Bevacizumab对人Tenon囊成纤维细胞迁移抑制作用的研究

目的：观察bevacizumab对人Tenon囊成纤维细胞迁移能力的影响,探讨青光眼术后滤过泡瘢痕化的对策。方法：采用从陕西省人民医院中心实验室细胞库中取出冻存的人Tenon囊成纤维细胞,采用细胞复苏法,遵循无菌原则,进行常规培养。创伤划痕试验：待细胞融合度达到80%时在单层细胞表面划出一条无细胞的刮除带,空白对照组加入不含血清的DMEM培养液,bevacizumab处理组加入 bevacizumab 浓度为1 mg/mL 不含血清的DMEM培养液,分时段(0,24,48,72h)观察并测量划痕宽度。结果：人Tenon囊成纤维传代细胞显微镜下观察呈长梭形,细胞核位于细胞的中部,核较大,胞浆丰富,生长时呈漩涡状排列走形,增殖能力强,符合成纤维细胞的一般形态。冻存和复苏后细胞的形态结构和生物学特点维持不变。细胞划痕试验显示：0h时,两组细胞划痕初始宽度相等;24 h 时两组细胞迁移距离基本一致;48 h 时bevacizumab处理组细胞迁移距离明显小于空白对照组;72 h时空白对照组划痕基本愈合, bevacizumab处理组细胞迁移距离较48 h无明显变化,且细胞死亡数目较多。结论：利用细胞复苏法可成功培养形态结构和生物学特性稳定的传代人Tenon囊成纤维细胞,为实验研究奠定细胞学基础。成纤维细胞本身具有较强的迁移能力,外源性bevacizumab作用可以明显抑制细胞的迁移,作用时间过长时,会造成细胞的过多死亡。抗新生血管药物对成纤维细胞的迁徙具有一定的抑制作用,未来很有可能成为眼科临床抗击青光眼术后滤过泡瘢痕化的重要手段。     

CCK-8检测法研究槲皮素对人Tenon囊成纤维细胞的抑制作用

目的 观察槲皮素（quercetin,QU）对体外培养的（human Tenon＇s capsule fibroblasts,HTCF）增殖的抑制作用.方法 体外培养HTCF.配制QU溶液,其浓度依次为20 μmol·L^-140 μmol·L^-160 μmol·L^-180 μmol·L^-1100 μmol·L^-1用活细胞计数试剂盒CCK-8检测不同浓度QU作用下HTCF的增殖,并在光学显微镜下观察细胞的形态变化.结果 不同药物浓度HTCF形态学检测显示：50 μmol·L^-1U作用48 h后,细胞收缩,胞核固缩,聚集在核膜边缘;100 μmol·L^-1U作用48 h后,细胞未见增殖,出现凋亡小体,细胞的增殖几乎完全被抑制.细胞生长抑制实验的结果显示：QU在各浓度组对体外培养的HTCF均有抑制作用,抑制效应呈剂量时间依赖关系.结论 QU能抑制体外培养的HTCF的增殖,且该作用呈剂量和时间依赖性.     

氯化锂对人Tenon囊成纤维细胞增生抑制作用的机制研究

目的:探讨氯化锂对人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)缝隙连接细胞间通讯(GJIC)的影响及其可能的作用机制。方法:收集2019年4月于德州市人民医院眼科行斜视手术的1例患者的Tenon囊组织,剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织块,进行原代培养并传代,取第4代HTFs进行实验。将HTFs分为对照组和氯化锂处理组,对...     

结缔组织生长因子对POAG患者Tenon囊成纤维细胞的影响

目的：研究结缔组织生长因子(CTGF)对原发性开角型青光眼(POAG)患者Tenon囊成纤维细胞(Tfb)增殖、移行和转化的影响。

方法：POAG患者的Tenon囊组织行组织块法培养出来的Tfb细胞分为2组：(1)对照组;(2)CTGF处理组：DMEM-F12培养液中分别加入终浓度为1.0、10.0、100.0ng/mL的CTGF。细胞处理24h后,分别用MTT法和细胞划痕法分别检测Tfb的增殖和移行,半定量RT-PCR法和免疫组织化学法分别检测Tfb中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA水平的变化和蛋白的表达。

