视网膜缺血再灌注损伤大鼠视网膜中白细胞介素-23和白细胞介素-17的表达及意义

目的　通过建立视网膜缺血再灌注损伤（ｒｅｔｉｎａｌｉｓｃｈｅｍｉａ-ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ,ＲＩＲＩ）模型,观察白细胞介素-２３（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ-２３,ＩＬ-２３）和白细胞介素-１７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ-１７,ＩＬ-１７）在Ｓｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）大鼠视网膜上的表达,探讨其在ＲＩＲＩ中的可能作用机制。方法　采用随机数字表法将７５只健康无眼疾ＳＤ大鼠随机分为正常对照组和模型组。正常对照组不作任何处理,模型组采用前房灌注生理盐水升高眼压法建立ＲＩＲＩ模型。分别在建模后１２ｈ、２４ｈ、７２ｈ、１４４ｈ处死ＳＤ大鼠,免疫组织化学染色法检测ＩＬ-２３和ＩＬ-１７蛋白在视网膜上的表达及分布情况;Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ检测分析各时间点视网膜ＩＬ-２３和ＩＬ-１７的表达水平和变化规律。结果　免疫组织化学染色法显示ＩＬ-２３和ＩＬ-１７蛋白在正常对照组视网膜中表达极少,而在模型组表达明显增多。两者主要表达于视网膜神经节细胞层和内核层细胞的细胞浆。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测发现ＩＬ-２３和ＩＬ-１７蛋白在ＲＩＲＩ视网膜中的表达明显增强,ＩＬ-２３蛋白在建模后２４ｈ表达最强,而ＩＬ-１７蛋白在建模后７２ｈ表达达到最高峰。ＥＬＩＳＡ法结果显示建模后１２ｈ、２４ｈ、７２ｈ、１４４ｈ,模型组视网膜ＩＬ-２３和ＩＬ-１７蛋白的表达水平均较正常对照组明显升高,差异均有显著统计学意义（均为Ｐ＜０．０１）。结论　ＩＬ-２３和ＩＬ-１７在ＲＩＲＩ模型ＳＤ大鼠视网膜中表达明显增强,ＩＬ-２３／ＩＬ-１７通路作为致病因素,通过加重视网膜炎症反应参与ＲＩＲＩ的病理损伤。     

玻璃体内注射色素上皮源性因子对大鼠早期糖尿病视网膜病变的保护作用

目的　观察玻璃体内注射色素上皮源性因子（ｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ-ｄｅｒｉｖｅｄｆａｃｔｏｒ,ＰＥＤＦ）对ＳＤ糖尿病大鼠视网膜ＰＥＤＦ、血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ）、炎性相关因子细胞间黏附分子-１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅ-ｃｕｌｅ-１,ＩＣＡＭ-１）和单核细胞趋化蛋白-１（ｍｏｎｏｃｙｔｅｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ-１,ＭＣＰ-１）以及细胞通透性相关因子紧密连接蛋白-１（ｚｏｎｕ-ｌａｏｃｃｌｕｄｅｎｓ-１,ＺＯ-１）和蛋白激酶Ｂ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＢ,ＰＫＢ,又称Ａｋｔ）表达的影响,探讨ＰＥＤＦ对早期糖尿病视网膜病变的保护作用。方法　选取６～８周龄ＳＤ大鼠６０只,随机分为４组:正常对照组（ＣＯＮ组）、糖尿病组（ＤＭ组）、糖尿病生理盐水注射组（ＤＭ＋ＮＳ组）和糖尿病ＰＥＤＦ注射组（ＤＭ＋ＰＥＤＦ组）。链脲佐菌素诱导建立糖尿病模型后第１周、２周、３周时,ＤＭ＋ＰＥＤＦ组大鼠玻璃体内注射ＰＥＤＦ,而ＤＭ＋ＮＳ组注射同样体积的生理盐水。第４周时处死大鼠,摘出眼球,进行视网膜组织病理学及电镜观察。并采用免疫组织化学方法检测视网膜ＰＥＤＦ、ＶＥＧＦ、ＩＣＡＭ-１、ＭＣＰ-１以及ＺＯ-１、Ａｋｔ的表达情况。结果　糖尿病大鼠均造模成功。４周糖尿病病程尚不能导致明显的视网膜新生血管形成。在透射电镜下,ＤＭ组大鼠视网膜可见神经节细胞水肿,线粒体肿胀变大,基质肿胀明显,可见大部分或全部的嵴消失,部分双侧膜融合,粗面内质网扩张,而玻璃体内ＰＥＤＦ注射可以明显地改善这一病理改变。ＤＭ组大鼠ＰＥＤＦ主要表达于视网膜神经纤维层、神经节细胞层以及内丛状层、光感受器基质以及色素上皮层、脉络膜等部位;ＶＥＧＦ主要表达于神经节细胞层,ＩＣＡＭ-１主要表达在光感受器层,ＭＣＰ-１主要表达在视网膜内层细胞,包括节细胞层和内核层,ＺＯ-１蛋白主要表达于内核层的细胞以及神经节细胞,Ａｋｔ主要表达于内丛状层以及脉络膜的细胞浆中。同ＣＯＮ组相比,ＤＭ组、ＤＭ＋ＮＳ组视网膜中ＰＥＤＦ、ＶＥＧＦ表达差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）,而ＩＣＡＭ-１、ＭＣＰ-１表达增加,ＺＯ-１、Ａｋｔ表达减少,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。ＤＭ＋ＰＥＤＦ组大鼠视网膜中ＰＥＤＦ、ＶＥＧＦ的表达较ＤＭ组和ＤＭ＋ＮＳ组差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）,但ＩＣＡＭ-１、ＭＣＰ-１表达减少,ＺＯ-１、Ａｋｔ表达增多,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。结论　ＰＥＤＦ可以明显地改善糖尿病视网膜病变早期视网膜神经节细胞的损害,通过减少炎性因子和增加细胞连接蛋白而减轻血-视网膜屏障的破坏,从而对早期糖尿病视网膜病变起一定的防治作用。     

