慢病毒载体体内转染大鼠角膜基质细胞的安全性实验研究

目的:研究病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白(Lenti-EGFP)通过2种途径体内转染大鼠角膜基质细胞的安全性,为角膜相关疾病的基因治疗提供实验基础。方法:将Lenti-EGFP通过角膜基质注射和刮除角膜上皮敷贴带Lenti-EGFP的棉片2种不同方法体内转染大鼠角膜基质细胞,转染后定期在裂隙灯下观察,以3,7,26和48 d 4个不同时间点收集角膜,固定后切片,经HE染色后采用光镜、电镜检查和Tunel法检测细胞凋亡。结果:两组(1b组、1c组)大鼠转染了Lenti-EGFP的角膜各层细胞形态及超微结构与对照组(1a组)之间各组细胞凋亡百分率经比较其差异无统计学意义(P>0.05)。结论:Lenti-EGFP通过上述2种转染途径均可安全的转染角膜基质细胞。     

经尿道切除术联合膀胱灌注治疗膀胱肿瘤

目的 :总结经尿道汽化电切术治疗膀胱肿瘤的疗效。方法 :采用经尿道汽化电切术 (TURBT)切除膀胱肿瘤联合术后膀胱灌注治疗浅表性膀胱肿瘤 90例 ,肿瘤单发 4 0例 ,多发 5 0例 ,病理分级 G1 级～ G2 级 ,分期 T1 期～ T2 期 ,肿瘤直径 0 .2 cm～ 3.0 cm。结果 :总复发率 2 7.8% ,手术均一次成功 ,术中出血少 ,视野清晰 ,未见并发症。结论 :经尿道汽化电切术切除膀胱肿瘤 ,操作简单 ,疗效确切 ,术中术后无严重并发症 ,是治疗浅表性膀胱肿瘤的理想方法。     

BMP2重组慢病毒转染兔BMSCs后细胞矿化的实验研究

目的 探讨骨形态发生蛋白2(BMP2)重组慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化后细胞矿化的能力。方法 密度梯度离心及贴壁培养法获取第5代兔BMSCs,流式细胞仪检测细胞表面标记。将BMSCs分为空白对照组(未转染)、Lv-EGFP组[转染仅携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒]和Lv-BMP2/EGFP组(转染携带BMP2和EGFP基因的慢病毒)。免疫组织化学染色、RT-PCR、Western blot检测BMP2蛋白和基因表达情况;SP法检测Ⅰ型胶原蛋白表达;茜素红染色法检测矿化结节形成;于转染第7、14、21天检测细胞碱性磷酸酶(ALP)水平;通过扫描电镜和能谱分析进一步观测矿化结节表面微观形貌及其主要元素构成。结果 流式细胞仪检测显示第5代BMSCs的细胞表面CD44、CD29表达呈阳性,CD45表达呈阴性;免疫组织化学染色、RT-PCR、Western blot显示Lv-BMP2/EGFP组较Lv-EGFP组及空白对照组能高效表达BMP2目的蛋白和基因,转染第7、14、21天ALP水平较其余2组升高,Ⅰ型胶原染色及茜素红染色均呈阳性,扫描电镜下见矿化结节散...     

含绿色荧光蛋白报告基因rhPDGF-BB非融合型表达载体的构建及其转染

目的：构建并转染含绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的重组人血小板衍化生长因子-BB（rhPDGF-BB）非融合型表达载体，为采用转基因工程化细胞修复糖尿病溃疡创面奠定基础。方法：从人脐静脉内皮细胞human umbil ical vein endothelial cell，HUVEC）中分离总RNA，行RT—PCR获得rhPDGF—BB cDNA，构建克隆质粒pMD 19-T／rhPDGF—BB，经测序正确后，再将该目的片段与真核表达载体pSELECT—GFPzeo—mcs连接，转化E．coli DH 5α感受态菌落筛选得到含GFP报告基因的非融合型表达载体，然后将其转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）并用免疫组化染色法鉴定。结果：PCR获得长度为681bp的目的片段，经pSELECT-GFPzeo—mcs载体连接、筛选及序列分析后，证实所插入目的片段与GenBank检索的rhPDGF-BB cDNA序列（NM-033016）完全匹配。结论：成功构建了非融合型表达载体pSELECT-GFPzeo—mes／rhPDGF-BB，并实现了rhPDGF-BB基因在CHO的表达。     

