培美曲塞和吉非替尼不同时序应用对人肺腺癌细胞的作用和机制

目的 探讨培美曲塞与吉非替尼不同时序应用对肺腺癌细胞A549和PC-9生长及凋亡的影响, 并阐述其可能机制。方法 MTT法检测各组细胞的增殖抑制情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡及细胞周期分布,Western印迹法检测对EGFR下游信号通路及TS酶蛋白水平表达的影响。结果 培美曲塞序贯吉非替尼、培美曲塞同步联合吉非替尼对PC-9和A549细胞增殖抑制率及凋亡率较单药组均提高（P<0.05）,培美曲塞可以提高EGFR、AKT 、ERK磷酸化水平,而吉非替尼表现为抑制作用, 同时吉非替尼降低TS酶表达。培美曲塞序贯吉非替尼,培美曲塞同步联合吉非替尼抑制EGFR、AKT 、ERK磷酸化水平较单药更强。吉非替尼主要将PC-9、A549细胞阻滞在G0/G1期;培美曲塞主要将细胞阻滞在S期。培美曲塞序贯吉非替尼、培美曲塞同步联合吉非替尼较其他组G2/M期细胞比例提高（P<0.05）。结论 培美曲赛序贯吉非替尼、培美曲赛同步联合吉非替尼在PC-9、A549细胞中均起到协同增效作用,且培美曲赛序贯吉非替尼协同作用更为显著,可能主要与培美曲赛诱导EGFR、AKT 、ERK磷酸化及吉非替尼降低TS酶作用有关。     

多西他赛与吉非替尼不同时序应用对人肺腺癌细胞的作用

目的 探讨多西他赛与吉非替尼不同时序应用对人肺腺癌细胞A549和PC-9的生长影响及其细胞学机制。方法 qPCR-HRM法检测人肺腺癌细胞EGFR和K Ras基因突变,MTT法检测细胞增殖, Western blotting检测细胞信号蛋白及磷酸化表达,FCM法检测细胞周期变化。结果 人肺腺癌A549细胞为EGFR基因野生型,PC-9细胞为EGFR第19外显子突变型。多西他赛和吉非替尼单药或联合用药均能抑制A549和PC-9细胞生长,呈浓度依赖性。多西他赛对A549和PC-9细胞生长的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为5.24×10^-7和2.13×10^-8mol／L,吉非替尼分别为1.28×10^-5和4.58×10^-8mol／L。在IC₅₀浓度时,多西他赛序贯吉非替尼对A549和PC-9细胞的生长抑制率分别为60.00%和57.45%,均较单药组明显增高（P＜0.05）;而同时用药只对PC-9细胞有增效作用,抑制率为53.46％,较单药组明显增高（P＜0.05）。多西他赛表现为增强A549、PC-9细胞EGFR和ERK磷酸化,吉非替尼表现为抑制,两药均抑制PC-9细胞IGF-1R磷酸化。多西他赛序贯应用吉非替尼显著抑制EGFR和ERK磷酸化,两药同时应用对抑制PC-9细胞的IGF-1R磷酸化具有增强作用。多西他赛将A549及PC-9细胞阻滞在G₂期,吉非替尼将PC-9细胞明显阻滞在G₁期。结论 多西他赛序贯吉非替尼能够抑制EGFR野生型和突变型的A549及PC-9细胞生长,且呈增效作用,可能与影响细胞EGFR和ERK磷酸化有关;两药同时应用仅对PC-9细胞具有增效作用,可能与IGF-1R磷酸化抑制有关;不同时序应用的效果均可能与细胞周期相关。     

EGFR-TKI联合COX-2抑制剂抑制肺腺癌A549细胞的增殖及其机制

目的:研究表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)吉非替尼联合环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂塞来昔布对肺腺癌A549细胞增殖的抑制作用及其可能机制。方法:实验设空白对照组、吉非替尼组、塞来昔布组、吉非替尼+塞来昔布组。倒置相差显微镜下观察A549细胞形态变化,MTT法检测A549细胞增殖,流式细胞术检测A549细胞周期及凋亡,Western blotting检测A549细胞中EGFR、p-EGFR、COX-2的表达。结果:吉非替尼和塞来昔布均可抑制A549细胞的增殖,可见细胞活性下降,G1期细胞阻滞及细胞凋亡增加;联合用药较单药组A549细胞活性下降更明显,G1期阻滞细胞增加,且细胞凋亡增加。吉非替尼或塞来昔布作用前后A549细胞EGFR表达无变化,但联合用药组p-EGFR及COX-2的表达较单药组显著下降。结论:吉非替尼联合塞来昔布可抑制人肺腺癌A549细胞的增殖,其机制可能与抑制EGFR的活化及下调COX-2的表达有关。     

