肝癌细胞及正常肝细胞中间隙连接蛋白Cx32、Cx43的表达--激光扫描共聚焦显微镜研究

目的研究间隙连接蛋白Cx32、Cx43在肝癌细胞系HHCC、SMMC-7721及正常肝细胞系QZG中的表达.方法采用免疫荧光标记技术,对HHCC、SMMC-7721及QZG细胞中Cx32、Cx43蛋白进行激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)分析.结果Cx2、Cx43蛋白定位于肝细胞胞质中,在HHCC、SMMC-7721中阳性细胞率、阳性细胞的荧光强度较QZG中明显减弱.结论Cx32、Cx43蛋白表达降低可能与肝细胞癌的发生有关.     

白藜芦醇通过下调PRMT5表达抑制肝胆管癌SMMC-7721细胞的增殖、侵袭和细胞周期

目的：探究白藜芦醇（Res）通过调控PRMT5表达对肝胆管癌SMMC-7721细胞增殖、侵袭、细胞周期的影响及其机制。方法：常规培养正常肝细胞LO2和SMMC-7721细胞,用0、20、40、80μmol/L的Res进行处理,用qPCR法、MTT法、Transwell实验、流式细胞术和WB法分别检测Res处理后PRMT5 mRNA在LO2和SMMC-7721细胞中的表达,Res对SMMC-7721细胞增殖能力、侵袭能力、细胞周期和凋亡,以及PRMT5、cyclin D1和cyclin E1蛋白表达的影响。结果：PRMT5在SMMC-7721细胞中呈高表达（P<0.01）;20、40、80μmol/L Res均能明显抑制PRMT5 mRNA和蛋白在SMMC-7721细胞中的表达（均P<0.01）,抑制SMMC-7721细胞的增殖能力（P<0.01）和侵袭能力（P<0.05）,阻滞SMMC-7721细胞周期于G0/G1期并促进其凋亡（P<0.01）,明显抑制SMMC-7721细胞中周期蛋白cyclin D1、cyclin E1蛋白的表达（P<0.01）。...     

长链非编码RNA CCAT1在肝细胞癌组织及细胞株中的表达及临床意义

目的 探讨长链非编RNA 结肠癌相关转录子1（LncRNA-CCAT1）在肝细胞癌（HCC）组织及细胞株中的表达及临床意义。方法 采用QPCR法检测CCAT1在4种肝癌细胞株（SMMC-7721、Hep3B、Hub7和HepG2）、正常肝细胞株LO2和42例HCC组织及其癌旁组织中的差异性表达,分析CCAT1表达与HCC临床病理特征的关系（性别、年龄、甲胎蛋白、肿瘤大小、肿瘤数量、淋巴结转移、分化程度和TNM分期）。结果 与正常肝细胞株LO2相比,CCAT1在SMMC-7721、Hep3B、Hub7和HepG2细胞株中均呈高表达（P＜0.05）,其中在HepG2细胞中表达水平最高。CCAT1在HCC组织中的表达水平高于其癌旁组织,差异有统计学意义（P=0.016）;CCAT1在肝癌组织中的表达水平与肿瘤大小、甲胎蛋白、分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关（P＜0.05）,而与性别、年龄、肿瘤数量无关（P＞0.05）。结论 LncRNA-CCAT1与HCC发生、发展及预后有关,其作用机制值得进一步研究。     

