干扰LASP1基因表达对胃癌细胞BGC823增殖、迁移及侵袭能力的影响

背景与目的：LASP1是一种新的肌动蛋白结合蛋白,参与细胞骨架的重组调控及细胞迁移,在多种恶性肿瘤中高表达,并与肿瘤的增殖、侵袭和转移密切相关。但目前LASP1在胃癌发生、发展中的作用少见报道。该研究旨在探讨LASP1在胃癌增殖和侵袭中的作用及分子机制。方法：利用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白［质］印迹法(Western blot)检测LASP1在不同胃癌细胞系中的表达,应用RNA干扰技术抑制BGC823细胞中LASP1的表达,采用RTFQ-PCR和Western blot检测转染后LASP1的表达,应用体外增殖、迁移和侵袭实验检测转染后细胞的增殖、迁移和侵袭能力,通过F-actin聚合实验检测细胞的F-actin的聚合能力,采用Western blot检测转染前后BGC823细胞中Akt的磷酸化情况。结果：LASP1在胃癌BGC823细胞中高表达。RNA干扰技术沉默LASP1基因后,干扰组与对照组相比,LASP1的mRNA和蛋白表达水平均明显下降。细胞增殖实验显示,干扰组细胞的增殖率低于对照组(P<0.05);Transwell迁移和侵袭实验发现,与对照组相比,干扰组细胞的迁移和侵袭能力均明显降低(P<0.05);在干扰组细胞内的F-actin聚合量比对照组减少(P<0.05);在干扰组细胞内Akt磷酸化受到抑制。结论：LASP1的表达降低可以抑制胃癌BGC823细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力,LASP1通过调节F-actin的聚合和Akt磷酸化从而影响胃癌细胞的侵袭、转移。     

PTTG1影响胶质瘤细胞侵袭力机制的研究

背景与目的：研究证实垂体肿瘤转化基因1(pituitary tumor transforming gene 1,PTTG1)的表达情况与各类肿瘤细胞的恶性程度有关,但是其在胶质瘤中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨PTTG1在恶性胶质瘤侵袭中的作用及其临床意义。方法：应用蛋白质印迹法(Western blot)检测PTTG1蛋白在不同胶质瘤细胞系中的表达;采用小RNA质粒干扰技术抑制U87细胞中PTTG1蛋白的表达,应用Western blot技术检测转染的效率;通过体外侵袭实验检测转染后细胞侵袭力的变化;采用Western blot技术检测经过表皮细胞生长因子(epithelial growth factor,EGF)刺激后敲除PTTG1的细胞组(siPTTG1/U87)与转染空载的细胞组(Scr/U87)中Akt、ARK5磷酸化的情况。结果：PTTG1蛋白在各恶性胶质瘤细胞系中均高表达;敲除PTTG1后U87细胞的侵袭力明显下降;对Scr/U87细胞进行EGF刺激5 min后,Akt、ARK5的磷酸化情况显著增强,而无论有无EGF的刺激,siPTTG1/U87中Akt、ARK5的磷酸化情况都没有明显改变。结论：在恶性胶质瘤细胞中,PTTG1蛋白呈高表达状态并且与侵袭性显著相关,其对侵袭性的调控可能是通过Akt-ARK5通路实现的。     

miR-153靶向ZEB2抑制胶质母细胞瘤侵袭与转移

目的:探究miR-153对人胶质母细胞瘤（glioblastoma,GBM）侵袭转移的影响及相关作用机制。方法:利用qRT-PCR检测miR-153在GBM中的表达;将miR-153转染至胶质瘤U251细胞后,应用qRT-PCR 验证转染效率;应用Western blot、Transwell及划痕实验检测U251细胞的上皮间质转化、细胞侵袭及转移能力的变化;应用qRT-PCR及Western blot检测ZEB2的mRNA和蛋白表达;利用质粒转染技术过表达miR-153后,同时过表达ZEB2,再应用Transwell及划痕实验检测U251细胞的侵袭及转移能力的变化。结果:与对照相比,miR-153在GBM中低表达;过表达miR-153显著抑制胶质瘤U251细胞的上皮间质转化、细胞侵袭及转移,并能够抑制U251细胞中ZEB2的蛋白表达;ZEB2过表达有效阻断了miR-153抑制U251细胞侵袭及转移的作用。结论:miR-153能够靶向下调ZEB2,进而抑制胶质瘤U251细胞上皮间质转化及细胞侵袭转移。     