2.0mm小切口飞秒激光角膜基质透镜取出术与飞秒激光辅助的LASIK矫正近视的疗效比较

目的　比较２．０ｍｍ微切口飞秒激光角膜基质透镜取出术（２．０ｍｍｓｍａｌｌｉｎｃｉｓｉｏｎｌｅｎｔｉｃｕｌｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ,２．０ｍｍＳＭＩＬＥ）与飞秒激光辅助的ＬＡＳＩＫ（ｌａｓｅｒｉｎｓｉｔｕｋｅｒａｔｏｍｉｌｅｕｓｉｓｗｉｔｈｆｅｍｔｏｓｅｃｏｎｄｌａｓｅｒ,ＦＳ-ＬＡＳＩＫ）矫正近视的疗效。方法　研究纳入行２．０ｍｍＳＭＩＬＥ的近视患者４８例（９６眼）,同期行ＦＳ-ＬＡＳＫ者５０例（１００眼）,记录并比较两组术前及术后１ｄ、１周、１个月、３个月及６个月的裸眼视力（ｕｎｃｏｒｒｅｃｔｅｄｖｉｓｕａｌａｃｕｉｔｙ,ＵＣＶＡ）、最佳矫正视力（ｂｅｓｔｃｏｒｒｅｃｔｅｄｖｉｓｕａｌａｃｕｉｔｙ,ＢＣＶＡ）、屈光度、生活质量量表（ｑｕａｌｉｔｙｏｆｌｉｆｅ,ＱＯＬ）得分及手术满意度量表评分。结果　在术后１周以后ＳＭＩＬＥ组视力高于ＦＳ-ＬＡＳＩＫ组,且状态较ＦＳ-ＬＡＳＩＫ组更为稳定。术后１个月、３个月、６个月ＳＭＩＬＥ组ＵＣＶＡ≥术前ＢＣＶＡ的比例高于ＦＳ-ＬＡＳＩＫ组,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。术后早期（术后１周）ＳＭＩＬＥ组存在１例过矫,而ＦＳ-ＬＡＳＩＫ组存在１例欠矫,但在术后１个月、３个月、６个月两组手术患者均在±１．００Ｄ范围内。术后平均角膜前表面形态变异指数及垂直不对称指数在各时间点均为ＦＳ-ＬＡＳＩＫ组大于ＳＭＩＬＥ组,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。两组术前及术后６个月ＱＯＬ得分组间比较,差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）,术后６个月ＱＯＬ得分均较术前有所增加,且差异均有统计学意义（ＳＭＩＬＥ:ｔ＝－１３．８５,Ｐ＝０．００;ＦＳ-ＬＡＳＩＫ:ｔ＝－１３．２１,Ｐ＝０．００）,而两组术后６个月ＱＯＬ得分比较,差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。两组均有较高的再次手术选择率及手术推荐率,并且未发生严重的并发症。结论　２．０ｍｍＳＭＩＬＥ与ＦＳ-ＬＡＳＩＫ均具有良好的有效性、稳定性以及可预测性,术后都可获得良好的视力及良好的生活质量,前者更好地保持了角膜前表面的形态。     

高眼压缺血-再灌注中视网膜NOS的表达及L-NAME对其表达的影响

目的探讨高眼压缺血－再灌注损伤时视网膜一氧化氮合酶（ＮＯＳ）的表达、Ｌ－ＮＡＭＥ对ＮＯＳ表达的影响及视网膜ＮＯＳ的作用。方法用免疫组织化学ＳＡＢＣ法检测ｎＮＯＳ，ｅＮＯＳ和ｉＮＯＳ在高眼压缺血－再灌注模型视网膜中的表达及ＮＯＳ抑制剂Ｌ－ＮＡＭＥ对其表达的影响。结果在高眼压缺血－再灌注下，视网膜神经节细胞、神经胶质细胞ｎＮＯＳ，ｅＮＯＳ，ｉＮＯＳ均呈阳性，对照组ｎＮＯＳ呈弱阳性；注射Ｌ－ＮＡＭＥ后，在高眼压缺血－再灌注中，视网膜神经节细胞、神经胶质细胞均呈ｉＮＯＳ强阳性，ｎＮＯＳ，ｅＮＯＳ呈阴性。结论在高眼压缺血－再灌注中ｎＮＯＳ，ｅＮＯＳ，ｉＮＯＳ合成的一氧化氮（ＮＯ）可能对视网膜细胞等有细胞毒性作用；Ｌ－ＮＡＭＥ通过抑制ｎＮＯＳ，ｅＮＯＳ的活性，对高眼压缺血－再灌注视网膜损伤产生保护作用。     