康莱特注射液对吉非替尼诱导人肺腺癌A549细胞株凋亡影响的实验研究

目的 探讨康莱特注射液联合吉非替尼对人肺腺癌A549细胞株增殖和凋亡的影响。 方法 应用MTT法计算康莱特注射液作用于人肺腺癌A549细胞株48 h的半数抑制浓度（IC50）,检测康莱特注射液（5、10、20、40、80、100、160 μl／ml）、吉非替尼（0.1、0.5、1.0、5、10、20、40 μmol／L）以及康莱特注射液（80 μl／ml）联合吉非替尼（0.1、0.5、1、5、10、20、40 μmol／L）作用于人肺腺癌A549细胞株24、48、72 h的增殖抑制率;流式细胞仪Annexin V/PI 双标法检测康莱特注射液、吉非替尼及两药联合作用于A549细胞48 h后的凋亡率;免疫细胞化学法检测各药物处理组作用于A549细胞48 h后FAS、AKT2蛋白表达;RT-PCR技术检测各组FAS mRNA、AKT2 mRNA的表达水平。均设未加药的A549细胞为空白对照组。结果 康莱特注射液作用于人肺腺癌A549细胞株48 h的IC50为80 μl／ml。康莱特注射液联合吉非替尼作用于A549细胞的增殖抑制率高于两单药组和空白对照组,且呈时间和浓度依赖性（P＜0.05）。两者的联合作用在一定浓度范围内呈现出协同的抗瘤效果。流式细胞术检测显示,两药联合组的细胞凋亡率显著高于两单药组和空白对照组（P＜0.05）。免疫细胞化学和RT-PCR检测显示,与空白对照组比较,康莱特组和两药联合组FAS蛋白和mRNA的表达水平均升高（P＜0.05）,AKT2蛋白和mRNA表达水平均下调（P＜0.05）。结论 康莱特注射液联合吉非替尼对人肺腺癌A549细胞株有明显的促凋亡作用,康莱特注射液可能增加人肺腺癌A549细胞对于吉非替尼的敏感性。     

吉非替尼对A549细胞增殖及细胞周期、凋亡的作用

目的:观察吉非替尼对人非小细胞肺癌A549的生长增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响.方法:用5-40μmol/L浓度范围内的吉非替尼和A549细胞共培养24、48、72h,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测吉非替尼对细胞增殖的影响;用流式细胞仪检测其对细胞凋亡及细胞周期分布的影响;利用抗Capspase-3 的ELISA(酶联免疫吸附)法检测是否发生细胞凋亡.结果:在5-40μmol/L浓度范围内,吉非替尼对A549细胞的增殖有明显的抑制作用,并呈时间和剂量依赖性,以40μmol/L作用72h时的抑制率最高.流式细胞仪检测显示10μmol/L-40μmol/L的吉非替尼作用可使细胞发生G0/G1期阻滞,但即使作用48h也未发现凋亡细胞.ELISA法显示48h内,吉非替尼组与正常细胞组的Capspase-3浓度无统计学差异,但作用72h时出现凋亡.结论:吉非替尼在5-40μmol/L浓度下作用时间小于48h时,其对A549细胞的增殖抑制可能是通过阻滞A549细胞于G0/G1期而非引起细胞凋亡实现的,但作用时间达到72h时,其可以诱导A549发生细胞凋亡.     

吉非替尼对A549细胞增殖及细胞周期、凋亡的作用

目的：观察吉非替尼对人非小细胞肺癌A549的生长增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。方法：用5—40μmol／L浓度范围内的吉非替尼和A549细胞共培养24、48、72h,采用四甲基偶氮唑蓝（MTr）法检测吉非替尼对细胞增殖的影响;用流式细胞仪检测其对细胞凋亡及细胞周期分布的影响;利用抗Capspase-3的ELISA（酶联免疫吸附）法检测是否发生细胞凋亡。结果：在5—40μmol／L浓度范围内,吉非替尼对A549细胞的增殖有明显的抑制作用,并呈时间和剂量依赖性,以40μmol／L作用72h时的抑制率最高。流式细胞仪检测显示10μmol／L-401μmol／L的吉非替尼作用可使细胞发生G0／G,期阻滞,但即使作用48h也未发现凋亡细胞。ELISA法显示48h内,吉非替尼组与正常细胞组的Capspase-3浓度无统计学差异,但作用72h时出现凋亡。结论：吉非替尼在5—40μmol／L浓度下作用时间小于48h时,其对A549细胞的增殖抑制可能是通过阻滞A549细胞于G0／G1期而非引起细胞凋亡实现的,但作用时间达到72h时,其可以诱导A549发生细胞凋亡。     