VHL基因对U251胶质瘤细胞侵袭和迁移的影响

  目的   研究VHL基因对U251胶质瘤细胞侵袭和迁移能力的影响   方法   使用VHL表达质粒转染胶质瘤细胞,采用RT-PCR检测VHL mRNA表达,Western blot检测VHL、MMP-2、MMP-9蛋白表达,应用Transwell体外侵袭实验、划痕实验检测上调VHL基因后对U251胶质瘤细胞侵袭迁移能力的影响。使用VHL表达质粒处理后的U251细胞建立裸鼠颅内模型,利用免疫组织化学染色法对颅内模型组织切片中VHL、MMP-2、MMP-9蛋白表达进行检测。   结果   VHL表达质粒转染胶质瘤细胞后VHL mRNA、VHL蛋白表达增高,MMP-2、MMP-9蛋白表达下降;并抑制U251胶质瘤细胞侵袭迁移能力。对染色后的组织切片进行分析,VHL表达质粒处理组中VHL的表达较对照组明显升高,MMP-2、MMP-9蛋白较对照组表达减少。   结论   VHL基因能够有效抑制U251胶质瘤细胞侵袭迁移能力,VHL基因可成为治疗胶质瘤的一个有效靶点。      

人脑胶质瘤高表达Snail促进肿瘤细胞的侵袭

目的:观察Snail蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达情况,探讨Snail表达对人脑胶质瘤U251细胞侵袭的影响。方法:收集首都医科大学附属北京天坛医院及北京安贞医院神经外科手术切除的脑胶质瘤组织65例,应用免疫组织化学S-P法检测人脑胶质瘤组织中Snail的表达。体外化学合成Snail序列特异性小干扰RNA(Snail-siRNA),应用脂质体介导转染U251细胞;RT-PCR、Western blotting检测转染后U251细胞中Snail mRNA和蛋白、E-cadherin蛋白表达水平变化,并采用Transwell小室检测转染后U251细胞侵袭能力的变化。结果:与正常脑组织相比,人脑胶质瘤组织中Snail蛋白阳性表达率明显增强(66.2%vs0,P<0.01),并且Ⅰ～Ⅱ级的胶质瘤组织阳性Snail阳性率明显低于Ⅲ～Ⅳ级(44.8%vs83.3%,P<0.01)。Snail-siRNA转染抑制U251细胞中Snail mRNA和蛋白的表达。Snail-siRNA转染组U251细胞中E-cadherin蛋白的表达明显高于Ctrl-siRNA组与未转染组(0.64±0.21vs0.15±0.16,0.21±0.19,P<0.01)。Snail-siRNA转染显著抑制U251细胞的侵袭(87.0±2.4vs140.0±4.9,136.0±5.3;P<0.05)。结论:人脑胶质瘤组织高表达Snail蛋白,siRNA干扰Snail蛋白的表达可抑制胶质瘤U251细胞的侵袭。     

上调 Notch－1基因对 U215细胞 AKT －mTOR 通路的影响

目的：观察上调 Notch －1基因对人胶质瘤 U251细胞生学物行为及 AKT －mTOR 信号通路的影响。方法：采用 pNL －NICD 慢病毒感染 U251细胞,以 RT －PCR 和 Western －Blot 检测 Notch －1基因 mRNA 和蛋白的表达,以 MTT 检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期变化,Transwell 实验检测细胞侵袭能力,同时检测 Notch －1上调对 AKT、mTOR、P70S6K、4Ebp －1蛋白的影响。结果：与对照组比较,NICD 慢病毒转染72h后,Notch －1基因 mRNA 和蛋白表达明显增高（P ＜0．01）;Notch －1上调明显促进 U251细胞增殖、侵袭、促进细胞进入 S 期,增加周期蛋白 Cyclin D1、CDK －4的表达,促进 AKT、mTOR 蛋白磷酸化。结论：上调 Notch －1基因促进 U251细胞增殖、侵袭,其机制和活化 AKT －mTOR 通路有关。     