体外培养人角膜基质细胞ICAM-1的表达及调节

目的 探讨细胞间附分子－１（ＩＣＡＭ－１）在角膜基质细胞中表达,以及炎症介质对其表达的调节作用。方法 采用细胞培养、免疫细胞化学和流式细胞技术、观察人角膜基质细胞ＩＣＡＭ－１的表达及脂多糖（ＬＰＳ）和干扰素－γ（ＩＦＮ－γ）对此表达的影响。结果 体外２的基质中基础表达一定量的ＩＣＡＭ－１、ＬＰＳ和ＩＦＮ－γ可上调其表达水平至基础表达的１．４－４．６倍。结论角膜炎症反应中,炎症介质促进基质细胞表达Ｉ     

小儿激素敏感性肾病综合征辅助性T细胞亚群研究

目的 进一步探讨微小病变型肾病综合征（ＭＣＮＳ）的发病有否ＴＨ－１／ＴＨ－２反应失衡。方法 通过逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法，检测１１激素敏感性肾病综合征患儿外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）淋巴因子基因表达和蛋白产生。结果 与正常对照组相比，ＮＳ患儿ＩＬ－１０、ＩＬ－４基因表达和蛋白产生明显增高，ＩＬ－２、ＩＬ－６降低，干扰素（ＩＦＮ）－γ和ＩＬ－５无明显差异。结论 激     

小切口基质内透镜取出术及飞秒激光LASIK治疗高度近视的临床对比研究

目的　对比研究小切口基质内透镜取出术（ｓｍａｌｌｉｎｃｉｓｉｏｎｌｅｎｔｉｃｕｌｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ,ＳＭＩＬＥ）及飞秒激光ＬＡＳＩＫ（ｆｅｍｔｏｓｅｃｏｎｄｌａｓｅｒｉｎｓｉｔｕｋｅｒａｔｏｍｉｌｅｕｓｉｓ,ＦＳ-ＬＡＳＩＫ）治疗高度近视患者的手术疗效。方法　４０例８０眼高度近视患者（等效球镜度数为－７．００～－１０．５０Ｄ）根据手术方式不同分为２组,其中ＳＭＩＬＥ组２０例４０眼行ＳＭＩＬＥ,ＦＳ-ＬＡＳＩＫ组２０例４０眼行ＶｉｓｕＭａｘＦＳ-ＬＡＳＩＫ,观察时间点为术后１ｄ、１周、１个月、３个月、６个月。分别观察两组术后裸眼视力、等效球镜度数、最佳矫正视力、角膜地形图形态等。结果　安全性:术后３个月ＳＭＩＬＥ组和ＦＳ-ＬＡＳＩＫ组最佳矫正视力达到术前最佳矫正视力的比例分别为９７．５％（３９／４０）、９５．０％（３８／４０）（Ｐ＞０．０５）,术后最佳矫正视力／术前最佳矫正视力分别为１．１５±０．１２、１．０９±０．１４（Ｐ＞０．０５）。有效性:术后３个月ＳＭＩＬＥ组和ＦＳ-ＬＡＳＩＫ组裸眼视力达到术前最佳矫正视力的比例分别为９５．０％（３８／４０）、８０．０％（３２／４０）（Ｐ＜０．０５）,术后裸眼视力／术前最佳矫正视力分别为１．１１±０．１３、０．９８±０．１４（Ｐ＜０．０５）。可预测性（精确性）:术后３个月ＳＭＩＬＥ组和ＦＳ-ＬＡＳＩＫ组等效球镜在±０．５０Ｄ的比例分别为９５．０％（３８／４０）、７０．０％（２８／４０）（Ｐ＜０．０５）;等效球镜在±０．７５Ｄ的比例分别为９７．５％（３９／４０）、８２．５％（３３／４０）（Ｐ＜０．０５）。稳定性:与术后１周相比,术后１个月、３个月及６个月各时间点ＳＭＩＬＥ组和ＦＳ-ＬＡＳＩＫ组等效球镜度数的差异均无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。角膜地形图形态:ＳＭＩＬＥ组和ＦＳ-ＬＡＳＩＫ组角膜地形图都以平滑型最多,分别占８２．５％（３３／４０）、６０．０％（２４／４０）,两组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论　ＳＭＩＬＥ及ＦＳ-ＬＡＳＩＫ治疗高度近视均安全、稳定,而ＳＭＩＬＥ有效性、可预测性、精确性、术后角膜形态均稍好于ＦＳ-ＬＡＳＩＫ,矫正高度近视更值得临床应用。     

SN50对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用

目的　探讨核因子-κＢ（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ-κＢ,ＮＦ-κＢ）活性抑制剂ＳＮ５０对大鼠视网膜缺血再灌注损伤（ｒｅｔｉｎａｌｉｓｃｈｅｍｉｃａｌｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ,ＲＩＲＩ）的保护作用。方法　２７只成年雄性ＳＤ大鼠随机分为正常对照组、ＲＩＲＩ组、ＲＩＲＩ＋ＳＮ５０组,每组９只,建立ＲＩＲＩ动物模型,ＲＩＲＩ后６ｈ、２４ｈ、７２ｈＨＥ染色观察大鼠视网膜病理变化,免疫组织化学检测ＮＦ-κＢ的表达,实时定量ＰＣＲ检测ＴＮＦ-α的表达。结果　ＲＩＲＩ组ＲＩＲＩ６ｈ后视网膜出现组织轻度水肿,少量细胞变性,随着时间的延长,视网膜的损伤逐渐加重;ＲＩＲＩ＋ＳＮ５０组视网膜的损伤明显减轻。ＲＩＲＩ后６ｈ视网膜上可见ＮＦ-κＢ阳性表达,经过ＳＮ５０注射处理后,ＮＦ-κＢ的阳性表达在ＲＩＲＩ后２４ｈ明显减弱;经过ＳＮ５０注射处理后,与ＲＩＲＩ组比较,２４ｈ后视网膜的ＴＮＦ-α表达差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论　ＳＮ５０对ＲＩＲＩ具有保护作用。     