大鼠FasL基因重组慢病毒载体介导大鼠肾细胞体外转染

目的 探讨慢病毒载体对大鼠肾细胞体外转染的可行性.方法 三质粒系统共转染包装细胞293-T,合成重组慢病毒载体,P24gag EIISA对其定量测定.流式细胞术测定SD大鼠肾细胞Fas、FasL的表达.Western blot、RT-PCR检测转染后目的 基因的表达.结果 定量测定目的 基因载体、空白载体浓度分别为11.6 ng/ml、13.8 ng/ml,Western blot、RT-PCR分别检测到目的 基因的表达.结论 慢病毒载体体外成功转染SD大鼠肾细胞,并表达目的 基因.     

Has-miR-129慢病毒表达载体的构建

目的构建Has-miR-129慢病毒表达载体,观察慢病毒载体转染效率。方法采用gag/pol、tat、rev、vsv、Has-miR-129构建带有绿色荧光蛋白慢病毒载体,合成Has-miR-129慢病毒表达载体,用合成的慢病毒表达载体分别感染786-O、SN12-PM6肾癌细胞株,观察细胞的绿色荧光的表达及转染效率。结果 Has-miR-129慢病毒表达载体分别感染786-O及SN12-PM6肾癌细胞株,2种细胞株的转染效率〉90%,能在真核细胞中稳定表达。结论成功构建了携带有Has-miR-129慢病毒表达载体,并能高效感染肾癌细胞,为Has-miR-129靶点验证及其功能研究奠定了实验基础。     

靶向结缔组织生长因子shRNA慢病毒表达载体的构建及病毒包装

目的构建靶向结缔组织生长因子（CTGF）的shRNA慢病毒载体并检测其介导的RNA干扰（RNAi）对人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）CTGF表达的影响,为进一步研究CTGF在增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）中的功能奠定基础。方法设计并合成三对针对CTGF的siRNA,通过WesternBlot筛选有效靶点,合成有效靶点的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与线性化的pGC-LV-GFP载体连接,通过PCR筛选阳性克隆并进行DNA测序鉴定;将重组CTGFshRNA的质粒与病毒包装的辅助质粒共转染295T细胞,将包装产生的慢病毒感染ARPE-19细胞,WesternBbt检测CTGF的表达。结果通过双酶切和基因测序证实靶向CT-GF的shRNA慢病毒载体构建成功,Western Blot证实经慢病毒感染后的ARPE-19细胞中的CTGF的蛋白水平明显减低。结论成功构建了靶向CTGF的shRNA慢病毒表达载体,体外感染ARPE-19细胞可有效降低CTGF蛋白的表达,为深人研究CTGF在PVR中的功能提供了有力的工具。     

经尿道电切联合膀胱灌注表柔比星治疗膀胱白斑

目的探讨经尿道电切术联合术后表柔比星膀胱灌注治疗膀胱白斑的疗效。方法对31例膀胱白斑患者行经尿道电切术及术后膀胱内表柔比星灌注治疗。结果 31例患者手术均获成功,随访6～24个月,治愈21例（67.7%）,好转8例（25.8%）,无效1例（3.2%）,1例（3.2%）复发。结论经尿道电切联合膀胱灌注表柔比星治疗膀胱白斑疗效满意,值得推广应用。     

经尿道膀胱肿瘤汽化电切术联合膀胱灌注治疗浅表性膀胱肿瘤临床观察

膀胱表浅肿瘤占膀胱肿瘤的2/3,是我国泌尿外科最常见的肿瘤,在治疗中需采用损伤小、可重复进行的治疗方法。我院采用经尿道膀胱肿瘤汽化电切术(transurethral vaporization of bladder tumors,TVBt)联合膀胱灌注治疗浅表性膀胱肿瘤,取得良好效果,现报道如下。1资料与方法1.1临床资料本组病例来自2009年2月-2010年10月我     