miR-223-3p 通过靶向RAC1 调控肝细胞癌SMMC-7721 细胞的增殖和凋亡

目的：探讨miR-223-3p 通过调控Ras 相关C3 肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，RAC1）对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法：选用2016 年8 月至2018 年8 月吉林市中心医院手术切除的30 例HCC 组织及其癌旁组织标本和人HCC 细胞系SMMC-7721、Bel-7402、HepG2 及人正常肝细胞QSG-7701，用qPCR检测HCC组织和细胞系中miR-223-3p的表达水平。分别将miR-223-3p mimics、miR-223-3p inhibitor 和siRAC1转染至SMMC-7721 细胞，通过CCK-8、克隆形成实验和Annexin V-FITC/PI 染色流式细胞术检测SMMC-7721 细胞的增殖、克隆形成和凋亡水平。用双荧光素酶报告基因实验检测miR-223-3p 与RAC1 的靶向关系，Western blotting 检测细胞中RAC1 蛋白的表达水平。结果：miR-223-3p 在HCC组织的表达水平显著低于癌旁组织（P<0.01），其表达水平与肿瘤大小、TNM分期及肿瘤分化病理特征相关（P<0.05 或P<0.01）；miR-223-3p 在HCC细胞系表达水平显著低于QSG-7701 细胞（均P<0.01），以在SMMC-7721细胞中表达水平最低。双荧光素酶报告基因实验证实RAC1 是miR-223-3p 靶基因，miR-223-3p 靶向负调控RAC1 的表达。转染miR-223-3p mimics 显著抑制SMMC-7721 细胞的增殖和克隆形成能力（P<0.05 或P<0.01），并促进细胞凋亡（P<0.01）；转染miR-223-3p inhibtor 则逆转miR-223-3p mimics 对细胞的抑制作用。结论：过表达miR-223-3p 抑制HCC细胞增殖和克隆形成能力并促进细胞凋亡，其机制可能与靶向下调RAC1表达有关。     

连接蛋白43在乳腺癌组织及癌前病变组织中的表达意义

目的 观察连接蛋白43(Cx43)在乳腺癌组织及癌前病变组织中的表达,探讨Cx43在乳腺癌发生过程中的作用机理.方法 应用S-P免疫组织化学方法,检测Cx43在20例乳腺癌组织、20例乳腺导管上皮内瘤变组织、10例良性乳腺病变组织和10例癌旁正常乳腺组织中的表达.应用RT-PCR和Western blot法,检测Cx43 mRNA及Cx43蛋白在四组乳腺组织中的表达.结果 乳腺癌组织与乳腺导管上皮内瘤变组织中Cx43蛋白表达减少,且Cx43蛋白在乳腺癌组织中的表达明显低于乳腺导管上皮内瘤变组织中的表达(P<0.01).RT-PCR显示乳腺导管上皮内瘤变组织中Cx43 mRNA的表达量减少,而乳腺癌组织中Cx43 mRNA的表达量明显减少(P<0.01).结论 Cx43蛋白低表达及其构成的缝隙连接细胞间通讯异常,与基因转录受到抑制有关,从而可能导致乳腺上皮细胞分化异常和过度增生,促进了乳腺癌的发生.     

hAph2β和c-abl在肝细胞癌中的表达及其相互作用

目的:探讨hAph2β蛋白与c-abl蛋白在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的相互作用.方法:RT-PCR和Western 印迹法分析c-abl基因和hAph2基因在肝癌细胞株及永生化人肝细胞株中的表达.脂质体转染、免疫共沉淀和Western印迹法检测hAph2β与c-abl在SMMC-7721细胞中的相互作用.激光共聚焦-荧光显微镜观察hAph2β和c-abl在SMMC-7721细胞中的定位.用组织芯片结合免疫组织化学法检测hAph2β和c-abl蛋白在肝癌和相应癌旁组织中的表达差异,统计学分析其表达差异的临床意义.结果:RT-PCR检测结果表明,c-abl mRNA在HepG2、L-02及MHCC-LM3细胞中高表达,在SMMC-7721、BEL-7402、Hep3B和Chang's liver细胞中中度表达,而在Huh-7、MHCC-97L细胞中低表达.Western印迹法检测结果发现,hAph2总蛋白在HepG2、Huh-7、MHCC-LM3和MHCC-97L细胞中高表达,在BEL-7402、L-02细胞中低表达;c-abl蛋白在Huh-7细胞中低表达.免疫共沉淀观察发现SMMC-7721细胞中过表达的hAph2β-GFP和内源性c-abl相互作用.荧光免疫细胞化学检测发现hAph2β和c-abl在SMMC-7721细胞中部分共定位.免疫组织化学检测结果表明,hAph2β/c-abl蛋白在人正常肝组织、硬化肝组织、癌旁肝及原发性HCC癌组织中的强阳性率分别为:100%/50%、91.7%/100%、100%/89.5%和50.9%/19.3%,其中hAph2β和c-abl在癌旁肝组织中的表达均明显高于肝癌组织(均P<0.001),2者在56.1%(32/57)的肝癌组织中同时高或低表达.结论:hAph2β和c-abl在SMMC-7721细胞中相互作用,在原发性HCC及相关组织中共表达.     