AHR活化介导的ROS诱导NSCLC细胞吉非替尼耐药的作用机制

目的:探讨芳香烃受体（AHR）介导的活性氧簇（ROS）诱导非小细胞肺癌（NSCLC）吉非替尼耐药的作用机制。方法:以正常支气管肺泡上皮细胞BEAS-2B为对照,Western blot检测非小细胞肺癌A549、PC-9、H1299和H1975细胞AHR的蛋白表达。AHR激动剂FICZ、吉非替尼、N-乙酰半胱氨酸（NAC）分别处理A549和PC-9细胞,MTT、激光共聚焦显微镜、流式细胞术及Western blot分别检测吉非替尼敏感性、细胞内ROS及表皮生长因子受体（EGFR）信号。结果:MTT检测显示FICZ通过上调半数最大抑制浓度（IC50）诱导PC-9及A549细胞对吉非替尼耐药,Western blot显示FICZ可导致PC-9及A549细胞EGFR、AKT磷酸化,而NAC可遏制A549细胞中的EGFR磷酸化并逆转吉非替尼耐药。共聚焦显微镜和流式细胞仪显示,FICZ诱导的AHR活化导致PC-9及A549细胞内ROS产生增加,并且可被NAC抑制。结论:活化的AHR可通过促进NSCLC细胞中的ROS产生和EGFR信号转导介导吉非替尼耐药,此过程可被NAC抑制。     

miR-200c增强肺癌A549细胞对紫杉醇及吉非替尼的敏感度及相关机制

目的 观察上调肺癌A549细胞中miR-200c的表达对紫杉醇、吉非替尼敏感度及两药联合作用的影响及其作用机制。方法 用miR-200c转染肺癌A549细胞,Real-time PCR检测miR-200c表达,MTT法和流式细胞仪检测转染miR-200c后A549细胞对紫杉醇、吉非替尼单药及两药联合的敏感度和细胞凋亡的影响,Western blot检测TUBB3蛋白、EGFR、Akt、MAPK磷酸化蛋白及总蛋白的表达。结果 上调miR-200c表达可增强A549细胞对紫杉醇及吉非替尼敏感度并促进细胞凋亡,对两药联合无明显作用。Western blot显示转染miR-200c联合紫杉醇可下调A549细胞中TUBB3蛋白表达,联合吉非替尼下调EGFR和Akt磷酸化蛋白表达,与两药联合对EGFR和Akt磷酸化蛋白表达无明显影响。 结论 miR-200c可增强肺癌A549细胞对紫杉醇、吉非替尼的敏感度,可能分别与抑制TUBB3表达、抑制EGFR和Akt磷酸化蛋白表达有关,而对两药联合无协同抗肿瘤作用。     

肝细胞生长因子诱导敏感非小细胞肺癌细胞对吉非替尼耐药及机制的研究

背景与目的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)受体(c-Met)可能与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)对吉非替尼耐药有关。本研究旨在探讨HGF诱导不同基因型NSCLC对吉非替尼耐药及耐药机制。方法选择NSCLC细胞EGFR突变型PC-9和EGFR野生型H292,用HGF诱导这两株细胞,通过MTT法检测细胞增殖,PI法检测细胞周期,Annexin V-PE法检测细胞凋亡,应用免疫印迹(Western blot)技术检测细胞中c-Met、p-Met的表达。结果吉非替尼对PC-9和H292的生长抑制作用呈浓度依赖性,HGF诱导后吉非替尼抑制两种细胞的生长曲线往右移。PC-9和H292的HGF和吉非替尼处理组(HG)比吉非替尼处理组(G)均有更高的存活率(P<0.05),HG组与G组两组间细胞凋亡及细胞周期无统计学差异(P>0.05)。HGF明显增加PC-9和H292中p-Met的表达。吉非替尼能明显抑制HGF诱导PC-9增加表达的p-Met,但不能抑制HGF诱导H292增加表达的p-Met。结论 HGF可诱导敏感肺癌细胞PC-9和H292对吉非替尼耐药,HGF刺激c-Met磷酸化可能是敏感肺癌细胞对吉非替尼耐药的重要机制。     