慢病毒载体介导apelin基因转染人脐带间充质干细胞的实验研究

【摘要】目的构建带有荧光标记基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和apelin基因的重组质粒pUbi-apelinFLAG-pSV40-EGFP并进行慢病毒包装,探讨其转染人脐带间充质干细胞的最佳感染复数（MOI）值及目的基因表达情况。方法化学合成目的基因片段并扩增。采用In-Fusion技术将酶切后的目的基因片段与线性质粒载体连接,转化入感受态DH5α细胞中后筛选阳性克隆并进行测序。重组质粒慢病毒载体转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度。将重组质粒慢病毒按不同MOI值转染人脐带间充质干细胞,根据转染效率得到最佳MOI值,并采用Real-timePCR及Western blot方法检测目的基因表达情况。结果通过PCR扩增获得酶切位点碱基修饰后的大小约284bp的目的基因片段,与慢病毒质粒载体连接后形成pUbi-apelin-FLAG-pSV40-EGFP重组质粒,测序结果与预期完全符合,并成功包装慢病毒颗粒。最佳MOI值为20,转染效率为（90.32±3.61）%。慢病毒载体能高效转染人脐带间充质干细胞且2周内持续稳定上调目的基因mRNA及蛋白的表达。结论重组质粒慢病毒载体pUbi-apelin-FLAGpSV40-EGFP可有效转染人脐带间充质干细胞,并可持续高表达apelin基因     

盐酸丙哌维林对豚鼠离体膀胱平滑肌条的钙拮抗作用

目的　研究盐酸丙哌维林 (P 4)对豚鼠离体膀胱平滑肌条的钙拮抗作用及作用机制。方法　采用离体平滑肌条浴槽实验方法 ,以维拉帕米为对照 ,测定P 4对CaCl2 和组胺 (His)所致离体膀胱平滑肌条的收缩及对乙酰胆碱 (ACh)所致膀胱平滑肌依赖细胞内钙、外钙收缩的影响。结果　P 41～ 1 0 0 μmol·L- 1 使CaCl2 累积量效曲线非平行右移 ,最大反应降低 ,pD2 ′为 4 73± 0 1 4。P 41 μmol·L- 1 使His量效曲线平行右移 ,最大效应不变 ,pA2 为 5 44± 0 1 4 ;1 0～ 1 0 0μmol·L- 1 使His量效曲线非平行右移 ,最大效应降低 ,pD2 ′为 4 71± 0 1 0。P 41、1 0和 1 0 0 μmol·L- 1 对ACh所致依赖细胞内钙收缩的抑制率分别为 45 77%± 6 54 %、86 2 6 %± 5 59%和 90 55 %± 3 1 1 % ,对依赖细胞外钙收缩的抑制率分别为 7 30 %± 2 89%、49 1 6 %± 6 0 9%和 88 2 5 %±3 70 %。结论　P 4低浓度时竞争性拮抗His所致膀胱平滑肌条的收缩反应 ,明显抑制膀胱平滑肌条依赖细胞内钙释放的收缩反应 ;高浓度时非竞争性拮抗His和CaCl2 所致膀胱平滑肌条的收缩反应 ,明显抑制膀胱平滑肌条依赖细胞内钙释放和外钙经钙通道内流所致收缩反应     

Regulation of ACh release from guinea pig bladder urothelial cells: potential role in bladder filling sensations

BACKGROUND AND PURPOSE

The aim of this study was to quantify and characterize the mechanism of non-neuronal ACh release from bladder urothelial cells and to determine if urothelial cells could be a site of action of anti-muscarinic drugs.

EXPERIMENTAL APPROACH

A novel technique was developed whereby ACh could be measured from freshly isolated guinea pig urothelial cells in suspension following mechanical stimulation. Various agents were used to manipulate possible ACh release pathways in turn and to study the effects of muscarinic receptor activation and inhibition on urothelial ATP release.

KEY RESULTS

Minimal mechanical stimulus achieved full ACh release, indicating a small dynamic range and possible all-or-none signal. ACh release involved a mechanism dependent on the anion channel CFTR and intracellular calcium concentration, but was independent of extracellular calcium, vesicular trafficking, connexins or pannexins, organic cation transporters and was not affected by botulinum-A toxin. Stimulating ACh receptors increased ATP production and antagonizing them reduced ATP release, suggesting a link between ACh and ATP release.

