降低Pg的牙周致炎性,减少牙周膜细胞IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA相对表达量。     

特定序列寡核苷酸MT01对牙龈卟啉单胞菌感染的成骨细胞的增殖、细胞周期及凋亡的影响

目的 通过观察MT01对感染状态下成骨细胞细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响,探讨MT01对牙周致病菌感染的成骨细胞生物学性能的影响。方法 以人成骨细胞MG63为目的细胞,分别与PBS、MT01、CpG ODN、甲硝唑和庆大霉素共培养3 h后,按感染复数100∶1的比例加入牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌共培养,检测培养24 h和48 h后MG63细胞的增殖、细胞周期及凋亡,以PBS作为空白对照,以牙龈卟啉单胞菌和PBS共培养作为阴性对照。结果MT01+牙龈卟啉单胞菌组细胞增殖高于空白对照组（P<0.05）,G₁期细胞百分比低于阴性对照组,而S期细胞百分比高于阴性对照组（P<0.05）,细胞早期凋亡率低于阴性对照组（P<0.05）。结论 MT01可促进感染状态下成骨细胞的细胞增殖,降低G₁期细胞百分比,促使细胞进入S期并抑制细胞早期凋亡。     

淫羊藿苷口服给药对骨质疏松牙周炎小鼠牙槽骨吸收的影响

目的:研究口服淫羊藿苷（ICA）对骨质疏松小鼠牙周炎引起的牙槽骨吸收的抑制作用。方法:3月龄、雌性、C57BL/6J小鼠随机分为3组,即正常组（SHAM组）、卵巢切除+口腔涂布牙龈卟啉单胞菌（Pg）+淫羊藿苷组（OVX+Pg+ICA）、卵巢切除+Pg口腔涂布组（OVX+Pg）。小鼠适应性喂养1周,第2周进行双侧卵巢切除术,诱导小鼠骨质疏松形成。从第4周开始,对小鼠牙周涂布Pg,1次/d,连续1周。第12周收集左侧下颌骨进行固定切片及染色,分析各组之间牙槽骨吸收高度的差异。收集右侧下颌骨进行亚甲蓝染色,分析各组间牙槽骨吸收面积的差异;收集双侧上颌骨牙周组织蛋白,分析成骨相关蛋白的表达差异。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果:小鼠股骨及牙周组织切片染色显示,成功建立了小鼠骨质疏松牙周炎模型。对牙槽骨吸收距离和面积的测量分析显示,相比于OVX+Pg组,口服淫羊藿苷可显著减少釉-牙骨质界-牙槽嵴顶（CEJ-ABC）的距离及颊舌侧牙槽骨吸收面积（P<0.05）;Western免疫印迹显示,相比于OVX+Pg组,OVX+Pg+ICA组中Runx2、OSX、OCN及OPN蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。结论:口服淫羊藿苷在预防小鼠骨质疏松发生的同时,可有效减少牙周炎引起的牙槽骨吸收。     

葡萄籽原花青素对牙龈卟啉单胞菌内毒素的影响

目的探讨葡萄籽原花青素对牙龈卟啉单胞菌内毒素的影响。方法采用二倍稀释法测定葡萄籽原花青素对牙龈卟啉单胞菌的最小抑菌浓度(MIC);采用鲎试验测定低于MIC 6个浓度的葡萄籽原花青素对牙龈卟啉单胞菌内毒素含量的影响。采用SPSS17.0软件包进行组间比较。结果葡萄籽原花青素对牙龈卟啉单胞菌的MIC为0.8 mg/mL;在0.05~0.4 mg/mL范围内,随着葡萄籽原花青素浓度的升高,对释放内毒素的抑制作用逐渐增强（P<0.05、0.01）。结论葡萄籽原花青素对牙龈卟啉单胞菌内毒素的释放具有抑制作用。