大鼠胚胎视网膜干细胞的分离培养

目的分离培养大鼠胚胎视网膜干细胞。方法从胎龄第16d的SD大鼠视网膜神经上皮分离视网膜细胞并进行悬浮培养,观察细胞增殖以及自发分化情况,采用免疫细胞化学方法检测Nestin、β-Tubulin、GFAP和Recoverin的表达。结果原代细胞可形成悬浮生长的神经球,传代后能形成新的细胞球。原代及传代细胞大部分表达神经干细胞标记物Nestin,分化后的细胞部分表达神经元标记物β-Tubulin或神经胶质细胞标记物GFAP,少数细胞表达光感受器细胞标记物Recoverin。结论分离培养的SD胚鼠视网膜神经干细胞可以在体外扩增并具有多分化潜能。     

人视网膜中神经干细胞样细胞的分离和体外培养

目的 分离培养发育基本成熟的人视网膜中神经干细胞样细胞。方法 取0～3岁猝死婴幼儿视网膜细胞，在干细胞选择性培养基中培养，观察原代和传代细胞的形态和增殖情况，并对其诱导分化。通过免疫细胞化学方法检测Nestin、MAP-2和GFAP的表达。结果 原代细胞可形成悬浮生长的致密球状细胞团，传代后能形成新的细胞球。部分细胞球表达Nestin，传代后阳性率增加。分化后细胞形态多样，每一团细胞相对一致，部分细胞表达MAP-2或GFAP。结论 0～3岁人视网膜中存在一种表现出神经干细胞特性的细胞。     

永生化胚胎视网膜干细胞的体外诱导分化

目的：研究R71882永生化视网膜干细胞系细胞的体外诱导分化。方法：对R71882细胞系细胞进行体外培养扩增，利用含有表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)及白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)等生长因子的DMEM／F12培养液对第43代细胞进行体外诱导分化，免疫荧光细胞化学鉴定诱导后细胞的抗原表达。结果：诱导后的R71882细胞系细胞增殖速度减慢，细胞表达微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP2)、胶质源性纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein，GFAP)、蛋白激酶C-α(protein kinase C-α，PKC-α)、Thy1．1及Calretinin，同时部分细胞仍表达巢蛋白(Nestin)，但未见视紫红质(Rhodopsin)表达。结论：R71882细胞是一种多能视网膜干细胞。在EGF及bFGF等多种生长因子的共同作用下，该细胞系中部分细胞仍能表达未分化细胞标记物Nestin，部分细胞开始向神经元、神经胶质细胞及双极细胞、神经节细胞和无长突细胞等视网膜终末细胞方向分化。     

人眼脉络膜黑色素瘤OCM-1细胞中肿瘤干细胞的分离纯化

目的分离及纯化人眼脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1中的肿瘤干细胞。方法将OCM-1细胞复苏，使用Dubecco标准改良Eagle培养基（DMEM/F12）培养后，改用无血清化学限定培养基（SFM），并分离纯化培养肿瘤干细胞，用流式细胞仪检测神经干细胞特异性标记物CD133的表达比率,并对第六代细胞进行神经RNA结合蛋白（musashi-1）免疫细胞化学染色，显微镜下观察阳性细胞比率。结果在标准DMEM/F12培养基中贴壁生长的OCM 1细胞用SFM培养基培养后，贴壁细胞显著减少，至第6代时细胞均为悬浮团状集落生长，呈现典型的干细胞生长方式。在不同代的细胞中，CD133均有阳性，未经过分离的OCM-1细胞、经过SFM培养并分离的第1、2代OCM 1细胞的阳性比率分别2.5％、217％、57.8％，第6代的细胞CD133阳性比率达到79.8％，musashi-1强阳性表达。结论脉络膜黑色素瘤细胞中存在肿瘤干细胞。使用干细胞培养液培养，并通过限制分化、连续传代的方法，可分离纯化出悬浮克隆集落生长的干细胞。(中华眼底病杂志，2007， 23：87-90）     

视网膜母细胞瘤肿瘤干细胞的研究进展

随着近年来肿瘤干细胞学说的兴起,越来越多的研究提示肿瘤干细胞很可能是视网膜母细胞瘤形成、复发、转移和耐药产生的根源.对于视网膜母细胞瘤肿瘤干细胞的分离、鉴定和生物学特性的研究已取得一定进展,为降低视网膜母细胞瘤化疗后复发和转移、增强化疗效果提供了新的思路.     

