miR-199-3p通过对FGF2的调控抑制肝癌细胞MHCC97H的增殖、迁移作用及机制

目的:探讨miR-199-3p通过靶向调控抑制靶基因FGF2从而抑制肝癌MHCC97H细胞的增殖和迁移及机制。方法:qRT-PCR检测癌旁正常组织及肝癌肿瘤组织中miR-199-3p的表达水平;Transwell细胞侵袭实验检测肝癌细胞株Huh7、MHCC-97L、SMMC7721、HepG2和MHCC97H株其侵袭能力;qRT-PCR检测miR-199-3p在5株肝癌细胞系中的表达量;通过生物信息软件预测靶基因FGF2 mRNA 3' UTR的碱基存在miR-199-3p可能互补结合的位点并用荧光报告基因法及WB进行验证;通过qRT-PCR、免疫组化及Western blot检测FGF2在肝癌肿瘤组织和癌旁正常组织及各类肝癌细胞株表达的影响;Transwell、划痕、CCK8及流式细胞法检测miR-199-3p与FGF2对肝癌MHCC97H细胞增殖、侵袭、迁移及周期S期聚集能力的调控;采用MHCC97H细胞构建肝癌肿瘤异种移植小鼠模型进行肿瘤观测及免疫组化实验验证miR-199-3p对肝癌的调控作用。结果:miR-199-3p的表达水平与肝癌细胞侵袭转移能力相关;miR-199-3p能够通过抑制FGF2的mRNA翻译,抑制FGF2蛋白水平表达;FGF2与肝癌细胞侵袭转移能力相关;miR-199-3p可以负调控FGF2抑制肝癌MHCC97H细胞的生物行为;miR-199-3p 可抑制肝癌细胞中阳性信号,细胞增殖水平显著降低。结论:miR-199-3p通过抑制FGF2抑制肝癌细胞MHCC97H的增殖和迁移。     

VHL基因对U251胶质瘤细胞侵袭和迁移的影响

  目的   研究VHL基因对U251胶质瘤细胞侵袭和迁移能力的影响   方法   使用VHL表达质粒转染胶质瘤细胞,采用RT-PCR检测VHL mRNA表达,Western blot检测VHL、MMP-2、MMP-9蛋白表达,应用Transwell体外侵袭实验、划痕实验检测上调VHL基因后对U251胶质瘤细胞侵袭迁移能力的影响。使用VHL表达质粒处理后的U251细胞建立裸鼠颅内模型,利用免疫组织化学染色法对颅内模型组织切片中VHL、MMP-2、MMP-9蛋白表达进行检测。   结果   VHL表达质粒转染胶质瘤细胞后VHL mRNA、VHL蛋白表达增高,MMP-2、MMP-9蛋白表达下降;并抑制U251胶质瘤细胞侵袭迁移能力。对染色后的组织切片进行分析,VHL表达质粒处理组中VHL的表达较对照组明显升高,MMP-2、MMP-9蛋白较对照组表达减少。   结论   VHL基因能够有效抑制U251胶质瘤细胞侵袭迁移能力,VHL基因可成为治疗胶质瘤的一个有效靶点。      

黄芪甲苷对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响及其机制研究

目的:研究黄芪甲苷对肝癌细胞系MHCC97-H增殖和侵袭能力的影响。方法:MTT法检测5、10、20、40、80、100μg/ml不同终浓度和24、48、72h作用时间下黄芪甲苷对MHCC97-H细胞增殖的影响。Tran-swell侵袭实验检测100μg/ml黄芪甲苷处理48小时对MHCC97-H细胞侵袭能力的影响。选择100μg/ml黄芪甲苷处理48小时作为处理条件,实时定量PCR、Westernblot检测黄芪甲苷处理后MHCC97-H细胞MMP-2、9mRNA和蛋白质表达水平的变化,明胶酶谱法检测黄芪甲苷处理后MHCC97-H细胞培养上清中MMP-2、9分泌水平的变化。结果:各浓度和作用时间下黄芪甲苷对MHCC97-H细胞增殖均无明显抑制作用。100μg/ml黄芪甲苷处理48小时后,MHCC97-H细胞侵袭能力降低,MMP-2、9分子mRNA和蛋白质表达水平均下降,且细胞培养上清中分泌的MMP-2、9减少。结论:体外黄芪甲苷对MHCC97-H细胞增殖无明显抑制作用,但黄芪甲苷可以通过降低MHCC97-H细胞MMP-2、9分子的表达起到降低其细胞侵袭能力的作用。     