Mir-7上调增强肺腺癌对吉非替尼敏感性的机制研究

目的:探索上调Mir-7的表达使肺腺癌A549细胞增强吉非替尼的敏感性及其机制。方法:用lipo-fectamine2000携带Mir-7对A549细胞进行瞬时转染。将A549细胞分为对照组、转染组、吉非替尼组与联合组。MTT法测各组细胞增殖率变化,Transwell检测细胞侵袭性,Real time PCR检测E-Cadherin及N-Cad-herin的mRNA表达的变化,Western blot检测他们的蛋白表达的变化。结果:上调A549细胞中Mir-7的表达与吉非替尼共同作用较单独吉非替尼作用有更显著的抑制作用。用Mir-7转染后,肺腺癌A549细胞的侵袭力下降。转染与吉非替尼联合组E-Cadherin的信使RNA及蛋白的表达变化不大,但N-Cadherin表达下降。结论:上调Mir-7的表达可以增强肺腺癌细胞对吉非替尼的敏感性,其机制可能是过量表达的Mir-7抑制了IGF-1R信号通路及肿瘤上皮细胞间质化。     

吉非替尼对非小细胞肺癌细胞的体外抑制作用

目的研究体外吉非替尼对非小细胞肺癌细胞株的作用机制。方法观察吉非替尼作用于A549、SPC-A-1、H460、H1229、95D5株人类非小细胞肺癌细胞株,应用活细胞计数试剂盒CCK8测定各组细胞增殖抑制情况;选择A549、SPC-A-1细胞株,PI标记后应用流式细胞术观察细胞凋亡状况,Transweu方法检测细胞侵袭情况;Westernblot检测药物对增殖相关信号通路蛋白表达的变化。结果吉非替尼抑制了各株肺癌细胞的增殖和侵袭（P〈0．05）;吉非替尼组中A549和SPC-A-1细胞的凋亡率分别为（9．6±0．73）％和（14．3±1．12）％,高于对照组的（3．1±0．29）％（t=11．16,P=0．001;t－4．726,P=0．009）;吉非替尼作用于A549细胞72h后,能明显降低p-AKT、P—EGFR、p-MAPK蛋白的表达水平（t=6．656,P=0．003;t=16．441,P=0．0001;t=3．736,P=0．020）。结论吉非替尼能抑制肺癌细胞在体外的增殖、侵袭,可诱导肿瘤细胞的凋亡,其作用可能与下调活化的表皮生长因子受体（EGFR）信号转导通路关键酶的表达有关。     

BIM induction of apoptosis triggered by EGFR-sensitive and resistance cell lines of non-small-cell lung cancer

We sought to improve the understanding of oncogene-dependent and independent non-small-cell lung cancer (NSCLC), which could provide insight into mechanism of sensitivity and/or resistance to tyrosine kinase inhibitors or chemotherapeutics. NSCLC cell lines with different EGFR genotypes were used in this study; MTT assay and flow cytometry were applied to study the sensitivities of these cell lines to gefitinib and cisplatin. Western blot was performed to determine the expression levels of BIM and other Bcl-2 family proteins pre- and pro-treatment. Gefitinib provoked apoptosis of caspase activation via the intrinsic pathways and significantly up-regulated expression of BIM protein in drug-sensitive PC-9 cell line, but not resistant PC-9/BB4 cell line. The knockdown of BIM expression by RNA interference virtually eliminated gefitinib-induced cell killing in PC-9 cells in vitro. Cisplatin could induce apoptosis of the cell lines, including H1299, A549, PC-9, and PC-9/BB4 cells, but which was not associated with overexpression of BIM. BIM is involved in TKI-induced apoptosis in sensitive EGFR-mutant cell line. Down-regulation of BIM and resistance to gefitinib were both seen in the acquired resistant PC-9/BB4 cell line. The induction of BIM may have a role in the treatment of TKI-resistant tumors.     

Gefitinib ('Iressa', ZD1839), a selective epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, inhibits pancreatic cancer cell growth, invasion, and colony formation

