肝癌组织HNF4α mRNA定量检测方法的建立与初步应用

目的 建立一种定量检测肝细胞癌（HCC）组织肝细胞核因子4α（HNF4α）mRNA的方法。方法 取手术获得的HCC组织16例,提取总RNA,逆转录PCR扩增获得全长HNF4α mRNA对应cDNA产物,经TA克隆后,测序确认。根据获得序列,设计检测HNF4α mRNA 引物及MGB荧光探针。以体外转录HNF4α mRNA为标准品,建立一步法 逆转录荧光定量PCR检测方法,同时设定β-actin mRNA为内参对照,最终计算得到组织HNF4α mRNA水平。采用免疫组化染色检测HNF4α蛋白表达,比较HNF4α mRNA水平与HNF4α蛋白表达的对应结果。结果 HCC组织HNF4α mRNA定量标准曲线斜率为-3.237,相关系数r值达0.994,β-actin mRNA定量标准曲线斜率为-3.037,相关系数r值为0.996,表明建立的方法可用于检测HNF4α mRNA定量（V-4α值）,16例HCC组织HNF4α mRNA与HNF4α 蛋白表达结果呈一致性对应关系。结论 我们初步成功建立了定量检测HCC组织HNF4α mRNA水平方法,其意义还需要进一步研究。     

人HNF4α基因真核表达载体的构建与鉴定*

目的体外构建人肝细胞核因子4α（HNF4α）基因真核表达载体,并初步鉴定其在HepG2细胞的表达。方法从肝癌手术患者获得肝组织,分离得到肝组织总RNA,将其逆转录合成cDNA,经特异性引物扩增HNF4α基因片段,将其定向连接到pcDNA3.1(+）真核表达载体,经抗生素筛选后,酶切及测序鉴定其序列正确。提取质粒,转染HepG2细胞,48 h后裂解细胞,应用抗HNF4α行Western blot检测目的蛋白。结果从临床肝癌患者肝组织中成功分离得到总RNA,扩增出HNF4α基因,经筛选、酶切鉴定和测序,确认pcDNA3.1-4α真核表达载体构建成功。在转染HepG2细胞48 h后,检测显示53 kDa位置有明显融合蛋白条带。结论我们成功构建了HNF4α基因真核表达载体,体外转染HepG2细胞成功表达HNF4α蛋白,为后续研究奠定了基础。     

冬凌草甲素抗结核病理损伤的作用机制研究

目的: 通过冬凌草甲素对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染巨噬细胞NOD样受体家族蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体及内质网应激的影响,探讨冬凌草甲素抗结核病理损伤的作用机制。方法: 利用MTB标准株H37Ra建立小鼠巨噬细胞Raw264.7感染模型,设置空白对照组、MTB感染模型组、冬凌草甲素作用不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L)及作用不同时间点(6、12、24h)干预组。应用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测冬凌草甲素的可用药物浓度。应用蛋白免疫印迹法检测NLRP3、硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)表达情况;检测内质网应激相关蛋白免疫球蛋白结合蛋白(Bip)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、真核生物翻译起始因子2α(peIF2α)、磷酸化肌醇需要酶 1α(pIRE1α)、肌醇需要酶1α(IRE1α)的表达情况;检测内质网应激下游核因子κB/磷酸化应激活化蛋白激酶/p38(NF-κB/pJNK/pp38)通路的变化,并采用Image J软件做蛋白定量分析。结果: 冬凌草甲素在4.0μmol/L浓度以下细胞生存率在90%左右,对细胞毒性较小。在不同时间点(12、24h),与MTB感染模型组相比,冬凌草甲素可明显降低NLRP3蛋白表达(4.35±0.13 vs. 5.95±0.15;1.90±0.05 vs. 3.93±0.09),明显降低TXNIP蛋白表达(1.14±0.05 vs. 1.73±0.04;0.78±0.05 vs. 1.33±0.02),差异均有统计学意义(F值分别为508.308和166.278,P值均为0.000)。在不同时间点(6、12h),与MTB感染模型组相比,冬凌草甲素可明显降低Bip蛋白表达(1.85±0.07 vs. 2.27±0.07;0.97±0.03 vs. 2.28±0.17),明显降低peIF2α蛋白表达(1.75±0.42 vs. 1.75±0.03;1.31±0.04 vs. 2.45±0.17),明显降低IRE1α蛋白表达(10.48±0.40 vs. 14.19±0.45;6.15±0.15 vs. 15.76±1.27),明显降低pp65蛋白表达(0.69±0.01 vs. 1.07±0.03;0.28±0.01 vs. 0.39±0.02),差异均有统计学意义(F值分别为149.510、10.489、10.294、288.194,P值均<0.01)。结论: MTB感染小鼠巨噬细胞Raw264.7模型中,冬凌草甲素可通过调控内质网应激,抑制NLRP3炎症小体活化,发挥抗结核病理损伤的作用。     