CISD2在肝细胞肝癌组织和细胞中的表达及其临床意义

目的:探究CDGSH铁硫结构域2(CISD2)在肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）组织和细胞中的表达及临床病理意义。方法:采用免疫组织化学染色方法检测100例HCC肿瘤组织标本及46例癌旁肝组织标本中CISD2的蛋白表达水平,分析CISD2与临床病理特征、增殖相关蛋白Ki-67、患者生存率的相关性;运用Western blot法检测人HCC细胞株BEL7404、HepG2、SMMC-7721以及人正常肝细胞株L02中CISD2的表达,分析其表达差异。结果:CISD2在HCC肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁肝组织,CISD2在肝癌细胞株中的表达水平也明显高于正常肝细胞,差异有统计学意义(P＜0.01)。CISD2的表达与HCC患者的肿瘤大小（P＜0.05）以及Ki-67指数相关(P＜0.001),CISD2高表达患者的总生存率低于低表达者。结论:CISD2在HCC组织和细胞中高表达,其表达水平与患者的预后有关。CISD2可能成为HCC预后判断的标志和治疗的潜在靶点。     

干扰PRMT2基因对肝癌细胞系生物学行为的影响

目的:研究抑制蛋白质精氨酸甲基转移酶2(protein arginine methyltransferase 2,PRMT2)基因的表达对肝癌细胞系生物学行为的影响。方法:qRT-PCR检测人肝癌细胞系(HepG2和SMMC-7721)和人正常肝细胞(LO2)中PRMT2的表达情况;设计并合成针对PRMT2基因的3对小干扰RNA,体外通过脂质体Lipofectamine 3000转染到相对高表达PRMT2的人肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721中抑制PRMT2基因的表达,并设置阴性对照组（NC组）和空白对照组。qRT-PCR、Western blot检测转染后细胞PRMT2 mRNA水平和蛋白水平的变化。CCK-8法检测转染后细胞增殖能力,Transwell小室检测细胞体外迁移及侵袭能力。结果:与人正常肝细胞LO2相比,PRMT2基因在人肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721中相对高表达。将siPRMT2转染HepG2和SMMC-7721细胞后,与NC组相比,siPRMT2-1和siPRMT2-2组的PRMT2 mRNA和蛋白表达均明显降低（P均<0.05）,NC组与空白对照组无明显差异。与NC组相比,将siPRMT2-1和siPRMT2-2转染进HepG2和SMMC-7721细胞后,细胞增殖速度减慢、迁移和侵袭能力显著减弱（P均<0.05）,NC组与空白对照组无明显差异。结论:RNA干扰抑制PRMT2表达后,抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭,PRMT2可能影响肝癌的预后。     