CONCLUSIONS AND IMPLICATIONS

These results suggest that release of non-neuronal ACh from the urothelium is large enough and well located to act as a modulator of ATP release. It is hypothesized that this pathway may contribute to the actions of anti-muscarinic drugs in reducing the symptoms of lower urinary tract syndromes. Additionally the involvement of CFTR in ACh release suggests an exciting new direction for the treatment of these conditions.     

蜂毒肽对离体豚鼠心房的双向作用(英文)

目的:研究蜂毒肽(Mel)对离体豚鼠心房的作用。方法:累积浓度法测定Mel给药前后左房收缩幅度及右房频率,观察量效曲线及时效曲线。观察钙离子通道阻滞剂Ver对Mel作用的影响。结果:低浓度Mel(0.1-0.8μmol·L~(-1))对左心房产生正性肌力作用;高浓度Mel(1.6-12.8μmol·L~(-1))产生负性肌力作用。Mel对右心房产生正性频率作用。Mel的双向作用可被Ver 0.3μmol·L~(-1)压低。结论:Mel对离体豚鼠左心房收缩具双向作用,对右心房具正性频率作用。Mel对左心房收缩的双向作用可被Ver压低,提示Mel对心房的作用可能通过电压依赖性钙通道。     

兔、豚鼠动脉粥样硬化模型的建立

目的：建立兔、豚鼠动脉粥样硬化模型,探讨模型形成机制并进行比较.方法：用高脂饲料喂养法建立兔、豚鼠动脉粥样硬化模型.高脂饲料喂养,检测血清甘油三脂（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL）、一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子（TNF-α）的含量,动脉病理组织学检测.结果：兔模型组TC、TG、LDL、NO、TNF-α升高,HDL降低,与正常组比较有显著性差异（P＜0.05,0.01）.豚鼠TC、TG、LDL、HDL、NO、TNF-α升高,与正常组比较有显著性差异（P＜0.05,0.01）.两种动物模型组组动脉病理检测均不同程度出现动脉内膜明显增厚,纤维隆起明显,内皮细胞肿胀、变性、部分缺失,内弹力膜断裂、模糊,中膜增厚伴平滑肌细胞增生,胞体变大,排列紊乱,内膜及中膜均可见巨噬细胞.结论：兔动脉粥样硬化诱导时间比豚鼠短,成模率比豚鼠高,病变更显著.     

尿苷三磷酸通过P2Y_2尿嘌呤受体延长豚鼠乳头状肌动作电位时程(英文)

目的:研究尿苷三磷酸(UTP)对豚鼠乳头状肌的电生理作用,及UIP作用的相关受体。方法:利用细胞内微电极技术记录豚鼠乳头状肌跨膜电位。结果:UTP、ATP和ADP均可浓度依赖性延长豚鼠乳头状肌动作电位时程(APD)。激动剂的效应强度序列为UTP=ATP>ADP,且UTP和ATP的作用存在交叉脱敏现象。Adenosine(Ado)和α,β-methyleneATP(α,β-MeATP)对豚鼠乳头状肌动作电位各参数均无影响,氨茶碱持续灌流亦不影响UTP的作用。与UTP 3mmol/L等渗的ceftriaxonum(3mmol/L)或NaCl(9mmol/L)可显著但轻微地延长APD。结论:UTP延长豚鼠乳头状肌APD的作用由特异性和非特异性两种作用组成,前者与P2Y_2受体有关。     

不饱和脂肪酸对豚鼠胃窦环行肌细胞毒蕈碱电流的影响

目的：研究外源性不饱和脂肪酸对豚鼠胃窦平滑肌细胞素毒蕈碱电流的影响及其作用机制。方法：利用膜片箝技术的全细胞记录法在急性分离的胃窦环行肌细胞上记录毒蕈碱电流。结果：在细胞外灌流液中给予花生四烯酸（arachidonic acid,AA）明显抑制I_cch,并具有量效关系：当AA的浓度在1。3和μmo1/L时,分别抑制I_cch至46%±8%,23%±5%和3.8%±0.9%;另一种不饱和脂肪酸,亚麻酸（linoleic acid,LA）也抑制I_cch,在1,5和10μmo1/L浓度分别抑制I_cch至3.8%±0.9%,35%±5%和67%±9%;用H-7（蛋白激酶C抑制剂）100μmo1/L预处理10-15分钟以后,AA分别抑制I_cch至5.5%±0.7%和3.0%±1.0%。结论：不饱和脂肪酸直抑制毒蕈碱电流,且抑制程度与不饱和脂肪酸链中的双键数目有关。     