人参多糖注射液对人乳腺癌MCF-7细胞侵袭迁移能力的影响及机制研究

目的 探讨人参多糖注射液对人乳腺癌细胞株MCF-7侵袭迁移能力的影响。方法 以不同作用浓度(12.5μL/mL、25μL/mL、50μL/mL、100μL/mL)人参多糖注射液处理MCF-7细胞株,以PBS作为空白对照,分别采用Transwell小室侵袭实验、划痕实验及Western blot检测细胞侵袭能力、迁移能力及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达。结果 人参多糖注射液对MCF-7细胞体外侵袭和迁移能力具有显著的抑制作用,并呈现剂量及时间依赖性。人参多糖注射液处理后,MCF-7细胞MMP-2蛋白表达及MMP-9蛋白表达比值显著降低,并呈现剂量及时间依赖性。结论 人参多糖注射液可显著抑制人乳腺癌细胞MCF-7侵袭能力和迁移能力,下调MMP-2及MMP-9蛋白表达是其可能的作用机制。     

miR-509-3p在肝癌组织中的表达及对肝癌细胞迁移侵袭的影响

背景与目的：肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范围内致死率第三高的恶性肿瘤，microRNA（miRNA）被认为在HCC的发病机制中起重要作用。本研究旨在探讨在原发性肝癌中miR-509-3p的表达水平、细胞功能及调控的相关基因。方法：通过实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）技术检测miR-509-3p在46例肝癌患者组织样本、人肝癌细胞系及永生化人正常肝细胞系中的表达水平，采用transwell实验检测miR-509-3p对肝癌细胞转移的影响。采用蛋白质印迹法（Western blot）检测miR-509-3p与上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）之间的关系。结果：RTFQ-PCR技术检测结果显示，miR-509-3p在46例肝癌患者的肝癌组织样本以及MHCC97H、HCCLM3和SMMC-7721肝癌细胞系中异常高表达。体外功能实验证实抑制miR-509-3p表达能降低MHCC97H和HCCLM3肝癌细胞的迁移能力。Western blot检测结果显示，在MHCC97H和HCCLM3肝癌细胞中抑制miR-509-3p的表达可以降低MMP-9和MMP-2蛋白的表达。结论：本研究表明miR-509-3p通过正向调控MMP-9和MMP-2蛋白的表达而促进肝癌细胞的迁移和侵袭。     

肝癌细胞内Sox17基因表达水平与细胞迁移、侵袭力的相关性研究

目的:从基因表达水平上探讨肝肿瘤细胞内Sox17的mRNA表达量与细胞迁移、侵袭力的相关性。方法:收集4种肝肿瘤细胞HepG2、MHCC-97L、LM3、SK-Hep-1及一种非肿瘤肝上皮细胞QSG7701,Real-Time PCR法检测细胞内Sox17、CTTN基因的mRNA表达水平,细胞划痕和Transwell小室侵袭实验检测肝肿瘤细胞迁移、侵袭力。对Sox17基因的表达水平与CTTN的表达量及细胞划痕、Transwell小室侵袭的实验结果进行秩相关检验。结果:与非肿瘤细胞相比,肿瘤细胞内Sox17表达水平普遍较低,CTTN的表达水平较高;在4种肝肿瘤细胞中,Sox17基因的表达水平与CTTN的mRNA的表达水平及细胞划痕区域细胞生长速度、Transwell小室穿膜细胞数的统计结果呈负相关,秩相关系数rs=-1。结论:肝肿瘤细胞内Sox17基因的表达水平的高低与细胞的迁移、侵袭力呈负相关。     