视网膜母细胞瘤细胞系HXO—Rb44的建立及其生物学特性的检测

对２２例眼球摘除的视网膜母细胞瘤取材进行本外培养，从中建成一个连续细胞系（ＨＸＯ－Ｒｂ４４），在体外已生存近２１个月，传至１８０代，生物学特性显示其在外悬浮生长，排列成团状或链状，群体倍增时间为４４小时，细胞形态，免疫组化与原实体瘤相似，染色体为非整倍体，为数为６０条，在双层软琼脂上可形成克隆，具有较强的异体致瘤性。     

视网膜母细胞瘤患者外周血树突状细胞的体外诱导扩增及鉴定

树突状细胞 (ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ ,ＤＣ)是目前发现的人体内功能最强的一类专职抗原提呈细胞 (ａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｃｅｌｌｓ,ＡＰＣ) [1] 。近年来 ,国外学者应用肿瘤抗原将ＤＣ致敏 ,体外诱导细胞毒性Ｔ淋巴细胞 (ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ,ＣＴＬ)的产生 ,进行Ｔ淋巴细胞的过继免疫治疗 ,取得了令人鼓舞的结果[2 5] 。肿瘤抗原负载的树突状细胞疫苗既可提高肿瘤的免疫原性 ,又能有效激发抗肿瘤的细胞免疫反应有望成为肿瘤生物治疗的又一新兴手段。有研究表明视网膜母细胞瘤(ｒｅｔｉｎｏｂ…     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的比较

目的:探讨体外分离培养高纯度、高活力大鼠骨髓间充质干细胞(MMSC)的方法,为眼科组织工程提供种子细胞。方法:取清洁级SD大鼠,改良贴壁筛选法分离培养MMSC,采用MTT法检测MMSC活性,流式细胞术检测MMSC纯度。对比改良贴壁筛选法与密度梯度离心法,剪去干骺端法与骨干中间剪断法,不同月龄大鼠MMSC活性和纯度(CD44 CD34-,CD90 CD34-)的差别。结果:改良贴壁筛选法比密度梯度离心法获取的MMSC细胞数量多,细胞纯度差异无明显统计学意义。剪去干骺端法比骨干中间剪断法获取的MMSC细胞数量少,细胞纯度差异无明显统计学意义。在相同接种密度条件下,MMSC的增殖活力随大鼠年龄的增长而下降。结论:改良贴壁筛选法是一种简便易行的培养高活力、高纯度MMSC的方法。     

应用组织块培养法对大鼠视网膜干细胞进行分离培养及鉴定

目的:应用组织块培养大鼠视网膜干细胞的有效性。方法:机械分离出生10d大鼠睫状体组织,剪成细小组织块,置入20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L表皮生长因子及1×B27添加剂的无血清DMEM/F12培养液中培养,同时取大鼠胚胎脑组织,应用常规机械-酶消化法进行神经干细胞的分离培养作为阳性对照。应用免疫荧光染色检测神经干细胞特异性抗原神经巢蛋白(nestin)的表达,应用含100mL/L的胎牛血清的培养基促进其分化以确定其神经干细胞特性。结果:原代培养48h后在组织块边缘开始出现细胞团,折光性强,呈球形或者桑葚状悬浮生长。培养4～5d后,悬浮生长的细胞团数量增多,出现较大的细胞团,原代培养7d后传代,传代后细胞能重新形成细胞团。应用免疫荧光方法可检测到细胞内nestin阳性表达,且视网膜干细胞可在以血清为诱导条件下变为贴壁生长,并分化出具有神经细胞形态的细胞。其形态、增殖及可分化特性与作为阳性对照的神经干细胞相似。结论:组织块培养法对细胞损伤小,操作简便,可成功对大鼠视网膜干细胞进行分离培养。     

人胚胎视网膜来源神经干细胞体外培养尝试

目的从人胚胎视网膜中分离、培养神经干细胞。方法人16～20周胚胎视网膜制备的单细胞悬液,分别在无血清和有血清条件下进行体外培养,采用免疫荧光法检测培养的细胞对nestin和视网膜终末细胞抗原的表达,采用RT—PCR方法和实时荧光定量PCR法检测诱导前后细胞nestin基因在mRNA水平的表达差异。结果可从人胚胎视网膜神经感觉层中培养出神经干细胞。该细胞具有自我复制能力,表达nestin,经不同条件诱导后细胞表达视网膜视杆细胞、无长突细胞、双极细胞、节细胞和米勒细胞等标志。诱导后细胞nestin基因表达量较诱导前细胞明显降低。结论人胚胎视网膜神经感觉层中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞。（中华眼科杂志,2005,41：847-852）     

人角膜上皮干细胞生物学特性的研究

目的 建立人角膜上皮干细胞体外培养体系，并探讨体外培养的人角膜干细胞的鉴定方法，从其生物学特性方面，为角膜上皮干细胞移植奠定基础。方法 采用低钙培养法对人角膜缘基底层细胞组织块进行培养。从生长特性、光镜特征、超微结构特点以及免疫细胞化学方面进行鉴别。结果 培养细胞呈多边形典型上皮细胞形态生长。电镜下可见张力丝等典型上皮细胞结构。单克隆抗体4Gl0．3染色，大部分阳性；AE5染色，绝大多数为阴性。结论 用无钙培养基与低钙培养基结合可获得较纯的、未分化的角膜干细胞。其鉴定应综合鉴别。     