低氧诱导U251细胞中miRNA-210的表达及对肿瘤转移的影响

目的 研究低氧条件下胶质瘤细胞系U251细胞中miRNA-210的表达以及对肿瘤转移能力的影响。方法 低氧条件（1% O2）培养胶质瘤细胞系U251,利用Western blot检测不同诱导时间HIF-1α水平变化, 利用 real time PCR检测低氧不同诱导时间miRNA-210表达变化,通过Transwell小室检测U251细胞侵袭能力,利用Western blot检测低氧条件下Vmp1表达变化。结果 低氧诱导U251细胞6、12和24h,可检测到HIF-1α水平随着诱导时间而增加;在低氧诱导的不同时间点可检测到miRNA-210表达逐渐增加,给予HIF-1α抑制剂2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol,2-ME2)后miRNA-210的表达受到抑制;低氧条件下U251细胞侵袭转移能力增强,在miRNA-210抑制剂antagonist miR210转染后,U251细胞转移能力受到抑制,低氧条件下U251细胞中Vmp1蛋白表达下降,antagonist miR210转染可以逆转Vmp1的表达。结论 低氧可以通过HIF-1α诱导miRNA-210表达增加,miRNA-210具有促进U251细胞转移的作用,miRNA-210可能通过调节Vmp1表达发挥作用。     

FUBP1基因在脑胶质瘤中的表达及其对U251细胞凋亡的影响

目的：研究FUBP1基因在脑胶质瘤中的表达及其对胶质瘤U251细胞凋亡的影响。方法：Real-time PCR检测35例脑胶质瘤及相应癌旁组织中FUBP1 mRNA的表达。设计并合成FUBP1基因特异性的siRNA,转染U251细胞。转染后,western blot检测转染后FUBP1蛋白的表达,双标流式细胞法检测细胞凋亡率。结果：与癌旁组织相比,FUBP1 mRNA在脑胶质瘤组织中表达明显上调。转染后,U251细胞中的FUBP1蛋白表达明显降低,同时,凋亡率明显增加。结论：FUBP1基因在脑胶质瘤中存在表达异常,其表达降低能够促进细胞凋亡。     

Galectin-3调控Wnt信号通路对脑胶质瘤细胞凋亡的影响

目的:半乳糖凝集素-3（Galectin-3）调控Wnt信号通路对人脑胶质瘤细胞凋亡的影响。方法:RT-PCR及Western blot检测人脑胶质瘤组织中Galectin-3的mRNA和蛋白表达;Western blot检测人脑胶质瘤U251、U87、SHG-44细胞中Galectin-3的蛋白表达;将Galectin-3的特异性siRNA(Galectin-siRNA)转染人脑胶质瘤U87细胞,Western blot、流式细胞术分别检测转染48 h后Galectin-3、Wnt5a、β-catenin和Cleaved caspase3蛋白表达及细胞凋亡率。结果:Galectin-3在人脑胶质瘤组织mRNA和蛋白表达均显著高于瘤旁组织（P＜0.01）;U251、U87、SHG-44细胞中Galectin-3蛋白表达从高到低为U87>U251>SHG-44,选择U87细胞作为后续研究;Galectin-3-siRNA1的Galectin-3蛋白表达最低,选择作为后续研究;NC-siRNA组细胞凋亡率、Cleaved caspase3、Wnt5a、β-catenin蛋白表达与对照组差异不显著（P＞0.05）,与对照组比较,Galectin-3-siRNA组细胞凋亡率明显升高,Cleaved caspase3蛋白表达明显升高,Wnt5a和β-catenin蛋白表达明显降低（P＜0.01）。结论:沉默Galectin-3表达可诱导人脑胶质瘤细胞凋亡,机制可能与Wnt信号通路的下调有关。     

STIP1在脑胶质瘤组织中的表达及对胶质瘤细胞株增殖、凋亡、侵袭的影响

目的:检测磷酸化应激诱导蛋白1（stress-induced phosphoprotein 1,STIP1）在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达差异,探讨STIP1对胶质瘤细胞株U87、U251细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法:运用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)、免疫组化及蛋白印迹检测胶质瘤组织和正常脑组织中STIP1的表达;小干扰RNA（STIP1-siRNA）转染U87、U251细胞株后,使用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞仪和Transwell小室观察细胞的增殖、凋亡和侵袭能力。结果:STIP1在胶质瘤Ⅳ级组织中的表达明显高于正常脑组织,但在胶质瘤Ⅱ、Ⅲ级中的表达与正常脑组织无明显差异。U87、U251细胞株转染STIP1-siRNA后,细胞增殖和侵袭能力明显受到抑制,而细胞凋亡率明显上升。结论:STIP1在胶质母细胞瘤组织中高表达,下调STIP1可以抑制胶质瘤细胞株U87和U251的增殖,阻滞细胞周期,促进其细胞凋亡,并可抑制其侵袭力。     