下调ALK2对人乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响

目的:通过表达siALK2的重组腺病毒Ad-siALK2,下调人乳腺癌MDA-MB-468细胞ALK2的表达,研究其对MDA-MB-468细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法:以重组腺病毒Ad-siALK2感染MDA-MB-468细胞为实验组,空载病毒（RFP）作为感染对照,并设空白对照组,通过倒置荧光显微镜观察和RT-PCR检测病毒在MDA-MB-468细胞中的表达水平,通过MTT、平板集落形成、细胞划痕和Transwell侵袭实验检测细胞的增殖、集落形成、迁移及侵袭能力。结果:倒置荧光显微镜观察显示Ad-siALK2感染MDA-MB-468细胞的荧光效率高;RT-PCR证实Ad-siALK2感染的MDA-MB-468细胞ALK2的mRNA表达显著下降;MTT法、平板集落形成实验、细胞划痕实验及Transwell侵袭实验证实MDA-MB-468细胞Ad-siALK2组相比对照组细胞的增殖活力、集落形成率及划痕愈合率均显著降低（P<0.05）,穿膜细胞数也明显减少（P<0.05）。结论:下调ALK2表达后可以在体外抑制人乳腺癌MDA-MB-468细胞的增殖、迁移与侵袭,为后续实验研究奠定了基础。     

敲低EZH2表达抑制人舌鳞状细胞癌侵袭迁移能力的研究

  目的  探究Zeste同源增强子（enhancer of zeste homolog 2,EZH2）能否调控miR-200b/a/429的表达,进而影响人舌鳞状细胞癌的侵袭和转移。  方法  利用小干扰RNA（siRNAs）敲低舌鳞状细胞癌SCC15和UM-1细胞系中EZH2的表达。Western blot法检测EZH2和上皮-间质转化（EMT）相关蛋白的表达水平。q-PCR检测敲低EZH2后miR-200b/a/429的表达水平。Transwell实验和划痕实验检测舌鳞癌细胞的侵袭和迁移能力。最后通过免疫荧光实验观测细胞骨架的改变。免疫组织化学法和q-PCR检测人舌鳞状细胞癌标本中EZH2的表达。  结果  siRNAs能够显著地敲低EZH2表达,进而使miR-200b/a/429表达水平升高;E-cadherin表达水平升高,而N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平下降;si-EZH2组肿瘤细胞的侵袭和迁移能力明显降低。淋巴结转移阳性的人舌鳞状细胞癌标本中EZH2表达水平高于淋巴结转移阴性（P < 0.01）。  结论  EZH2通过抑制miR-200b/a/429的表达水平,进而促进了人舌鳞状细胞癌的侵袭和迁移。      

靶向LASS2基因的小干扰RNA对人肝癌细胞侵袭能力的影响

目的:研究靶向人源性长寿保障基因2(homosapiens longevity assurance homologue 2,LASS 2)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对人肝癌细胞MHCC97-L体外侵袭能力的影响.方法:通过脂质体转染将靶向LASS2的siRNA转染MHCC97-L细胞,运用实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR,RFQ-PCR)检测转染后LASS2 mRNA的表达,筛选有效的siRNA片段;运用 BCECF氢离子敏感荧光探针检测MHCC97-L细胞跨膜运输氢离子的功能;采用Western印迹法分析MHCC97-L细胞及上清液中基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)的表达情况;应用明胶酶谱法检测MHCC97-L细胞上清液中MMP-2的活性; Transwell法检测细胞体外侵袭能力.结果:筛选得到靶向LASS2的有效siRNA-1片段.MHCC97-L细胞转染LASS2 siRNA-1后,其跨膜运输氢离子的能力增强,与空白对照组比差异有统计学意义(P<0.05);MMP-2蛋白的表达及分泌无明显变化,但分泌的MMP-2活性形式增加,与空白对照组和无关序列组比明显提高,差异有统计学意义(P<0.05);且细胞的体外侵袭能力明显高于无关序列组和空白对照组(P<0.05).结论:靶向LASS2的siRNA能有效下调其表达,并能提高MHCC97-L细胞在转染LASS2 siRNA后的体外侵袭能力.     