结果：MTT法测得1.0、10.0、100.0ng/mL CTGF处理组的A值分别是0.436±0.009、0.643±0.009、0.679±0.006,对照组为0.423±0.156。细胞划痕法显示,细胞移行数分别为34.600±3.507、70.400±2.074、80.000±2.915个,对照组为31.000±3.536个。RT-PCR法得出不同浓度CTGF处理组α-SMA/β-actin条带吸光度比值分别为0.873±0.161、1.213±0.312、1.352±0.376,对照组是0.851±0.158。免疫组织化学法得出1.0、10.0、100.0ng/mL CTGF处理组阳性细胞的平均光密度值分别是0.110±0.026、0.141±0.017、0.175±0.027,对照组是0.108±0.020。上述所有观察指标10.0、100.0ng/mL CTGF组与对照组相比较均有差异(P<0.05),而1.0ng/mL CTGF与对照组相比较均无差异(P>0.05)。

结论：CTGF能促进POAG患者Tfb的增殖、移行和表型转化,CTGF可能在滤过泡瘢痕化中扮演了重要作用。     

兔眼Tenon囊成纤维细胞体外培养方法的研究

探索体外培养兔眼Ｔｅｎｏｎ囊成纤维细胞的简便方法。把兔结膜和结膜下组织剪碎后直接接种在培养瓶中,加入ＤＭＥＭ培养液进行培养,省略胰蛋白酶消化过程或者组织块干固贴壁过程。此方法简单而且有效。本文对此进行了详细的介绍,同时还介绍了如何分离培养时混杂生长的结膜上皮细胞,并且对体外培养的兔Ｔｅｎｏｎ囊成纤维细胞的生长速度进行了研究。     

结缔组织生长因子对人Tenon囊成纤维细胞中E-cadherin蛋白表达的促进作用

背景 青光眼滤过手术后滤过通道的瘢痕化是手术失败的主要原因,其主要病理机制是成纤维细胞的异常增生、间质-上皮转分化及细胞外基质的重塑.结缔组织生长因子(CTGF)是促进瘢痕形成的关键因子,而CTGF是否能促进人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)的间质-上皮转分化尚不清楚.目的 观察CTGF对HTFs间质-上皮转分化的影响.方法 用体积分数10％胎牛血清的DMEM高糖型培养液进行HTFs体外常规培养和传代,取3～6代细胞用于实验.将培养的HTFs分为空白对照组和CTGF处理组,空白对照组用DMEM完全培养液培养细胞,CTGF处理组在培养液中加入CTGF,使终质量浓度为50 ng/ml.细胞培养后48 h,采用细胞免疫荧光染色技术鉴定HTFs中上皮钙黏素(E-cadherin)蛋白的表达,采用Western blot法对HTFs中E-cadherin蛋白的表达量进行检测.结果 空白对照组及CTGF处理组HTFs均生长良好,呈长梭形,漩涡状排列.细胞免疫荧光染色显示,CTGF处理组HTFs细胞质呈红色荧光,细胞核呈蓝色荧光;空白对照组HTFs仅见DAPI蓝染的细胞核,无E-cadherin表达的红色荧光.Western blot法检测结果显示,空白对照组HTFs中E-cadherin蛋白无表达,而CTGF处理组HTFs中E-cadherin蛋白的相对表达量为0.63±0.08.结论 间叶组织来源的成纤维细胞本身不表达E-cadherin,在CTGF的刺激下成纤维细胞能够表达E-cadherin,CTGF促进HTFs的间质-上皮转分化.     

转化生长因子-β1对人Tenon囊成纤维细胞表型转化的作用

目的探讨转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)对人Tenon囊成纤维细胞(humansubconjunctivalTenon’scapsulefibroblast,HTCF)表型转化的作用。方法人白内障手术中取结膜下Tenon囊组织块培养成纤维细胞。用第5~9代细胞,以不同浓度TGF-β1(0μg·L-1,2μg·L-1,5μg·L-1,10μg·L-1,20μg·L-1)、不同时间(24h、48h、72h)诱导成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞。用蛋白质印迹免疫检测技术和免疫细胞化学技术鉴定细胞表型。结果体外用TGF-β1诱导HTCF,在0~10μg·L-1内,TGF-β1呈剂量依赖性增加平滑肌肌动蛋白在蛋白水平的表达,至20μg·L-1时表达迅速下降;10μg·L-1TGF-β1诱导48h后其平滑肌肌动蛋白的表达与24h、72h相比,差异有显著性(P<0.01,n=6)。结论一定浓度和剂量的TGF-β1能显著诱导HTCF表型转化为肌成纤维细胞,在人Tenon囊组织局部组织损伤修复及瘢痕形成中具有重要作用。     