Myogel supports the ex-vivo amplification of corneal epithelial cells

Limbal stem cell deficiency leads to conjunctivalisation of the cornea and subsequent loss of vision. The recent development of transplantation of ex-vivo amplified corneal epithelium, derived from limbal stem cells, has shown promise in treating this challenging condition. The purpose of this research was to compare a variety of cell sheet carriers for their suitability in creating a confluent corneal epithelium from amplified limbal stem cells. Cadaveric donor limbal cells were cultured using an explant technique, free of 3T3 feeder cells, on a variety of cell sheet carriers, including denuded amniotic membrane, Matrigel, Myogel and stromal extract. Comparisons in rate of growth and degree of differentiation were made, using immunocytochemistry (CK3, CK19 and ABCG2). The most rapid growth was observed on Myogel and denuded amniotic membrane, these two cell carriers also provided the most reliable substrata for achieving confluence. The putative limbal stem cell marker, ABCG2, stained positively on cells grown over Myogel and Matrigel but not for those propagated on denuded amniotic membrane. In the clinical setting amniotic membrane has been demonstrated to provide a suitable carrier for limbal stem cells and the resultant epithelium has been shown to be successful in treating limbal stem cell deficiency. Myogel may provide an alternative cell carrier with a further reduction in risk as it is has the potential to be derived from an autologous muscle biopsy in the clinical setting.     

A short-term chick embryo in vivo xenograft model to study retinoblastoma cancer stem cells

Purpose:Cancer stem cells (CSCs) reported in various tumors play a crucial role in tumorigenesis and metastasis of retinoblastoma (Rb). Following the efforts to reduce, replace, and refine the use of mammalian models, we aimed to establish a short-term xenograft for Rb to evaluate the CSC properties of CD133^- Rb Y79 cells, using the well-established chick embryo chorioallantoic membrane (CE-CAM) assay.Methods:Y79 cells were cultured, labeled with two different dyes (CM-Dil Y79 and enhanced green fluorescent protein (eGFP)) and sorted for CD133^- and CD133 + subsets. Two million cells from each of the labeled groups were transplanted onto the abraded CAM on embryonic day 7 (E7). On E14, the tumor nodule formation on CAM and spontaneous metastasis to the embryos were evaluated by confocal microscopy, in vivo imaging, and histology.Results:Y79 cells formed pink–white raised perivascular nodules with feeder vessels on the CAM with both the types of labeled CD133^- cells. CD133^- cells, when compared to CD133 + cells, demonstrated significantly larger tumor volume (40.45 ± 7.744 mm³ vs 3.478 ± 0.69 mm³, P = 0.0014) and higher fluorescence intensity (CM-Dil: AUF = 6.37 × 10⁷ ± 7.7 × 10⁶ vs 1.08 × 10⁷ ± 1.6 × 10⁶; P < 0.0001; eGFP: AUF = 13.94 × 10⁴ ± 2.54 × 10⁴ vs AUF = 1.39 × 10⁴ ± 0.4 × 10⁴; P = 0.0003). The metastatic potential of CD133^- cells was also observed to be higher as noted by in vivo imaging and histopathology.Conclusion:This study highlights that CE-CAM is a feasible alternative nonmammalian model for evaluating tumorigenicity and metastatic potential of Y79 CSCs. Increased tumorigenicity and metastatic potential of CD133^- subset of tumor cells substantiate their CSC properties.     

肿瘤干细胞在眼部恶性肿瘤中的作用

肿瘤干细胞是肿瘤组织中一小部分具有无限增殖和多向分化潜能的细胞群,在维持肿瘤的恶性增殖、耐药、复发和转移等方面起着决定性作用 眼部恶性肿瘤大多具有高复发、易转移和预后差等特点近年来研究发现眼部恶性肿瘤中存在肿瘤干细胞,可能与肿瘤的发生和发展密切相关.本文对肿瘤干细胞在眼部恶性肿瘤中作用的研究进展进行综述.     

组织块联合胰酶消化法培养兔角膜缘干细胞的初步探索

目的：建立一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养方法。

方法：获取兔角膜缘组织,采用组织块联合胰蛋白酶消化法进行兔角膜缘干细胞体外培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况,HE染色观察细胞形态和结构特点,并运用免疫组织化学技术进行细胞鉴定。

结果：采用组织块联合胰蛋白酶消化法可以简便、快速地培养出兔角膜缘干细胞,显微镜下动态观察细胞生长良好,有较高的增殖能力; HE染色证实细胞形态和结构正常; AE5及P63免疫组织化学鉴定呈阳性。

结论：采用组织块联合胰蛋白酶消化共同培养的方法,建立了一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养模式。