siRNA干扰ARK5蛋白表达对U251细胞侵袭潜能影响机制探讨

目的：探讨siRNA干扰降低腺苷酸活化蛋白激酶5（AMPK—related protein kinase5,ARK5）表达对U251细胞侵袭潜能的影响及其机制。方法：采用蛋白质印迹法检测U251细胞中ARK5表达。应用siRNA干扰技术转染U251细胞株,并采用蛋白质印迹法检测瞬时转染后ARK5蛋白表达情况。通过体外侵袭实验检测细胞转染后侵袭能力的变化。ARK5下降后,蛋白质印迹法检测间质细胞来源的YKL-40、N—cadherin、Vimentin蛋白和调节因子Snail、Slug、Twistl和Zebl的表达。结果：转染ARK5质粒的U251细胞ARK5表达下降。ARK5表达降低的U251细胞侵袭并穿透Matrigel膜基质的细胞数量为22,U251对照组为41,SCR／u251对照组为42,两两比较,ARK5表达降低的实验组透膜数比两对照组少（P〈O．001）,同时蛋白质印迹法结果显示,YKL-40、N-cadherin和Vimentin蛋白表达量降低,与间质转化相关的转录因子仅Snail的表达降低,而转录因子Slug、Twistl和Zebl表达无明显改变。结论：应用siRNA干扰技术降低ARK5蛋白的表达使u251细胞侵袭转移能力降低,同时YKL-40、N-cadherin和Vimentin蛋白和转录因子Snail的表达量降低,提示ARK5蛋白表达降低可通过调节间质转化影响u251细胞的侵袭。     

Nir1 promotes invasion of breast cancer cells by binding to chemokine (C–C motif) ligand 18 through the PI3K/Akt/GSK3β/Snail signalling pathway

Chemokine (C–C motif) ligand 18 (CCL18), which is derived from tumour-associated macrophages (TAMs), plays a critical role in promoting breast cancer metastasis via its receptor, PYK2 N-terminal domain interacting receptor 1 (Nir1). However, the molecular mechanism by which Nir1 promotes breast cancer metastasis by binding to CCL18 remains elusive. In this study, Nir1 expression was associated with lymph node and distant metastasis in patients with invasive ductal carcinoma. For the first time, we report that Nir1 binding to CCL18 promotes the phosphorylation of Akt, LIN-11, Isl1 and MEC-3 protein domain kinase (LIMK), and cofilin, which is a critical step in cofilin recycling and actin polymerisation. Interestingly, Nir1 binding to CCL18 can enhance cell mesenchymal properties and induce epithelial–mesenchymal transition (EMT). Mechanistically, Nir1 binding to CCL18 stabilises Snail via the Akt/GSK3β signalling pathway. In support of these observations, Nir1 binding to CCL18 promoted lung metastasis and LY294002 could inhibit it in vivo. In summary, our in vitro and in vivo results indicate that Nir1 binding to CCL18 plays an important role in breast cancer invasion/metastasis. This study identified both Nir1 and CCL18 as potential anti-invasion targets for therapeutic intervention in breast cancer.     

Gab2-Akt-ARK5通路在胶质瘤侵袭中的研究

  目的  探讨Gab2-Akt-ARK5通路在胶质瘤侵袭中的意义。  方法  采用免疫组织化学SP法检测90例胶质瘤组织中ARK5及Gab2表达。采用小RNA干扰转染LN-229细胞株,Western Blot检测瞬时转染后ARK5及Gab2表达。体外侵袭实验检测转染后侵袭能力变化及Western Blot检测Gab2下降后Akt和ARK5的磷酸化。  结果  胶质瘤组织中ARK5和Gab2免疫组织化学阳性结果呈正相关且在高级别胶质瘤（WHO分级为Ⅲ、Ⅳ级）中表达明显高于低级别胶质瘤（WHO分级为Ⅰ、Ⅱ级）。转染ARK5、Gab2、ARK5-Gab2及SCR质粒的LN-229细胞分别称siARK5/LN-229、siGab2/LN-229、siARK5-siGab2/LN-229和SCR/LN-229。其中siARK5干扰效率为70%,siGab2的干扰效率为75%。转染后,与SCR/LN-229相比,siARK5/LN-229中ARK5表达降低,siGab2/LN-229中Gab2表达降低,siARK5-siGab2/LN-229中ARK5和Gab2表达均降低。siARK5/LN-229和siGab2/LN-229侵袭并穿透Matrigel膜基质的细胞数均比对照组少（P < 0.01）,且siARK5-siGab2/LN-229细胞数减少更显著（P < 0.01）。在IGF-1刺激下,siGab2/LN-229中Akt和ARK5的磷酸化减弱。  结论  应用小RNA干扰技术降低ARK5或Gab2表达使LN-229细胞侵袭转移能力降低,同时Gab2表达降低抑制ARK5和Akt磷酸化,提示Gab2-Akt-ARK5通路参与胶质瘤细胞的侵袭。      