结缔组织生长因子在人视网膜色素上皮细胞的增生、迁移和上皮细胞-间充质细胞转变中的作用

目的　研究结缔组织生长因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＣＴＧＦ）在人视网膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ,ＲＰＥ）细胞的增生、迁移和上皮细胞-间充质细胞转变（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ,ＥＭＴ）中的作用。方法　采用ＣＣＫ-８细胞计数试剂盒测定４００ｎｇ?ｍＬ－１ＣＴＧＦ处理后的ＡＲＰＥ-１９细胞以及稳定表达ＣＴＧＦｓｉＲＮＡ或对照ｓｉＲＮＡ的ＡＲＰＥ-１９细胞的增生情况。采用细胞划痕实验评估ＣＴＧＦＲＮＡｉ对ＡＲＰＥ-１９细胞迁移的影响,同时测定稳定表达ＣＴＧＦｓｉＲＮＡ或对照ｓｉＲＮＡ的ＡＲＰＥ-１９细胞中ＣＴＧＦ、ＦＮ、ＭＭＰ-２和α-ＳＭＡ的表达水平以评估ＣＴＧＦ对于ＴＧＦβ１诱导的ＥＭＴ作用。结果　４００ｎｇ?ｍＬ－１ＣＴＧＦ处理组ＡＰＲＥ-１９细胞与未接受ＣＴＧＦ处理组细胞之间以及ＣＴＧＦｓｉＲＮＡ处理组与阴性对照ｓｉＲＮＡ组之间的细胞倍增时间均存在显著差异（均为Ｐ＜０．０５）。正常培养ＡＲＰＥ-１９细胞组修复划痕的时间（≤４８ｈ）显著少于ＣＴＧＦＲＮＡｉ靶向干扰处理组（≥７２ｈ）。以ＴＧＦ-β１诱导ＥＭＴ,ＣＴＧＦｓｉＲＮＡ处理组与阴性对照组比较,ＣＴＧＦ、α-ＳＭＡ、ＦＮ和ＭＭＰ-２表达均显著下调。此外,外源性ＣＴＧＦ可单独诱导ＡＲＰＥ-１９细胞α-ＳＭＡ表达增加。结论　ＣＴＧＦ能够促进ＡＲＰＥ-１９细胞增生,而ＣＴＧＦＲＮＡｉ不但能够显著抑制其增生还可显著抑制由划痕实验引发的ＡＲＰＥ-１９细胞的迁移。此外,ＣＴＧＦ可通过上调α-ＳＭＡ表达水平而增强ＡＲＰＥ-１９细胞对于ＴＧＦ-β１的反应,ＣＴＧＦＲＮＡｉ可使ＴＧＦ-β１诱导的ＥＭＴ减弱。     

靶向G蛋白偶联受体91的小发夹RNA慢病毒载体的构建及功能初步检测

目的　构建靶向大鼠Ｇ蛋白偶联受体９１（Ｇｐｒｏｔｅｉｎ-ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ９１,ＧＰＲ９１）基因的小发夹ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ,ｓｈＲＮＡ）慢病毒载体,探讨ＧＰＲ９１受体对高糖诱导下血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ）释放的调节作用。方法　设计合成４对针对大鼠ＧＰＲ９１（ＮＭ＿００１００１５１８）的特异性单链寡核苷酸链,两端分别引入ＡｇｅＩ和ＥｃｏＲＩ酶切位点,退火后得到小片段带黏性末端的双链ＤＮＡ,克隆入慢病毒载体ｐＧＣＳＩＬ-ＧＦＰ,行聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ,ＰＣＲ）和ＤＮＡ测序鉴定重组体。将各慢病毒ｓｈＲＮＡ干扰载体和辅助包装载体共转染２９３Ｔ细胞,收集病毒颗粒并行浓缩滴度检测。将各慢病毒载体转染ＲＧＣ-５细胞后,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法筛选有效的慢病毒ｓｈＲＮＡ干扰载体。使用４５ｍｍｏｌ?Ｌ－１的高糖刺激ＲＧＣ-５细胞２４ｈ,用ＥＬＩＳＡ法观察干扰ＧＰＲ９１后ＶＥＧＦ的表达情况。结果　ＰＣＲ及ＤＮＡ测序结果均显示慢病毒载体ｐＧＣＳＩＬ-ＧＦＰ-ｓｈＧＰＲ９１构建正确;包装病毒颗粒后,ｐＧＣＳＩＬ-ＧＦＰ-ｓｈＧＰＲ９１-１、２、３、４组病毒浓缩液的滴度依次为１．５×１０９ ＴＵ?ｍＬ－１、１．５×１０９ＴＵ?ｍＬ－１、３．０×１０９ＴＵ?ｍＬ－１、３．０×１０９ＴＵ?ｍＬ－１。将慢病毒颗粒感染ＲＧＣ-５细胞后,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测显示ＮＣ组ＧＰＲ９１蛋白（０．６０±０．０８）空白组（０．６２±０．０７）的表达无明显差异（Ｆ＝４９．０３,Ｐ＞０．０５）。而与空白组相比,４个慢病毒载体组（０．４８±０．０５、０．３４±０．０６、０．３０±０．０４和０．１１±０．０６）均能不同程度沉默ＧＰＲ９１的表达,差异有统计学意义（Ｆ＝４９．０３,Ｐ＜００１）,其中ｐＧＣＳＩＬ-ＧＦＰ-ｓｈＧＰＲ９１-３干扰效率最高。ＥＬＩＳＡ结果显示空白组、高糖组、高糖＋ＮＣ组、高糖＋ｐＧＣＳＩＬ-ＧＦＰ-ｓｈＧ-ＰＲ９１-３组ＶＥＧＦ蛋白表达分别为（２５．６３±４．５２）ｐｇ?ｍＬ－１、（７２．７４±８．２４）ｐｇ?ｍＬ－１、（７１．６８±８．３１）ｐｇ?ｍＬ－１和（４６．７７±６２１）ｐｇ?ｍＬ－１,表明ＧＰＲ９１病毒干扰载体可显著降低高糖引起的ＶＥＧＦ分泌,差异有统计学意义（Ｆ＝３０．８５２,Ｐ＜０．０１）。结论　本实验成功构建了靶向大鼠ＧＰＲ９１的ｓｈＲＮＡ慢病毒载体并进行病毒颗粒包装。所构建的慢病毒载体能够降低高糖作用下的ＶＥＧＦ表达,为进一步研究ＧＰＲ９１基因在糖尿病视网膜病变中的作用机制和动物基因治疗奠定基础。     