2型猪链球菌Rgg调控因子的序列结构分析及原核表达

目的 克隆2 型猪链球菌Rgg转录调控因子编码基因并进行原核表达和纯化,并对其进行生物信息学分析和结构预测.方法 PCR扩增2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组的rgg基因,构建重组表达质粒pQE30-rgg,转化大肠杆菌M15,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE 鉴定表达产物;确定最佳诱导条件后,大量培养诱导重组表达菌,Ni²⁺亲和层析柱纯化重组蛋白,非变性PAGE电泳分析其体外聚合状态.结果 整个Rgg蛋白由15个α螺旋和2个β转角组成;构建的重组质粒在宿主菌中可高效表达,15 ℃过夜诱导获得可溶性重组蛋白的比例最高;获得了较高纯度的Rgg重组蛋白,并证实其在体外可形成同源二聚体.结论 成功地原核表达并纯化了Rgg重组蛋白,证明它存在二聚体结构,为进一步研究其调控机制奠定了基础.     

巨噬细胞对小鼠活化肝星状细胞凋亡的影响及机制

目的探讨不同极化方向巨噬细胞对小鼠活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)凋亡的影响及机制。方法体内构建CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型和橄榄油对照组小鼠模型,采用流式细胞术检测不同极化方向巨噬细胞在两组小鼠肝脏中的比例。体外诱导骨髓来源的巨噬细胞极化(M0、M1、M2巨噬细胞),分别收集上清与活化的LX-2细胞共培养。采用CCK-8法、Caspase-3/7活性检测、流式细胞术和Western Blot检测LX-2细胞的凋亡。结果 CCl_4组小鼠肝脏巨噬细胞比例显著高于对照组(t=10.86,P 0.0001),其中M1、M2巨噬细胞的比例均显著高于对照组(t值分别为4.62、5.28,P值分别为0.0036、0.0007)。与M0和M2巨噬细胞共培养组相比,M1巨噬细胞上清可显著抑制LX-2细胞的增殖、诱导LX-2细胞的凋亡、增加Caspase-3/7酶活性并上调凋亡蛋白Bax的表达(P均0.05)。此外,M1巨噬细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)的表达水平显著高于M0和M2巨噬细胞(t值分别为17.15、17.20,P均0.0001)。TRAIL重组蛋白可显著抑制活化的LX-2细胞增殖、促进其凋亡、增强Caspase-3/7酶活性并诱导Bax表达上调。结论 M1巨噬细胞通过表达TRAIL促进小鼠活化的HSC凋亡。     