氯化锂对人眼Tenon囊成纤维细胞TGF-β及CTGF的影响

目的:研究氯化锂(lithium chloride,LiCl)对体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞(human Tenon's capsule fibroblasts,HTFs)转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)及结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响并探讨其作用机制.方法:体外培养HTFs并通过vimentin免疫荧光染色技术及细胞形态特征观察鉴定细胞;将HTFs分为实验组(80mmol/L LiCl处理48h)和对照组(未用药).用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, Real time-qPCR)检测两组细胞内TGF-β及CTGF基因的表达,Western blot检测两组细胞内TGF-β及CTGF蛋白的表达.结果:体外培养的HTFs能够表达TGF-β及CTGF.与对照组比较,实验组中TGF-β、CTGF基因表达下降,差异均具有统计学意义(t=20.042、14.995,P<0.05);与对照组比较,实验组中TGF-β、CTGF蛋白表达下降,差异均具有统计学意义(t=46.058、12.452, P<0.05).结论:体外培养的HTFs在基因和蛋白水平表达TGF-β及CTGF,LiCl能够抑制该过程,其可能通过该机制抑制HTFs增殖,此研究为LiCl用于青光眼滤过术后瘢痕化调控提供了实验依据.     

芹黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞增生的影响

背景 青光眼滤过手术后人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)的增生是滤过手术失败的丰要原因,寻找抑制术后HTFs增生的药物可提高滤过手术的成功率. 目的 观察芹黄素对HTFs体外生长的抑制效应并探讨其作用机制.方法 斜视手术中获取的人眼Tenon囊组织剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织块,进行原代培养,免疫荧光法进行细胞波形蛋白检测以鉴定培养的HTFs.取第3～5代HTFs接种于96孔板中,加入0、20、40、80、160 μmol/L芹黄素后继续培养,于24、48、72 h后分别取一块96孔板,在酶联免疫检测仪上检测560 nm波长处各组细胞的吸光度(A560)值,磺基罗丹明B(SRB)法测定细胞的增生能力.分别在培养基中加入40、80、160 μmol/L芹黄素,同时在不同浓度芹黄素组培养基中均加入10 μg/L BrdU,继续培养48 h,在各组同一个视野下分别拍摄荧光显微镜和光学显微镜照片,计算BrdU的标记率,以未添加任何芹黄素(0μmol/L)组为对照组.用Hoechst 33258染色后在荧光显微镜下观察培养细胞的形态学改变,采用流式细胞技术检测细胞的凋亡情况和细胞周期的变化. 结果 培养的细胞生长状态良好,免疫荧光法检测可见细胞对波形蛋白呈阳性反应,为细胞质中均匀的绿色荧光,确定培养的细胞为HTFs.SRB法检测结果显示,HTFs的增生值(A560)随着芹黄素浓度的增加而逐渐下降,同浓度芹黄素组HTFs A560值随着作用时间的延长逐渐下降,差异均有统计学意义(F组别=480.306,P=0.000;F时间 =555.144,P=0.000).0、40、80 μmol/L芹黄素作用HTFs 48 h后BrdU的标记率分别为(87.860±0.632)％、(61.520±4.306)％、(23.480±4.472)％,各组之间的总体比较差异有统计学意义(F=299.347,P=0.000),其中40 μmol/L、80 μ mol/L芹黄素组HTFs BrdU的标记率均明显低于0 μmol/L芹黄素组,差异均有统计学意义(P＜0.05).Hoechse 33258染色发现,不同浓度芹黄素组的细胞数目减少,随着芹黄素浓度的增加,细胞核固缩和变形的细胞数目增加.流式细胞术检测发现,随着芹黄素浓度的增加,G0/G1期细胞的百分数逐渐增加,而S期和G2/M期细胞的百分数逐渐下降,差异均有统计学意义(FG0/G1 =58.621,P=0.000;Fs=32.357,P=0.001;Fc2/M =83.998,P=0.000).0、40、80、160 μmol/L芹黄素作用72 h后,细胞的凋亡率分别为(4.77±0.21)％、(13.24-±1.35)％、(18.33±1.86)％、(31.58±2.77)％,4个组的总体差异有统计学意义(F=204.791,P＜0.05). 结论 芹黄素通过诱导细胞凋亡,并将细胞阻滞于G0/G1期而抑制HTFs的增生,其作用呈剂量和时间依赖性.     