雷帕霉素对大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎的治疗作用

背景雷帕霉素不仅具有抗菌作用,而且是一种良好的免疫抑制剂,可用于多种自身免疫性疾病的治疗．对实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）的治疗作用是目前研究的热点之一。目的研究雷帕霉素对EAU的治疗作用,并观察雷帕霉素对EAU各免疫细胞群炎性因子表达的影响。方法25只Lewis大鼠采用随机数字表法分为EAU组（20只）和正常对照组（5只）。光感受器间维生素A类结合蛋白（IRBP）R16肽段与完全氟氏佐剂充分乳化后于Lewis大鼠后足皮下注射以建立EAU模型,EAU模型鼠再按分层随机的原则分为模型对照组和雷帕霉素组,每组10只大鼠。雷帕霉素组造模后即应用O．2mg／（kg·d）雷帕霉素（0．4m1）腹腔内连续注射7d,模型对照组及正常对照组大鼠采用等体积的生理盐水进行腹腔内注射。造模后第4天开始每日裂隙灯下观察大鼠EAU的症状,造模后第14天制备大鼠视网膜切片,以苏木精-伊红染色法进行组织病理学观察,参照Caspi的标准对EAU症状及组织病理学分级进行评分。应用免疫组织化学染色法检测各组大鼠视网膜中炎性因子干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-17（IL-17）的表达情况。结果造模后6d模型对照组大鼠EAU炎症评分逐渐升高,12d达到高峰,然后逐渐下降。雷帕霉素组大鼠EAU炎症评分变化呈现相同的趋势,但各时间点EAU炎症评分均明显低于模型对照组,差异均有统计学意义（P〈0．01）。视网膜组织病理学研究表明,模型对照组大鼠视网膜结构紊乱,大量炎性细胞浸润,组织病理学评分为3．30±0．48,而雷帕霉素组视网膜结构接近正常,组织学评分为0．90±0．45,差异有统计学意义（t=16．541,P〈0．01）。雷帕霉素组IFN-γ、IL-17在大鼠视网膜中的表达量（A值）分别为21．16±4．23和49．86±6．59,明显低于模型对照组的62．14±7．32和124．85±6．33,差异均有统计学意义（q=33．334、q=56．923,P〈0．01）。结论雷帕霉素通过抑制EAU视网膜中IFN-γ、IL-17等炎性因子的表达而对EAU发挥治疗作用,其机制可能是通过抑制Th1、Th17细胞群来实现的。     

Th1/Th2细胞因子在小鼠真菌性角膜炎中的表达

目的 通过检测Th1/Th2细胞因子在小鼠真菌性角膜炎中的表达水平,探讨机体免疫在该病发展中的作用. 方法应用角膜表层镜法建立Balb/c小鼠茄病镰刀菌性角膜炎模型,在感染后第1、3、5、7天,裂隙灯显微镜观察角膜炎特点;HE染色观察角膜病理变化;半定量RT-PCR和ELISA检测角膜中Thl细胞因子(IFN-γL-12)及Th2细胞因子(IL-4、IL-10)基因mRNA和蛋白的表达,半定量RT-PCR检测T-bet基因mRNA的表达;直线相关分析检测T-bet mRNA与IFN-比值的相关性. 结果角膜接种菌液后,早期角膜浸润混浊进行性加重,第5天后新生血管大量生长;HE染色可见第1、3天在角膜缘、角膜基质及前房中有大量的炎症细胞浸润,第5天后炎症细胞减少,角膜基质中纤维细胞逐渐增多;RT-PCR与ELISA检测结果表明,Thl细胞因子(IFN-γL-12)和Th2细胞因子(IL-4、IL-10)基因mRNA及蛋白在角膜接种菌液后均出现表达,且IFN-γL-12的表达显著强于IL-4、IL-10;IFN-γ/IL-4比值在第3天达最高值,而后逐渐降低;T-bet mRNA在第3天达最高值;T-bet mRNA的表达与IFN-γ/IL-4比值呈正相关(P＜0.05). 结论在真菌性角膜炎中,Thl/Th2型免疫应答共同参与调节机体的抗真菌免疫,但以Th1型应答为主;角膜感染真菌后第3天机体的免疫力达最强.     