巴西日圆线虫虫体蛋白体外诱导THP-1来源巨噬细胞极化的研究

目的　分析巴西日圆线虫虫体蛋白体外诱导人单核细胞白血病THP?1细胞来源巨噬细胞的极化方向,探索机体对巴西日圆线虫感染的免疫应答机制。方法　建立并维持巴西日圆线虫培养的实验室循环,无菌条件下收集L3和L5虫体,分别制备虫体蛋白;建立THP?1细胞体外培养体系,经500 ng/mL佛波酯（PMA）刺激培养后呈贴壁状态的M0型细胞分别采用500 ng/mL脂多糖（LPS）+ 100 ng/mL γ?干扰素（IFN?γ）、白细胞介素4（IL?4）+ IL?13（浓度均为100 ng/mL）、L3及L5虫体蛋白（浓度均为5 mg/mL）进行刺激,同时设不加任何刺激的阴性对照组。通过显微镜镜检观察刺激后细胞形态、实时荧光定量PCR（qPCR）检测M1/M2型巨噬细胞特异性基因mRNA表达水平、流式细胞术检测巨噬细胞表面标志物及酶联免疫吸附试验（ELISA）检测M1/M2型巨噬细胞分泌的细胞因子含量,观察巴西日圆线虫虫体蛋白体外诱导THP?1来源巨噬细胞的极化方向。结果　THP?1细胞经PMA刺激培养呈贴壁的M0型细胞后,经LPS + IFN?γ刺激培养后呈特征性M1型极化;经IL?4 + IL?13刺激培养后呈特征性M2型极化;经L3和L5蛋白刺激培养后均呈特征性M2型极化。阴性对照组、LPS + IFN?γ刺激组、IL?4 + IL?13刺激组、L3蛋白刺激组、L5蛋白刺激组间M1型巨噬细胞比例差异有统计学意义（[χ2] = 3 721.00,P < 0.001）,其中LPS + IFN?γ刺激组M1型巨噬细胞比例最高;各组间M2型巨噬细胞比例差异有统计学意义（[χ2] = 105.43,P < 0.001）。各组间C?C基序趋化因子配体2（CCL2）、肿瘤坏死因子α（TNF?α）、IL?12b、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、IL?10、甘露糖受体C型1（Mrc1）基因mRNA表达水平差异均有统计学意义（F = 191.95、129.95、82.89、11.30、9.51、12.35,P均< 0.001）,各组间CD86、CD206阳性率差异均有统计学意义（[χ2] = 24 004.33、832.50,P均< 0.001）。LPS + IFN?γ刺激组IL?1β、TNF?α表达水平均显著高于IL?4 + IL?13刺激组、L3蛋白刺激组及L5蛋白刺激组（P均< 0.001）;IL?4 + IL?13刺激组、L3蛋白刺激组和L5蛋白刺激组TGF?β1、IL?10表达水平均显著高于阴性对照组和LPS + IFN?γ刺激组（P均< 0.05）。结论　巴西日圆线虫L3和L5虫体蛋白体外均可诱导THP?1来源巨噬细胞向M2型极化。     

小檗碱对内毒素刺激致Caco-2细胞间高通透性的保护作用*

目的 探讨小檗碱（BBR）对脂多糖（LPS）刺激致Caco-2细胞间高通透性的保护作用。方法 体外培养肠上皮细胞Caco-2,分为四组：①对照组（培养基）;②LPS组（培养基+LPS 2 μg/ml）;③BBR组（培养基+BBR 10 μM）;④BBR/LPS组（培养基+LPS 2 μg/ml+BBR 10μM）。在倒置显微镜下直接观察细胞生长形态,采用荧光黄透过率检测细胞间通透性,采用Western-blot法检测细胞间紧密连接主要结构蛋白occludin、细胞膜Toll样受体-4（TLR4）表达,采用免疫荧光法检测细胞TLR4下游分子MyD88表达。结果 在倒置显微镜下可见对照组和BBR组细胞连接完整,LPS组细胞间出现锯齿样断裂,但在BBR/LPS组细胞间连接毛糙,但无明显片状中断;对照组和BBR组荧光黄透过浓度分别为（683.3±98.9）μg/ml和（849.0±89.7）μg/ml)以及细胞occludin、TLR4和MyD88蛋白表达差异均无统计学意义（P>0.05）;与对照组比,LPS组透过荧光黄浓度（1886±176.0 μg/ml）显著增加,TLR4蛋白表达增加,occludin表达减少,胞浆MyD88荧光信号增强;与LPS组比,BBR/LPS组透过荧光黄浓度（1071.0±65.9 μg/ml）显著下降,TLR4蛋白表达减弱,occludin表达增加,胞浆MyD88荧光信号减弱。结论 BBR通过减弱TLR4/MyD88活性,增加occludin表达,进而减轻LPS刺激致Caco-2细胞间高通透性。     