缝隙连接蛋白43组成的缝隙连接对依托泊苷抗肿瘤作用的影响

背景与目的:缝隙连接能够增强化疗药物的细胞毒性,但缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)组成的缝隙连接对依托泊苷抗肿瘤作用的影响尚不清楚。因此,本研究拟观察睾丸癌细胞中Cx43对依托泊苷抗肿瘤作用的影响。方法:采用细胞接种荧光示踪实验检测睾丸癌细胞由Cx43形成的缝隙连接通讯功能,同时检测不同的药物(18-α-甘草次酸及维甲酸)和Cx43干扰RNA对缝隙连接功能的影响;采用标准细胞集落形成分析法检测睾丸癌细胞中由Cx43形成的缝隙连接通讯功能改变后,对依托泊苷抑制肿瘤细胞生长作用的影响。结果:荧光示踪实验显示18-α-甘草次酸可显著降低缝隙连接通讯功能,而维甲酸则可增强缝隙连接功能;Cx43干扰RNA能够显著抑制缝隙连接功能。标准细胞集落形成实验结果表明,在缝隙连接形成的睾丸癌细胞中,18-α-甘草次酸显著降低依托泊苷对睾丸癌细胞生长的抑制作用,而维甲酸则增强依托泊苷对睾丸癌细胞生长的抑制作用;应用Cx43干扰RNA能够显著降低依托泊苷对睾丸癌细胞生长的抑制作用。结论:睾丸癌细胞中Cx43形成的缝隙连接通讯功能降低能够减弱依托泊苷的抗肿瘤作用;而缝隙连接通讯功能增强能够增强其抗肿瘤作用。     

非小细胞肺癌中Cx43蛋白表达水平及其临床意义

目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织中缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)的表达水平及其与临床病理、转移及患者生存时间的关系.方法 选取行手术治疗的NSCLC患者76例,通过免疫组化法检测患者癌组织及癌旁组织中Cx43蛋白表达水平,分析其与患者临床病理、转移的关系;随访3年预后情况,比较Cx43蛋白阳...     

细胞间隙连接基因connexin32、connexin43及其蛋白在肝癌细胞系中的表达

为了探讨细胞间隙连接ｃｏｎｎｅｘｉｎ（ｃｘ）基因及其蛋白产物在肝癌细胞系的表达及意义,应用核酸分子原位杂交和流式细胞仪分析技术,研究肝癌细胞系ＨＨＣＣ、ＳＭＭＣ７７２１和正常肝细胞系ＱＺＧ中,间隙连接基因ｃｘ３２、ｃｘ４３ｍＲＮＡ及其蛋白产物的表达规律。原位杂交显示,ｃｘ３２、ｃｘ４３ｍＲＮＡ在ＨＨＣＣ、ＳＭＭＣ７７２１和ＱＺＧ中均呈强阳性。流式细胞仪分析,Ｃｘ３２蛋白在ＨＨＣＣ、ＳＭＭＣ７７２１和ＱＺＧ中阳性细胞计数率分别为１．９％、１．７％和９９．０％,Ｃｘ４３蛋白阳性细胞计数率分别为７．３％、２．３％和９９．１％。Ｃｘ３２、Ｃｘ４３蛋白在ＨＨＣＣ、ＳＭＭＣ７７２１中阳性细胞计数率与ＱＺＧ相比,有非常显著性差异（Ｐ＜０．０１）。ｃｘ３２、ｃｘ４３基因在转录后水平的调控异常所导致的蛋白表达降低与ＨＣＣ的发生密切相关。     

生物节律相关基因 Cry1与肝癌的相关性探讨

目的研究生物节律相关基因Cry1与肝癌发生发展的相关性.方法逆转录PCR、Northern blot和免疫组织化学方法检测Cry1在各种肿瘤细胞系、人正常组织及人肝癌与配对的癌旁组织中的表达.构建Cry1重组的真核表达质粒并转染肝癌细胞SMMC-7721.生长曲线和软琼脂克隆形成试验检测Cry1过表达的SMMC-7721细胞的体外增殖速度.逆转录PCR检测与Cry1相互作用的生物节律基因在Cry1过表达的SMMC-7721中的表达.结果Cry1在人各种正常组织中均有不同程度的表达.Cry1在人肝癌癌旁组织中的表达水平高于癌组织中的表达.过表达Cry1对SMMC-7721细胞的体外增殖没有明显影响.结论生物节律相关基因Cry1与肝癌发生发展可能有一定的相关性.     