肺组织粗提物影响人原发性肝癌细胞侵袭转移机制的初步探讨

背景与目的：转移复发是原发性肝癌治疗失败的主要原因,而肺组织是原发性肝癌远处转移的好发部位。在小鼠不同组织粗提物诱导高转移潜能的人原发性肝癌细胞的体外趋化侵袭实验中,肺组织提取物具有最强的诱导能力。本研究旨在探讨小鼠肺组织粗提物促进人肝癌高转移细胞株移动侵袭的机制。方法：采用F型肌动蛋白聚合实验和流式细胞仪,分析C57BL／6小鼠肺组织粗提物诱导高转移潜能人肝癌细胞株MHCC97-H细胞骨架的变化。肺组织粗提物与MHCC97-H细胞孵育后,利用双重荧光染色分析F型肌动蛋白和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)表达的关系。结果：经无血清培养液或脾组织粗提物孵育后,MHCC97-H细胞呈梭型或多边形。与肺组织粗提物孵育后,随时间的增加,MHCC97-H细胞片层样或丝状伪足明显增多,流式细胞仪分析显示F型肌动蛋白在30s内增加1．9倍,激光扫描共聚焦显微镜观察MHCC97-H细胞F型肌动蛋白从细胞外周浓染到重新分布于细胞的导引侧。无血清培养基孵育MHCC97-H细胞后,MMP-9和F型肌动蛋白主要位于细胞的核周池;经肺组织粗提物孵育后,MHCC97-H细胞MMP-9和F型肌动蛋白则定位于细胞伪足的前端。结论：肺组织粗提物可能通过诱导MHCC97-H细胞形成伪足和改变MMP-9运送方式,从而促进MHCC97-H细胞移动侵袭。肺组织粗提物可能与人肝癌细胞器官特异性转移有关。     

杂交瘤单抗4F11识别CD90+肝癌干细胞并抑制其侵袭【院士点评：靶向CD90+肿瘤干细胞可能治疗肝癌转移】

目的:筛选识别肝癌干细胞的单克隆抗体并研究其体外的抗肿瘤作用,为肝癌干细胞靶向治疗提供候选抗体药物。方法:无血清悬浮培养及PKH26染色分析人肝癌细胞株MHCC97H中是否存在肝癌干细胞。流式细胞术检测MH-CC97H细胞及其成球细胞中7种肿瘤干细胞标志物的表达,以及MHCC97H细胞中肝癌干细胞标志物CD90和不同杂交瘤单抗3G7、4F11、11C9、15B7、15D2识别抗原的共表达情况。无血清悬浮培养法和CCK8法检测单抗4F11对MHCC97H细胞及其成球细胞自我更新和增殖的影响,Transwell实验检测单抗4F11对MHCC97H细胞体外侵袭和迁移的影响。结果:PKH26染色实验显示,MHCC97H细胞球体由单个肝癌干细胞增殖分化形成。MHCC97H细胞球中CD90+MHCC97H细胞比例较亲本MHCC97H细胞显著增加[(18.0±7.5)%vs(2.3±1.0)%,P<0.05]。杂交瘤单抗4F11、3G7、11C9、15B7、15D2均能识别MHCC97H细胞中CD90+MHCC97H细胞,其中单抗4F11对CD90+MHCC97H细胞的识别比例为(47.2±4.4)%,其对MHCC97H成球细胞增殖的抑制率远大于对亲本MHCC97H细胞增殖的抑制率[(29.4±3.8)%vs(12.0±2.2)%,P<0.05]。单抗4F11抑制MHCC97H细胞成球,抑制率达(58.0±20.8)%。单抗4F11能显著抑制MHCC97H细胞体外侵袭和迁移,抑制率分别为(48.6±5.1)%和(47.6±3.6)%。结论:杂交瘤单抗4F11能特异性识别CD90+肝癌干细胞,抑制肝癌细胞的侵袭和迁移,可作为肝癌干细胞靶向治疗的候选抗体药物。     