Differences between Binding Affinities of some Antimuscarinic Drugs in the Parotid Gland and those in the Urinary Bladder and Ileum

Abstract: Possible differences between the muscarinic receptors in the guinea pig urinary bladder and those in the ileum and the parotid gland were investigated, using a receptor binding technique. The affinities of 18 antimuscarinic drugs were indirectly derived from the ability to inhibit the receptor-specific binding of the radioligand (–)³H-QNB. The Hill coefficients were close to unity which indicated that the drugs were bound to apparently uniform populations of receptors within each tissue. In contrast to traditional muscarinic antagonists, four drugs – namely, oxybutynine, dicyclomine, benzhexol and pirenzepine – bound with a significantly higher affinity in the parotid gland than in the urinary bladder and ileum. A tendency towards reversed selectivity was found for secoverine. Thus, the present results further support the hypothesis that differences in muscarinic receptors between tissues exist, e.g. smooth muscle compared with parotid gland, which can be detected only by certain antimuscarinic drugs.     

Functional expression of KCNQ (Kv7) channels in guinea pig bladder smooth muscle and their contribution to spontaneous activity

Background and Purpose

The aim of the study was to determine whether KCNQ channels are functionally expressed in bladder smooth muscle cells (SMC) and to investigate their physiological significance in bladder contractility.

Experimental Approach

KCNQ channels were examined at the genetic, protein, cellular and tissue level in guinea pig bladder smooth muscle using RT-PCR, immunofluorescence, patch-clamp electrophysiology, calcium imaging, detrusor strip myography, and a panel of KCNQ activators and inhibitors.

Key Results

KCNQ subtypes 1–5 are expressed in bladder detrusor smooth muscle. Detrusor strips typically displayed TTX-insensitive myogenic spontaneous contractions that were increased in amplitude by the KCNQ channel inhibitors XE991, linopirdine or chromanol 293B. Contractility was inhibited by the KCNQ channel activators flupirtine or meclofenamic acid (MFA). The frequency of Ca²⁺-oscillations in SMC contained within bladder tissue sheets was increased by XE991. Outward currents in dispersed bladder SMC, recorded under conditions where BK and K_ATP currents were minimal, were significantly reduced by XE991, linopirdine, or chromanol, and enhanced by flupirtine or MFA. XE991 depolarized the cell membrane and could evoke transient depolarizations in quiescent cells. Flupirtine (20 μM) hyperpolarized the cell membrane with a simultaneous cessation of any spontaneous electrical activity.

Conclusions and Implications

These novel findings reveal the role of KCNQ currents in the regulation of the resting membrane potential of detrusor SMC and their important physiological function in the control of spontaneous contractility in the guinea pig bladder.     

低渗膨胀增加豚鼠胃窦环行肌细胞钙激活钾电流和延迟整流型钾电流

目的:观察低渗膨胀对豚鼠胃窦环行肌细胞钙激活钾电流和延迟整流型钾电流的影响。方法:采用传统全细胞膜片箱技术,对以胶原酶急性分离的单细胞进行低渗灌流,观察钾电流的变化。结果:低渗 灌流液(200 Osmmol/kg)可增加钙激活钾电流和延迟整流型钾电流,钙激活钾电流的增加可被四乙基胺4mmol·L~(-1)和Charybdotoxin 200nmol·L~(-1)完全抑制;延迟整流型钾电流的增加可被四乙基胺4mmol·L~(-1)部分抑制,可被4-氨基吡啶10mmol·L~(-1)完全抑制。两种钾电流的增加幅度无显著性差异(P>0.05)。钙激活钾电流在施加低渗灌流(17.0±4.8)s后增加;延迟整流型钾电流在(30.7±13.7)s后增加,两者的潜伏期存在显著性差异(P<0.05)。结论:低渗膨胀可增加钙激活钾电流和延迟整流型钾电流,这种增加效应可能与细胞容积调节有关。