Pancreatic cancer is a devastating malignancy, characterized by low responsiveness to conventional chemotherapies. Gefitinib, an epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI) has shown clinical activity against EGFR-expressing tumors. Since pancreatic cancers frequently overexpress EGFR (ErbB-1) and its ligands, our aim was to investigate the potential role of gefitinib in this disease. The GI50 of gefitinib as well as the effects of gefitinib on growth factor actions in pancreatic cancer cell lines were analyzed using MTT assays. FACS analysis using Annexin and propidium iodide (PI) staining were performed to study cell cycle, apoptosis and cell death. Western blot analysis was carried out to investigate expression levels of the 4 members of the ErbB family of receptors in pancreatic cancer cell lines, as well as MAP kinase and EGFR phosphorylation. Soft agar assays were used to measure colony formations. Invasiveness of cancer cells was analyzed using Matrigel-coated filters. gefitinib inhibited cell proliferation of pancreatic cancer cell lines with GI50 concentrations ranging from 2.5 to over 10 micro M. Gefitinib completely inhibited EGF-induced cell proliferation, but did not significantly influence insulin-like growth factor (IGF)-induced mitogenesis. Gefitinib also completely abolished EGF-induced phosphorylation of EGFR and MAP kinase. Furthermore, gefitinib inhibited basal and EGF-induced anchorage-independent cell growth and invasion. Our data demonstrate that gefitinib inhibits pancreatic cancer cell growth through EGFR-dependent pathways. Gefitinib also inhibits anchorage-independent growth and invasiveness, suggesting that gefitinib may offer a new approach for the treatment of pancreatic cancer.     

Additive antitumour effect of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor gefitinib (Iressa, ZD1839) and the antioestrogen fulvestrant (Faslodex, ICI 182,780) in breast cancer cells

A high expression level of epidermal growth factor receptor (EGFR)/HER1 has been suggested to lead to a shorter survival time and resistance to endocrine therapy in patients with breast cancer. To test the hypothesis that inhibition of the EGFR signalling pathway affects the antitumour effect of endocrine therapy, an EGFR tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI), gefitinib, and an oestrogen receptor (ER) antagonist, fulvestrant, were administered to human breast cancer cells. A total of five human breast cancer cell lines were used. The effects of single or combined treatments with gefitinib and/or fulvestrant on cell growth, cell cycle progression and apoptosis were analysed. Changes in the expression levels of cyclin-dependent kinase inhibitors, p21 and p27, an antiapoptotic factor, Bcl-2, and a proapoptotic factor, Bax, were also investigated. All cell lines tested were sensitive to gefitinib (50% growth inhibitory concentration, 10-28.5 microM). Breast cancer cell lines with a high expression level of HER1 or HER2 were more sensitive to gefitinib than the others. Gefitinib induced a significant G1-S blockade in ER-positive KPL-3C cells. Gefitinib induced significant apoptosis in HER1-overexpressing MDA-MB-231 cells. Gefitinib additively increased the antitumour effect of fulvestrant in all three ER-positive cell lines in a medium supplemented with 17beta-oestradiol. The combined treatment promoted cell cycle retardation in KPL-3C cells, which is associated with an upregulation of p21 by fulvestrant and gefitinib, respectively. Apoptosis was associated with downregulation of Bcl-2 by gefitinib in MDA-MB-231 cells. These results suggest an additive interaction between the EGFR-TKI gefitinib and the antioestrogen fulvestrant in ER-positive breast cancer cells.     

SU11274逆转肝细胞生长因子诱导不同EGFR基因型非小细胞肺癌细胞株对吉非替尼耐药

背景与目的：肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)诱导敏感非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC)细胞对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)耐药,其机制与c-Met激活有关。本研究探讨c-Met抑制剂SU11274逆转HGF诱导的不同EGFR基因型NSCLC细胞株对吉非替尼耐药及逆转耐药机制。方法：选择人NSCLC细胞株PC9(EGFR突变型)、H292(EGFR野生型)和A549(EGFR野生型),应用吉非替尼和SU11274单独或联合作用于HGF诱导的细胞株。实验分为6组：C组(不加药对照组)、H组(HGF处理组)、G组(吉非替尼处理组)、S(SU11274处理组)、HG组(HGF+吉非替尼处理组)和HGS组(HGF+吉非替尼+SU11274处理组)。MTT法检测对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡的影响;应用蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞中c-Met及其下游通道Stat3、Akt和Erk1/2蛋白表达水平。结果：吉非替尼对3种细胞的生长抑制作用均呈浓度依赖性,HGF处理能够缓解吉非替尼的增殖抑制作用(P<0.05);不同浓度吉非替尼联合SU11274作用于HGF诱导细胞时,3种细胞株存活率比吉非替尼单独作用于HGF诱导细胞时明显降低(P<0.05);HGS组的细胞凋亡比HG组明显增加(P<0.05);HGS组的c-Met、Stat3、Akt和Erk1/2活化蛋白量比HG组明显减少。结论：c-Met抑制剂SU11274可逆转HGF诱导的不同EGFR基因型NSCLC细胞株对吉非替尼耐药,其机制可能与抑制HGF活化的c-Met及其下游通道蛋白表达有关。