热休克蛋白90α在人类肝癌细胞外的表达及其对侵袭、迁移能力的影响

目的探讨细胞外热休克蛋白90α（HSP90α参与肝癌细胞转移的可能分子机制。方法采用免疫印迹法检测HSP90α在低、高转移性肝癌MHCC97-L和MHCC97-H细胞外的表达。选取高转移潜能MHCC97-H细胞,应用不穿透细胞膜的小分子抑制剂抑制细胞外HSP90α表达,体外侵袭实验观察细胞侵袭、迁移能力的变化,明胶酶谱法分析基质金属蛋白酶2（MMP-2）活性的改变。免疫印迹和免疫共沉淀法检测细胞外辅助分子伴侣HSP70和MMP-2的表达及其与HSP90d的相互作用。利用RNA干扰技术下调细胞HSP70表达,观察细胞外HSP90仅与MMP-2相互作用及其细胞转移潜能的变化。结果HSP90d在不同转移潜能肝癌细胞内外均表达,且与肝癌细胞转移潜能呈正相关。MHCC97-H细胞经特异性HSP90抑制剂二甲氨基乙氨基-17-去甲氧基格尔德霉素-N-氧化物（DMAG—N—oxide）作用24h后,穿过上室基底膜的细胞数较未处理组和空白对照组明显下降（P〈0．01）,分别为（28．11±3．56）、（80．12±4．16）、（82．24±4．12）个。体外侵袭实验显示,穿过Matrigel人工基底膜的细胞数低于未处理组和空白对照组,分别为（36．54±4．12）、（95．12±3．48）、（101．11±3．36）个,差异有统计学意义（P=0．017）,并伴有细胞外MMP-2活性减低。HSP70和MMP-2均可在MHCC97-H细胞外表达,且能与HSP90α相互结合。小分子干扰RNA（siRNA）能有效抑制细胞HSP70表达,MHCC97-H细胞外HSP90d和MMP-2相互作用减弱,MMP-2活性下降,细胞侵袭、迁移能力受抑制。同时联合应用MMP-2抑制剂,具有协同抑制效应。结论细胞外HSP90饯可能通过与HSP70形成伴侣复合体介导MMP-2成熟活化,增强肝癌细胞侵袭、迁移运动,提示其可能是潜在的对肝癌转移实施防治的靶点。     

Androgen deprivation modulates the inflammatory response induced by irradiation

Background

During the process of metastasis, cells are subjected to various apoptotic stimuli. Aberrant expression of apoptotic regulators often contribute to cell metastasis. Heat shock protein 27(HSP27) is confirmed as an apoptosis regulator, but its antiapoptotic mechanism in metastatic hepatocellular carcinoma (HCC) cells remains unclear.

Methods

Levels of HSP27 protein and its phosphorylation in Hep3B, MHCC97L to MHCC97H cells with different metastatic potentials were determined by western blot analysis. MHCC97H cells were transfected with specific small interference RNA (siRNA) against HSP27. The in vitro migration and invasion potentials of cells were evaluated by Transwell assay. The apoptosis ratio of MHCC97H cells was analyzed by TUNEL staining and Flow Cytometry. Alteration of signal transduction pathway after HSP27 knockdown in MHCC97H cells was evaluated through a Human Q Series Signal Transduction in Cancer Gene Array analysis. Nuclear NF-κB contentration and endogenous IKK activity were demonstrated by ELISA assay. The association of IKKα, IKKβ, IκBα with HSP27 and the association between IKKβ and IKKα in MHCC97H cells were determined by co-immunoprecipitation assay followed by western blot analysis.

Results

HSP27 protein and its phosphorylation increased in parallel with enhanced metastatic potentials of HCC cells. siRNA-mediated HSP27 knockdown in MHCC97H significantly suppressed cells migration and invasion in vitro and induced cell apoptosis; the prominently altered signal transduction pathway was NF-κB pathway after HSP27 knockdown in MHCC97H cells. Furthermore, inhibition of HSP27 expression led to a significant decrease of nuclear NF-κB contentration and endogenous IKK activity. In addition, HSP27 was associated with IKKα, IKKβ, IκBα in three HCC cells above. ELISA assay and western blot analysis also showed a decrease of the association between IKKβ and IKKα, the association between phosphor-HSP27 and IKK complex, and an increase of total IκBα but reducing tendency of phosphor-IκBα when HSP27 expression was efficiently knocked down in MHCC97H cells.

Conclusion

Altogether, these findings revealed a possible effect of HSP27 on apoptosis in metastatic HCC cells, in which HSP27 may regulate NF-kB pathway activation.     