MiR 142 5p通过靶向IGF2BP3调控多柔比星诱导的肝癌细胞凋亡

目的:探讨miR-142-5p对多柔比星诱导的原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞凋亡的影响及其作用机制.方法:收集广西医科大学附属肿瘤医院88例HCC患者手术切除的癌组织及癌旁组织(距癌灶组织边缘2～5cm)标本.采用实时荧光定量PCR检测人HCC组织和癌旁组织、人正常肝细胞以及HCC细胞系中miR-142-5p的表达量.向HCC细胞SMMC-7721中转染miR-142-5p mimics,流式细胞术检测过表达miR-142-5p后SMMC-7721细胞在多柔比星(doxorubicin)(1 μg/ml)诱导下凋亡的变化;生物信息学方法预测miR-142-5p可靶向结合胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3(in-sulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 3,IGF2BP3)基因,并采用荧光素酶报告基因实验进行验证.采用实时荧光定量PCR及Western blotting检测过表达miR-142-5p的SMMC-7721细胞中IGF2BP3的mRNA及蛋白表达情况.结果:与癌旁组织和正常肝细胞相比,HCC组织(-6.91±2.61vs-11.59±2.59,P＜0.01)和多种HCC细胞系中miR-142-5p呈明显低表达(均P＜0.01);过表达miR-142-5p可显著促进多柔比星诱导的HCC细胞SMMC-7721的凋亡[(49.40±3.47)％ vs (19.50±1.74)％,P＜0.01];过表达miR-142-5p可明显降低HCC细胞中IGF2BP3的mRNA及蛋白表达水平(P＜0.01),敲减IGF2BP3表达可进一步促进多柔比星诱导的SMMC-7721细胞的凋亡(P＜0.01).荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-142-5p能够抑制IGF2BP3的3'UTR荧光素酶报告基因的活性.结论:miR-142-5p在HCC组织标本和体外培养细胞系中的表达水平均显著降低,转染miR-142-5p mimics后能够促进多柔比星诱导的HCC细胞的凋亡,其机制可能与miR-142-5p靶向作用IGF2 BP3从而促进HCC细胞凋亡有关.     

胃癌中连接蛋白32和43的表达及细胞间隙连接通讯功能的研究

目的探讨细胞间隙连接蛋白(Cx)表达及细胞间隙连接通讯(GJIC)功能状况与胃癌发生、发展的关系。方法采用免疫组化和间接免疫荧光法分别检测胃癌组织和不同分化程度的胃癌细胞系中Cx32和Cx43的表达;应用Western blot法检测Cx43在胃癌组织、癌旁组织及不同分化胃癌细胞系中的表达;应用划痕染料示踪技术检测不同细胞系中细胞GJIC功能。结果在正常胃组织中,Cx32和Cx43的阳性表达率均为100.0%,在胃癌组织中Cx32和Cx43的阳性表达率分别为49.5%(55/111)和39.6%(44/111)。Cx32的表达与组织类型、分化程度、远处转移及临床分期有关(P<0.05),而与侵袭程度、年龄无关(P>0.05);Cx43的表达与组织类型、分化程度、远处转移、侵袭程度及临床分期有关(P<0.05),而与年龄无关。Cx32和Cx43在转化的人胃黏膜细胞系GES-1中的阳性表达率均为100.0%;在胃高分化腺癌细胞系N87中的阳性表达率分别为49.0%和55.0%;在胃低分化腺癌细胞系BGG-823中均无表达。GES-1细胞具有强GJIC功能,N87和BGC-823细胞均无GJIC功能。Cx43在胃癌组织中的表达量明显低于癌旁正常组织,在GES-1和N87细胞中的表达水平依次递减,在BGC-823细胞中几乎无表达。结论Cx32和Cx43表达下降与胃癌的发生、发展有关。     

Overexpression of LSD1 in hepatocellular carcinoma: a latent target for the diagnosis and therapy of hepatoma