龙胆泻肝汤抑制Notch信号通路活化对实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠Th1、Th2细胞分化的影响

目的　探讨龙胆泻肝汤（LXD）对Notch信号通路活化的抑制作用及其对实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）大鼠Th1、Th2细胞分化的影响。方法　将30只Lewis大鼠随机分为正常对照组、EAU模型组和LXD干预组,其中EAU模型组、LXD干预组大鼠均诱导EAU,LXD干预组大鼠造模后使用LXD每天灌胃处理,EAU模型组和正常对照组大鼠给予等量生理盐水灌胃。干预后12 d分离三组大鼠的脾脏、淋巴结和眼组织,Q-PCR检测Rbpj基因的表达,ELISA检测Rbpj、γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）蛋白的表达,流式细胞仪检测各组织中Th1、Th2细胞的表达水平,分析Th1/Th2细胞比例的变化。结果　干预后12 d,Q-PCR检测发现,与正常对照组大鼠相比, Rbpj mRNA在EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中均呈显著上调表达(均为P<0.001);与EAU模型组相比,LXD干预组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Rbpj mRNA相对表达水平均显著降低(均为P<0.01)。ELISA检测结果发现,EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Rbpj和IFN-γ蛋白表达水平均明显高于正常对照组,IL-4蛋白表达水平均明显低于正常对照组（均为P＜0.05);相比于EAU模型组,LXD干预组大鼠脾脏、淋巴结以及眼组织中Rbpj IFN-γ蛋白表达水平均显著降低,IL-4蛋白表达水平均显著升高（均为P＜0.05)。流式细胞仪检测发现,与正常对照组相比,EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Th1细胞水平均明显升高,Th2细胞水平均明显降低,Th1/Th2细胞比例失衡（均为P＜0.05）;与EAU模型组相比,LXD干预组大鼠各组织中Th1细胞水平均明显下降,Th2细胞水平均明显升高,两者细胞比例逐渐恢复均衡（均为P<0.01)。结论　LXD可通过下调EAU大鼠Notch信号通路转录因子Rbpj的表达水平抑制Notch信号通路的活化,显著促进EAU大鼠中Th1/Th2细胞比例恢复平衡并改善免疫微环境,从而达到治疗葡萄膜炎的目的。     

间充质干细胞对大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎视网膜中白细胞介素17表达的影响

背景 研究显示Th17细胞是实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)发病的重要致炎细胞群,而白细胞介素17( IL-17)作为Th17细胞的标志性因子参与了EAU的发生与发展.间充质干细胞(MSCs)作为一种免疫调节剂在多种自身免疫性疾病中对Th17具有抑制作用. 目的 研究MSCs对EAU的治疗作用以及对IL-17在大鼠视网膜表达的影响.方法 从10只SPF级Wistar大鼠股骨骨髓中分离、培养MSCs并进行传代,第3～5代细胞用于实验.54只SPF级6～8周龄Lewis大鼠按随机数字表法分为实验组48只和正常对照组6只.光感受器间维牛素A类结合蛋白(IRBP)与含有结核杆菌素HR37a的2.5 g/L弗氏完全佐剂(CFA)等体积混合后行实验组大鼠单后足垫皮下注射建立EAU动物模型,然后按照分层随机原则分为模型对照组和MSCs治疗组,每组24只大鼠.MSCs治疗组于造模的同时行1 ml MSCs尾静脉注射(5×106个／ml),连续注射3d,模型对照组以同法注射等体积PBS.注射后每日在裂隙灯显微镜下观察大鼠眼部炎症反应,并根据Caspi临床分级进行评分.分别于造模后9、12、15、20 d随机选取模型对照组和MSCs治疗组各6只大鼠制备视网膜切片,采用组织病理学方法观察大鼠视网膜形态学改变和炎症反应,参照Caspi组织学分级法进行评分.采用免疫组织化学染色法检测造模后9、12、15、20d大鼠视网膜中IL-17的表达.结果 培养的细胞呈梭形生长,漩涡状排列,经流式细胞术鉴定CD29、CD44表达阳性,CD45、CD34表达阴性.MSCs治疗组造模后9、12、15、20 d眼前节炎症反应评分均低于模型对照组(U=2.815,P=0.005;U=2.768,P=0.006;U=2.900,P=0.004;U=2.855,P=0.004),视网膜组织学检测炎症评分均低于模型对照组,差异均有统计学意义( U=2.345,P=0.019:U=2.559,P=0.011;U=2.166,P=0.030;U=2.373,P=0.018).免疫组织化学染色显示,MSCs治疗组造模后9、12、15、20d大鼠视网膜IL-17蛋白阳性表达的平均吸光度(A)值分别为26.47±5.68、77.78±9.65、47.02±6.68和26.59±5.94,明显低于模型对照组的45.34±4.63、105.95±10.74、64.11±9.76和37.02±6.51,差异均有统计学意义(t=6.305,P=0.000:t=4.799,P=0.001:t=3.540,P=0.005;t=2.900,P=0.016).结论 MSCs能减轻EAU的程度并抑制EAU的进展,降低了1L-17在眼组织中的表达.     