人Tenon囊成纤维细胞的体外培养及增殖能力研究

目的:离体培养人Tenon囊成纤维细胞(HTF)并观察细胞增殖能力。方法:取斜视患者手术切除Tenon囊组织进行成纤维细胞原代培养,培养的细胞通过免疫荧光染色法进行鉴定。CCK-8法描述细胞生长曲线,测定细胞活力。流式细胞术分析细胞周期,计算增殖指数。结果:通过组织块法成功培养出HTF。不同代次原代培养的HTF之间增殖能力无明显统计学差异(P>0.05)。结论:HTF在体外易于培养,经过数次传代,增殖能力稳定,是进行Tenon囊抗纤维化研究的良好靶细胞。     

小檗胺抑制兔Tenon囊和滤过道内成纤维细胞增殖的实验研究

目的:研究钙调素拮抗剂小檗胺(berbamine,BER)对兔Tenon囊成纤维细胞和兔小梁切除术后滤过道内成纤维细胞增殖的抑制作用。方法:体外培养兔Tenon囊成纤维细胞,经不同浓度BER处理不同时间后,细胞计数Kit8(CCK8)法检测BER对兔Tenon囊成纤维细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪检测其凋亡率及细胞周期的变化。HE染色检测BER对兔小梁切除术后滤过道内成纤维细胞增殖的抑制作用。结果:兔Tenon囊成纤维细胞经不同浓度BER处理不同时间后细胞增殖受到抑制,并呈时间剂量依赖性。流式细胞仪检测发现BER处理后兔Tenon囊成纤维细胞呈现G1期阻滞,细胞凋亡率明显增加,20mg/LBER处理9h,细胞凋亡率从0.64%增加到31.86%。HE染色显示BER显著抑制兔小梁切除术后滤过道内成纤维细胞的增殖。结论:小檗胺在体内外均能抑制成纤维细胞的增殖,其可能是通过诱导细胞凋亡方式抑制兔Tenon囊和滤过道内成纤维细胞的增殖。     

核心蛋白多糖抑制翼状胬肉成纤维细胞增生的实验研究

目的　观察核心蛋白多糖对体外培养人翼状胬肉成纤维细胞（ｈｕｍａｎｐｔｅｒｙｇｉｕｍｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ,ＨＰＦ）增生和凋亡的影响,寻找辅助治疗和预防翼状胬肉切除术后复发的新方法。方法　采用组织块法体外培养ＨＰＦ,将处于对数生长期的细胞用于实验。将０．１ｍｇ?Ｌ－１、１．０ｍｇ?Ｌ－１、１０．０ｍｇ?Ｌ－１的Ｄｅｃｏｒｉｎ分别加入细胞培养基中培养２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ。ＭＴＴ比色法分别测定不同浓度的Ｄｅｃｏｒｉｎ作用于ＨＰＦ不同时间后的细胞生长抑制率,流式细胞仪测定细胞周期时相变化,免疫组织化学法染色ＰＣ-ＮＡ检测细胞生长活性。结果　ＭＴＴ结果显示不同浓度组Ｄｅｃｏｒｉｎ作用ＨＰＦ２４ｈ细胞生长抑制率分别为（７．８１±１２６）％、（１９５２±２．１４）％、（４２．６９±１．６２）％,作用４８ｈ分别为（１０．１９±２．７４）％、（２２．２８±０．９７）％、（４５．７３±０．８２）％,作用７２ｈ分别为（２０．４９±１．３９）％、（２９．５０±２．４７）％、（５９．４１±１．７１）％。随着药物浓度的逐渐增高和作用时间的延长,细胞生长抑制率逐渐增加,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。流式细胞仪检测各浓度Ｄｅｃｏｒｉｎ组ＨＰＦ中Ｇ０／Ｇ１期细胞比率均较空白对照组高,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。当Ｄｅｃｏｒｉｎ浓度在０．１～１０．０ｍｇ?Ｌ－１范围内作用ＨＰＦ７２ｈ,均能够明显抑制细胞表达ＰＣＮＡ（均为Ｐ＜０．０５）。结论　Ｄｅｃｏｒｉｎ可以抑制ＨＰＦ的增生,诱导其凋亡,且呈明显的剂量和时间依赖性,有望成为防治翼状胬肉的药物之一。     