The aim of this study was to investigate the expression of LSD1 in human hepatocellular carcinoma (HCC) cell lines and HCC samples. In this study, we examined LSD1 expression in 60 paired liver cancer tissues and adjacent noncancerous tissues by Western blot. In addition, we analyzed LSD1 expression in 198 HCC samples by immunohistochemistry. The relationship between LSD1 expression and clinicopathological features was investigated. The HCC cell line SMMC-7721 was transfected with LSD1 siRNA expressing plasmids. We subsequently examined in vitro cell growth using the MTT assay and anchorage-independent growth through a soft-agar colony-formation assay. In addition, the expression levels of Bcl-2 and c-Myc were also examined. Immunohistochemistry and Western blotting consistently confirmed LSD1 overexpression in HCC tissues compared with adjacent non-neoplastic tissues (P?<?0.01). Additionally, immunostaining showed more LSD1-positive cells in the higher tumor stage (T3–4) and tumor grade (G3) than in the lower tumor stage (T1–2, P?<?0.001) and tumor grade (G1–2, P?<?0.001). Knockdown of LSD1 expression in HCC cells led to decreased cell proliferation. The expression of Bcl-2 and c-Myc were down-regulated after transfection of LSD1 siRNA into HCC cell line SMMC-7721. In conclusion, because LSD1 was overexpressed in HCC and has an important role in the development of HCC, LSD1 could be a latent target in the diagnosis and therapy of HCC.     

Basic Investigations EXPRESSION OF GAP JUNCTION PROTEIN Cx43 IN CULTURED HUMAN NORMAL AND MALIGNANT LUNG CELLS

ＢａｓｉｃＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＯＦＧＡＰＪＵＮＣＴＩＯＮＰＲＯＴＥＩＮＣｘ４３ＩＮＣＵＬＴＵＲＥＤＨＵＭＡＮＮＯＲＭＡＬＡＮＤＭＡＬＩＧＮＡＮＴＬＵＮＧＣＥＬＬＳＺｈａｎｇＺｈｉｑｉａｎ；张志谦；ＬｉｎＺｈｏｎｇｘｉａｎｇ...     

Hsa-miR-4282对肝癌细胞系SMMC-7721生长的影响

目的  探讨Hsa-miR-4282在肝癌细胞系SMMC-7721中的表达及其对细胞生长的影响。方法 采用实时荧光定量PCR法检测Hsa-miR-4282在人正常肝上皮细胞系HL-7702和人肝癌细胞系MHCC97-H、SMMC-7721，以及 20例肝癌组织及其相应癌旁组织中的表达。采用瞬时转染法将Hsa-miR-4282 mimics（上调组）和Hsa-miR-4282 inhibitor（下调组）分别转染肝癌SMMC-7721细胞，上调组和下调组分别设置相应阴性对照组。转染后采用MTT法检测细胞增殖能力，平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力，流式细胞仪检测细胞凋亡能力。结果 Hsa-miR-4282在肝癌组织、肝癌细胞MHCC97-H及肝癌细胞SMMC-7721中的表达均低于癌旁组织及正常肝细胞HL-7702（P＜0.05）。MTT实验结果显示，Hsa-miR-4282上调后肝癌SMMC-7721细胞的OD值低于其阴性对照组，而下调后OD值高于其阴性对照组 （P＜0.05）。平板克隆形成实验显示，下调组的细胞克隆数高于其阴性对照组［（240±7） 个 vs （191±10） 个，P=0.005）］，而上调组细胞克隆数低于基阴性对照组［（146±10） 个 vs （193±12） 个，P=0.013）］。流式细胞仪检测结果显示，Hsa-miR-4282上调组细胞凋亡率较其阴性对照组升高［（23.89±1.89）% vs（16.6±1.14）%，P=0.009）］，下调组细胞凋亡率较期阴性对照组降低［（14.98±0.46）% vs （17.79±0.73）%，P=0.010］。结论 Hsa-miR-4282上调可抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖，促进细胞凋亡，可能与肝癌的发病机制有关。