Notch信号通路对肝癌细胞迁移的调控机制研究

目的：探讨Notch信号通路对肝癌细胞迁移的调控机制。方法体外培养HepG2、MHCC97H、Huh-7肝癌细胞株和HL-7702正常肝细胞株,Transwell小室检测细胞迁移能力,蛋白免疫印迹法检测各细胞系Snail、E-cadherin蛋白表达水平,实时定量RT-PCR检测Snail、E-cadherin mRNA表达水平;采用DAPT阻断Notch信号通路,比较其对细胞迁移能力和Snail、E-cadherin蛋白及mRNA表达水平的影响。结果 HepG2、MHCC97H、Huh-7细胞株迁移能力高于HL-7702细胞株（P﹤0.05）,HepG2、MHCC97H、Huh-7肝癌细胞株迁移能力比较差异无统计学意义（P﹥0.05）。HepG2、MHCC97H、Huh-7细胞Snail蛋白及mRNA高于HL-7702细胞,E-cadherin蛋白及mRNA表达低于HL-7702细胞（P﹤0.05）,HepG2、MHCC97H、Huh-7细胞间Snail、E-cadherin蛋白及mRNA表达差异无统计学意义（P﹥0.05）。HepG2、MHCC97H、Huh-7细胞经DAPT处理后迁移能力低于未经DAPT处理的细胞株（P﹤0.05）,HL-7702细胞DAPT处理与未经DAPT处理迁移能力比较差异无统计学意义（P﹥0.05）。DAPT处理后,HepG2、MHCC97H、Huh-7细胞株Snail蛋白及mRNA表达水平降低,E-cadherin蛋白及mRNA表达增加,与未经DAPT处理的细胞株比较差异具有统计学意义（P﹤0.05）,HepG2、MHCC97H、Huh-7细胞间Snail、E-cadherin蛋白及mRNA表达差异无统计学意义（P﹥0.05）。结论 Notch信号通路可能是通过调控Snail、E-cad-herin通路调控肝癌细胞的迁移过程。     

miR-26b通过调节Notch1信号通路参与原发性肝细胞肝癌侵袭的机制研究

目的:探讨miR-26b参与原发性肝细胞肝癌（HCC）侵袭的机制。方法:在细胞培养液中培养人肝细胞系HL-7702和HCC细胞各系Hepb-3、HuH-7、MHCC97-L、MHCC97-H。实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测miR-26b的表达水平；用miR-26b mimics、miR-26b inhibitors和Notch1-siRNA分别转染HCC细胞；MTT实验检测转染后HCC细胞的活力；采用Western blot检测Notch1受体蛋白表达水平的变化；Transwell小室测定不同处理后的HCC细胞的侵袭能力。结果:人正常肝细胞系HL-7702和HCC细胞系Hepb-3、HuH-7、MHCC97-L、MHCC97-H中的miR-26b相对表达含量随其侵袭和迁移能力的升高而依次下降；抑制miR-26b的表达，Notch1受体蛋白表达明显增高，而此时HCC细胞的侵袭性显著增强；相反，上调miR-26b的表达，Notch1受体蛋白表达明显降低，而HCC细胞侵袭性显著下降；miR-26b可能通过调控Notch1信号通路调节HCC细胞侵袭性。结论:miR-26b通过负调控Notch1信号通路抑制HCC细胞侵袭能力，为HCC侵袭的机制奠定了理论基础，miR-26b可能成为HCC治疗的新靶点。     

LASS2基因抑制HCCLM3肝癌细胞的转移

目的：探讨LASS2基因对HCCLM3肝癌细胞转移的影响。方法：Northern blot分析高转移潜能肝癌细胞系HCCLM3和低转移潜能肝癌细胞系MHCC97-L中LASS2基因的mRNA水平。构建包含LASS2基因编码框的真核表达载体pCMV—HA2-LASS2，通过脂质体转染HCCLM3细胞，经G418筛选，建立稳定表达LASS2基因的HCCLM3细胞株。通过分析LASS2在HCCLM3中过表达后，HCCLM3细胞在迁移、侵袭等转移能力上的改变，Western blot、明胶酶谱及原位酶谱分析MMP-2合成、分泌、激活的变化。结果：Northern blot显示，HCCLM3细胞中LASS2基因的表达水平低于MHCC97-L细胞。当LASS2基因过表达后，HCCLM3细胞的迁移及侵袭能力受到显著抑制（P〈0．001），虽然细胞内MMP-2的合成未改变，但细胞MMP-2的分泌及MMP-2的激活均受抑制。结论：LASS2基因可下调MMP-2的分泌及激活，可使肝癌细胞HCCLM3的转移能力受到明显抑制，提示LASS2基因对肝癌细胞HCCLM3的转移具有抑制作用。     