特异性转化生长因子-β_2 shRNA对人眼Tenon囊成纤维细胞的抑制作用

目的观察转化生长因子-β2（TGF-β2）特异性短发夹RNA（shRNA）对人眼Tenon囊成纤维细胞（TCFs）TGF-β2表达的影响及对人TCFs增生的抑制作用。方法根据小干扰RNA（siRNA）的设计原则,针对TGF-β2基因序列特征构建特异性shRNA载体,转染培养的人TCFs。MTT比色法检测细胞的增生情况;ELISA法检测shRNA对TGF-β2蛋白表达的抑制作用。结果 TGF-β2shRNA转染组的细胞增生及TGF-β2蛋白的表达均受到抑制。转染24、48、72h后MTT比色法检测显示,TGF-β2shRNA转染组培养的Tenon囊的成纤维细胞的增生值分别为0.5426±0.05、0.5210±0.03、0.4055±0.04,明显低于阴性对照组的0.5655±0.03、0.5378±0.03、0.5268±0.04,3个组和各时间点的总体差异均有统计学意义（F组=54.691,P=0.000;Ftime=66.888,P=0.000）。ELISA法检测显示,TGF-β2shRNA转染组TGF-β2蛋白的表达水平下降,24、48、72hTGF-β2蛋白的表达量分别为（543.58±25.32）、（400.26±30.74）、（202.72±23.24）ng/L,明显低于阴性对照组的（659.78±20.95）、（547.45±24.65）、（442.87±17.43）ng/L及空白组的（721.75±30.19）、（756.61±30.19）、（787.60±18.37）ng/L,3个组和各时间点的总体差异均有统计学意义（F组=163.082,P=0.000;F时间=31.498,P=0.000）。结论 TGF-β2特异性shRNA能显著抑制人TCFsTGF-β2的表达,载体介导的TGF-β2特异性shRNA对眼前节术后的抗瘢痕化治疗具有潜在的可能性。     

Epithelial transdifferentiation and cataract in the human lens

Anterior subcapsular cataracts cause a serious loss of vision and are normally associated with ocular trauma, inflammation or clinical skin conditions. They appear to be accompanied by epithelial cell growth and transdifferentiation where unscheduled production of a number of proteins, including alpha smooth muscle actin (alpha-sma), occurs. Clinical studies have also revealed an up-regulation of the TGFbeta signalling pathway in such cataracts. The present study, using phase contrast and immunofluorescent techniques, was undertaken to investigate the extent of alpha-sma expression in traumatic cataracts, in capsulorhexis specimens obtained during cataract surgery and in aged human lenses from donor eyes. The donor lenses were also exposed to trauma or TGFbeta in culture to observe their relative contribution to alpha-sma production. Dense anterior subcapsular cataracts were relatively rare (<1%), but all showed a pronounced up-regulation of alpha-sma, which was located both in anterior cells of normal appearance and in nucleated fibroblastic cells lying beneath the anterior epithelium. Surprisingly, more than 50% of capsulorhexis specimens from mature cataracts showed expression of alpha-sma, although to a limited extent. Alpha-sma was not expressed in any of the clear donor lenses and culture for 8 days in EMEM did not induce expression. Interestingly, unlike their young animal counterparts, human lenses failed to show the presence of alpha-sma when exposed to 10 ng ml(-1) TGFbeta. However, after culture, lenses with pre-existing cortical opacities did express alpha-sma, as did clear lenses subjected to injury or trauma. It appears that the greater the stress, the greater is the expression of alpha-sma. Cataract, and especially cortical cataract, should therefore be seen as associated with stress-induced signalling pathways in the lens that lead to the transdifferentiation of the anterior epithelial cells.     

TGF-β2特异性siRNA载体干扰人结膜囊成纤维细胞表达的研究

目的:探讨人转化生长因子TGF-β2特异性siRNA真核表达载体转染人结膜囊成纤维细胞后对其TGF-β2mRNA表达的影响。方法:体外分离并培养人结膜囊成纤维细胞,在培养后传代3次的细胞以TGF-β2特异性siRNA真核表达载体进行转染,并以未转染细胞作为对照。转染后分别于24,48和72h收集细胞,采用RT-PCR技术检测TGF-β2特异性siRNA真核表达载体对TGF-β2mRNA表达的影响。结果:分离的人结膜囊成纤维细胞于接种约4h左右开始贴壁,同时细胞变长成为梭形,表现出明显的成纤维细胞特性,约36h后达到融合状态;RT-PCR结果示:与对照组相比,转染24,48和72h后的细胞TGF-β2表达抑制率分别为17.40%,52.80%和79.20%,抑制效率呈现随时间延长有所加强的趋势。结论:TGF-β2特异性siRNA真核表达载体能抑制人结膜囊成纤维细胞TGF-β2mRNA的表达。