短期高浓度葡萄糖摄入对小鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎发展的作用

目的 探索短期高浓度葡萄糖摄入对小鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)发展的促进作用.方法 选取健康SPF级6～8周龄小鼠38只,随机分为模型对照组(EAU组)和高糖模型组(GLU组),每组19只小鼠.GLU组小鼠从造模前14 d开始给予200 g·L-1葡萄糖溶液饮水直至处死,EAU组小鼠给予正常饮水,同时保证EAU...     

Rapamycin ameliorates experimental autoimmune uveoretinitis by inhibiting Th1/Th2/Th17 cells and upregulating CD4+CD25+ Foxp3 regulatory T cells

AIM:To determine the effects of rapamycin on experimental autoimmune uveoretinitis (EAU) and investigate of role of rapamycin on T cell subsets in the disease. METHODS:EAU was induced in rats using peptides 1169 to 1191 of the interphotoreceptor binding protein (IRBP). Rapamycin (0.2 mg/kg/d) was administrated by intraperitoneal injection for a consecutive 7d after immunization. Th1/Th2/Th17 cytokines, TGF-β1, and IL-6 produced by lymphocyteswere measured by ELISA, while Th17 cells and CD4+CD25+ regulatory T cells (Tregs) from rat spleen were detected by flow cytometry. RESULTS: Intraperitoneal treatment immediately after immunization dramatically ameliorated the clinical course of EAU. Clinical responses were associated with reduced retinal inflammatory cell infiltration and tissue destruction. Rapamycin induced suppression of Th1/Th2/Th17 cytokines, including IFN-γ, IL-2, IL-17, IL-4, and IL-10 release from T lymphocytes of EAU rats, in vitro. Rapamycin also significantly increased TGF-β1 production but had no effect on IL-6 productionof T lymphocytes from EAU rats in vitro. Furthermore, rapamycin decreased the ratio of Th17 cells/CD4+T cells and upregulated Tregs in EAU, as detected by flow cytometry. CONCLUSION: Rapamycin effectively interferes with T cell mediated autoimmune uveitis by inhibiting antigen-specific T cell functions and enhancing Tregs in EAU. Rapamycin is a promising new alternative as an adjunct corticosteroid-sparing agent for treating uveitis.     

细胞因子信号传导抑制因子在实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎视网膜内的表达

目的 探讨细胞因子信号传导抑制因子(SOCS)在实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(EAU)视网膜内的表达与意义.方法 随机对照实验设计方法.90只Lewis大鼠采用分层随机抽样进行分组,分别为未治疗组40只大鼠、治疗组40只大鼠及正常对照组10只大鼠.用光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)诱导EAU动物模型,治疗组从免疫后1～28 d,给予环孢素(CsA)灌胃,每天20 mg/kg体重,而未治疗组给予等量生理盐水,正常对照组未给予免疫和治疗.分别于免疫后7、14、21、28 d按分层随机号抽取治疗组与未治疗组各10只大鼠进行相关枪测,观察大鼠眼部炎性变化,双眼取材,分别用实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹法检测大鼠视网膜内SOCS mRNA和蛋白的表达,酶联免疫吸附试验方法检测血清细胞因子白细胞介素4(IL-4)、IL-12、干扰素γ(IFN-γ)的水平.利用单因素方差分析对治疗组与未治疗组大鼠血清中细胞因子的浓度和视网膜内SOCS蛋白表达量进行对比分析,多重比较采用最小显著差异法;用Mann-Whitney两样本比较秩和检验进行治疗组与未治疗组大鼠炎性反应分值比较.结果 免疫后14 d,未治疗组可见明显的虹膜睫状体炎,房水闪辉阳性,虹膜后粘连,瞳孔不规则甚至前房积脓,炎性反应分值是1.5±0.5;而治疗组眼部炎性反应不明显,炎性反应分值是0.5±0.3.未治疗组的IL-12、IFN-γ及IL-4免疫后14 d达到最高峰(均P＜0.05),免疫后28 d IL-12、IFN-γ下降到正常水平(均P＞0.05),IL-4仍高于正常对照组(P＜0.05);治疗组中IL-12、IFN-γ的动态变化不明显(均P＞0.05),IL-4在整个病程中呈上升趋势(均P＜0.05).SOCS1、含SH2结构的细胞因子诱导蛋白(CIS)mRNA免疫后14 d表达最高,未治疗组分别是正常对照组的3.41倍和3.36倍,治疗组分别为1.44倍和1.73倍;SOCS3和SOCS5mRNA在整个病程中逐渐升高,免疫后28 d表达最高,未治疗组中分别为正常对照组的1.95倍和3.16倍,治疗组中分别为正常对照组的1.59倍和3.58倍.未治疗组SOCS1和CIS蛋白在免疫后7、14、21 d时显著高于正常对照组(均P＜0.05),治疗组二者免疫后14 d显著高于正常对照组(均P＜0.05);两组中SOCS3和SOCS5蛋白在免疫后均显著高于正常对照组(均P＜0.05).结论 EAU发生过程中视网膜SOCS1升高与Th1型反应增强有关;在发病的不同阶段中CIS与SOCS3升高和Th2细胞反应增强以对抗Th1细胞反应,与缓解葡萄膜炎的发病强度有关;SOCS5水平升高在眼局部炎性反应发生过程中可能起保护作用.     