沉默circRNA hsa_circ_0103809表达抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭

目的:通过研究环状RNA(circRNA) hsa_circ_0103809对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响,来明确 hsa_circ_0103809在胶质瘤进展中所起到的作用。方法:采用qRT-PCR检测hsa_circ_0103809在胶质瘤细胞系U251和正常脑胶质细胞系HEB中表达水平的差异。U251细胞经小干涉RNA（siRNA）介导下调hsa_circ_0103809的表达水平后,采用qRT-PCR检测沉默效率。将U251细胞分为两组,即siRNA-circ沉默实验组和siRNA-NC阴性对照组,实验组转染hsa_circ_0103809的siRNA,对照组转染siRNA对照序列,后续分别使用CCK-8实验、EdU实验和Transwell实验检测hsa_circ_0103809的表达下调对U251细胞增殖和侵袭的影响。结果:hsa_circ_0103809在胶质瘤U251细胞中的表达水平明显高于正常脑胶质HEB细胞（P＜0.01）。在U251细胞中转染siRNA-hsa_circ_0103809后其表达水平明显降低（P＜0.01）。CCK-8实验结果显示,沉默hsa_circ_0103809的表达后,U251细胞在24 h和48 h的光密度（OD）值和对照组无明显差异,但实验组在72 h的OD值明显低于对照组（P＜0.01）。EdU实验结果显示,沉默hsa_circ_0103809的表达后,U251细胞的增殖能力较对照组明显降低（P＜0.01）。Transwell实验结果显示,沉默hsa_circ_0103809的表达后,U251细胞的侵袭能力较对照组明显降低（P＜0.001）。结论:hsa_circ_0103809在胶质瘤U251细胞中高表达,沉默hsa_circ_0103809表达可显著抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭。     

野生型PTEN基因对胶质细胞瘤侵袭力的影响

目的观察转入野生型PTEN基因的胶质瘤细胞体外侵袭力改变,探索PTEN基因对胶质瘤细胞影响方式.方法构建野生型PTEN基因的pcDNA3.1 Hygro(-)真核质粒载体,并用于转染PTEN基因失活的U251细胞系,采用重组基底膜侵袭模型,观察转染前后细胞侵袭力的改变.结果转染PTEN基因可以明显抑制U251细胞的侵袭力.结论 PTEN基因可通过抑制胶质瘤细胞的侵袭力达到抑制肿瘤生长.     

SDF-1 and CXCR4 are up-regulated by VEGF and contribute to glioma cell invasion

Glioma cells produce vascular endothelial growth factor (VEGF) to induce vascularization and thereby supply the malignant tissue with oxygen and nutrients. However, little is known about the direct effects of VEGF on tumor cells. In this study, we investigate the ability of VEGF to promote proliferation and invasion of human glioma cells (U251n). Since the chemokine and its receptor, SDF-1/CXCR4, promote glioma cell proliferation and are up-regulated in human glioblastomas, we also tested the effects of VEGF on SDF-1 and CXCR4 mRNA expression. Using cell culture, the effect of VEGF on proliferation of U251n cells was measured using ELISA to detect incorporated BrdU as a marker of DNA syntheses. The effects of VEGF and SDF-1 on U251n cell invasion and proliferation were measured using inhibitors to VEGF receptor1 and receptor2, DC101 and MF1, respectively, and a CXCR4 antagonist (AMD3100). SDF-1 and CXCR4 mRNA expression in U251n and U87MG cells were measured using quantitative PCR. VEGF antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide (AS-VEGF) was also used to down-regulate VEGF expression in U251n cells. VEGF significantly increased U251n cell proliferation and invasion in a dose-dependent manner. These effects were blocked by the VEGF receptor inhibitors, DC101/MF1. The CXCR4 antagonist AMD3100 blocked U251n increased invasion, but not proliferation. CXCR4 and SDF-1 mRNA were up-regulated when U251n and U87MG cells were treated with VEGF. Eight micrometer VEGF antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide (AS-VEGF) down-regulated CXCR4 and SDF-1 mRNA levels in U251n cells. VEGF has a direct effect on U251n glioma cell proliferation and invasion. VEGF up-regulates SDF-1 and CXCR4 mRNA expression, and contributes to U251n cell invasion.