MicroRNA-124靶向调控caveolin-1介导肝癌细胞恶性行为的研究

目的:检测miR-124、caveolin-1在肝癌组织及细胞系中的表达,探讨miR-124靶向调控caveolin-1对肝癌细胞增殖和侵袭的影响。方法:回顾性分析2012年8月至2014年7月32例于大连医科大学附属第一医院收治的行肝癌切除术患者的临床资料和标本,通过实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肝癌、癌旁组织以及肝癌细胞系中miR-124、caveolin-1的表达;通过靶基因预测及双荧光素酶报告分析miR-124与caveolin-1的靶向关系;通过qRT-PCR、Western blot检测miR-124对caveolin-1表达的调控;分别用CCK8、平板克隆及Transwell检测细胞增殖和侵袭能力;通过绘制生存曲线,分析miR-124及caveolin-1表达与临床肝癌患者预后的相关性。结果:miR-124在肝癌组织中的表达低于癌旁组织,在高转移肝癌细胞MHCC97H中的表达低于低转移肝癌细胞MHCC97L,而caveolin-1呈现相反的趋势;caveolin-1为miR-124的靶基因,调控miR-124可影响caveolin-1水平;MHCC97H中导入miR-124 mimic可抑制该细胞增殖及侵袭能力,而上调caveolin-1促进该细胞增殖及侵袭能力;敲低低转移肝癌细胞MHCC97L中miR-124水平可增强该细胞的增殖及侵袭能力,下调caveolin-1抑制该细胞的增殖及侵袭能力;肝癌组织miR-124高水平、caveolin-1低水平的患者5年生存时间显著长于相应的miR-124低水平组、caveolin-1高水平组。结论:miR-124通过靶向调控caveolin-1介导肝癌的增殖与侵袭。     

EphA2通过调控Grb2表达参与肝癌细胞侵袭的机制探讨

目的:检测促红细胞生成素肝细胞受体A2(EphA2)蛋白在肝细胞肝癌中的表达情况,探讨其参与调控肝癌细胞侵袭的可能内在机制。方法:培养人正常肝细胞HL-7702和肝癌细胞株MHCC97H、Hep3B, 通过siRNA干扰法下调肝癌细胞中EphA2、生长因子受体结合蛋白2（Grb2）的表达,分为三组:未处理组（未处理肝癌细胞）、对照组（加入对照siRNA）和siRNA干扰组（加入siRNA干扰EphA2或Grb2）。通过Western blot法检测不同处理前后细胞中EphA2、Grb2蛋白的表达情况,Transwell小室检测细胞侵袭性。多组比较、组间比较分别采用单因素方差分析和LSD-t检验。结果:体外侵袭实验结果显示MHCC97H、Hep3B、HL-7702穿透细胞的数量分别为:（401±3）/10 HPF、（111±4）/10 HPF、（31±3）/10 HPF,人正常肝细胞与人肝癌细胞相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。EphA2、Grb2蛋白在人正常肝细胞与人肝癌细胞中的相对表达量相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）。 siRNA法抑制细胞EphA2表达后,Hep3B和MHCC97H细胞系未处理组、对照组、siRNA干扰组穿透的细胞数量分别为:（111±4）/10 HPF、（108±5）/10 HPF、（53±3）/10 HPF和（405±5）/10 HPF、（399±4）/10 HPF、（155±7）/10 HPF,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0．001)。检测EphA2蛋白在Hep3B、MHCC97H细胞系未处理组、对照组、siRNA干扰组中的相对表达量,siRNA干扰组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。siRNA抑制Grb2表达后,Hep3B和MHCC97H细胞系未处理组、对照组、siRNA干扰组穿透的细胞数量分别为:（109±3）/10 HPF、（107±4）/10 HPF、（56±4）/10 HPF和（403±4）/10 HPF、（402±4）/10 HPF、（163±5）/10 HPF,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.001)。检测Grb2蛋白在Hep3B和MHCC97H细胞未处理组、对照组、siRNA干扰组组中的相对表达量,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。 siRNA抑制EphA2表达后,检测Grb2蛋白在Hep3B、MHCC97H细胞未处理组、对照组、siRNA干扰组中的相对表达量,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:EphA2参与调控肝癌细胞侵袭的内在机制可能是通过调控Grb2蛋白的表达实现的,据此,我们得出EphA2可作为治疗肝细胞肝癌的新靶点。