IL-17在实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠模型眼部的表达

目的研究IL-17阳性细胞在实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）大鼠模型眼部的表达。方法用光感受器间维生素A类结合蛋白（IRBP）和氟氏完全佐剂等量混合注射于20只Lewis大鼠的右后足底部为实验组,于建模后第7、10、11、12、13、14、21、28天用裂隙灯显微镜进行眼前节检查,并根据de Smet的标准对炎症进行分级。用0.3 mL肝素（5 000 U/mL）注射至左心室以抗凝血,然后取眼球制作冰冻切片。免疫组织化学染色观察IL-17多克隆抗体在眼组织中的表达,5只正常Lewis大鼠作为对照。结果用IRBP免疫Lewis鼠后第10天,裂隙灯显微镜下可见眼前节炎症表现,免疫后第7、14、21、28天各组大鼠眼部炎症平均得分为0.4、3.2、1.6和0.2。实验组大鼠眼组织切片的苏木精-伊红染色可见炎性细胞浸润和光感受器细胞破坏。免疫组织化学染色发现,实验组虹膜、睫状体和视网膜部位可见IL-17蛋白表达,而正常组未见IL-17蛋白表达。第7、14、21、28天各组大鼠眼部组织切片染色的平均得分分别为0.6、4、2、0.4。EAU大鼠眼部炎症表现的严重程度与IL-17的表达量呈正相关（r=0.968,P〈0.01）。结论IL-17蛋白在Lewis大鼠EAU模型中呈高表达,表明IL-17阳性表达细胞在EAU的发病过程中起一定作用。     

树鼩茄病镰刀菌性角膜炎房水中Th1/Th2炎性因子的变化

目的 观察树鼩茄病镰刀菌性角膜炎房水中Th1/Th2炎性因子的变化,了解Th1/Th2炎性因子与本病炎症反应的关系.方法 茄病镰刀菌培养7d后收集真菌混悬液,调整孢子密度为10×109 CFU·mL-1.清洁级树鼩40只随机分为实验组30只、对照组10只,右眼为实验眼.实验组将真菌孢子混悬液50 μL注入角膜基质中央,对照组注入生理盐水50 μL.造模后第3天、第7天、第14天,流式细胞仪分析房水中白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-4、IL-10的水平;病理学检查观察浸润细胞类型.结果 Th1型细胞因子IL-1β和IL-6浓度均在造模后第7天达到高峰,造模后各时间点与对照组相比差异均具有统计学意义(均为P＜0.05);Th2细胞因子IL-10浓度在造模后第14天达到高峰,造模后第7天、第14天与对照组相比差异均具有统计学意义(均为P ＜0.05);IL-4浓度仅在造模后第7天与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).病理学检查结果示:炎症细胞浸润数量造模后第7天达到高峰,以中性粒细胞为主;实验组各时间点均可见菌丝平行于基质纤维生长.结论 促炎因子IL-β和IL-6及抑炎因子IL-10在树鼩茄病镰刀菌性角膜炎炎症反应机制中发挥重要作用.     

龙胆泻肝汤对葡萄膜炎大鼠关键炎症细胞因子表达的影响

目的 探讨龙胆泻肝汤对实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)大鼠关键炎症细胞因子表达的影响.方法 Lewis大鼠随机分为对照组(6只)、EAU组(18只)和LXT组(18只).光感受器间维生素A结合蛋白(interphotoreceptor retinoid-binding protein,IRBP)免疫EAU组和LXT组大鼠,对照组大鼠注射等量不含IRBP的乳化液.使用实时荧光定量PCR及ELISA方法检测血液、淋巴结和脾脏中IFN-γ、IL-17、TNF-α和IL-10细胞因子在EAU大鼠体内治疗前后的变化情况.结果 LXT组大鼠全血中IFN-γ mRNA表达在第8天虽然高于对照组(P=0.000),但已显著低于EAU组(P=0.000);LXT组IL-17 mRNA在第12天达峰值,显著低于EAU组(P=0.000),且均显著高于对照组(P=0.000);TNF-α mRNA仅在第12天显著高于对照组(P=0.000),但低于EAU组(p=0.000);IL-10 mRNA表达在第16天高于EAU组(P =0.042).LXT组大鼠淋巴结和脾脏中IFN-y、IL-17和TNF-α mRNA表达在第12天显著低于EAU组(均为P =0.000);LXT组淋巴结中IL-10 mRNA表达在第8天开始显著高于对照组(P=0.001),且在整个炎症期均维持在较高水平;LXT组脾脏IL-10 mRNA表达在第12天达峰值,且高于对照组和EAU组(均为P=0.000).LXT组大鼠血清中IFN-y、IL-17和TNF-α蛋白表达水平在第12天和第16天均低于EAU组(均为P＜0.05);EAU组和LXT组血清中IL-10蛋白表达在第12天均高于对照组(均为P ＜0.05),第16天达峰值,但LXT组IL-10蛋白含量更高.结论 龙胆泻肝汤通过抑制IFN-γ、IL-17和TNF-oα相关炎症因子的表达发挥其抗炎作用,促进IL-10的表达,加速自身免疫炎症的恢复.龙胆泻肝汤可通过多种途径在EAU的治疗中发挥免疫调节作用.