原发性胆汁性肝硬化患者肝组织转化生长因子β-1表达水平变化

目的 探讨原发性胆汁性肝硬化（PBC）患者肝组织转化生长因子-β1（TGF-β1）表达的变化。 方法 52例PBC患者接受超声引导下肝穿刺活检,选择病理科留取的正常肝组织20份作为对照,另选择20例健康人采集静脉血。采用免疫组化法检测肝组织TGFβ-1表达,采用ELISA法检测血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素6（IL-6）水平。 结果 正常肝组织不表达或仅有少量TGF-β1表达,而PBC患者肝实质细胞胞浆内呈TGF-β1高表达;PBC患者血清TNF-α和IL-6水平分别为（28.71±13.54） pg/ml和（21.3±9.4） pg/ml,显著高于健康人【分别为（21.3±15.4） pg/ml和（2.1±1.6） pg/ml,P<0.01】;7例PBC肝组织肝纤维化S0期患者肝组织TGF-β1表达及血清TNF-α和IL-6水平分别为（0.5±0.2）10-2、（7.1±4.1） pg/ml和（5.1±1.0） pg/ml,显著低于12例S1期【（4.2±1.3） 10-2、（18.6±6.2） pg/ml、（11.5±3.6） pg/ml,P<0.01】、18例S2期【（6.9±1.2） 10-2、（27.3±9.9） pg/ml、（19.4±4.1） pg/ml,P<0.01】、9例S3期【（13.3±15.1） 10-2、（39.7±15.18） pg/ml、（27.3±8.1） pg/ml,P<0.01】和6例S4期【（21.2±17.1） 10-2、（53.4±17.3） pg/ml、（47.8±11.0） pg/ml,P<0.01】;15例Child-Pugh A级患者肝组织TGF-β1表达及血清TNF-α和IL-6水平分别为（1.9±1.6） 10-2、（12.2±3.1） pg/ml和（7.3±2.5） pg/ml,显著低于25例Child-Pugh B级【（15.9±13.6） 10-2、（32.9±8.6） pg/ml、（21.8±6.3） pg/ml,P<0.01】或12例C级患者【（22.6±18.5） 10-2、（49.1±19.3） pg/ml、（45.5±12.7） pg/ml,P<0.01】。 结论 PBC患者肝组织TGFβ-1表达及血清TNF-α和IL-6水平显著升高,可能与肝组织纤维化增生和/或肝功能受损有关。     

NLRP3炎症小体在甲型流感病毒和MRSA致小鼠肺炎早期的作用差异

目的 探讨NLRP3炎症小体在甲型流感病毒H1N1(甲流病毒H1N1)及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)所致肺炎早期的作用。方法 分别以甲流病毒H1N1/FM1株与MRSA滴鼻感染C57BL/6小鼠各5只,引起甲流病毒肺炎与MRSA肺炎,感染24 h后,观察肺组织病理,荧光定量PCR检测各组小鼠肺组织NLRP3蛋白、IL-1β的mRNA表达强度,蛋白免疫印迹法检测小鼠肺组织NLRP3蛋白相对表达量,ELISA检测小鼠血清IL-1β的浓度。结果 NLRP3蛋白的mRNA表达水平及蛋白表达水平各组间比较差异有统计意义(F_mRNA=38.782和F_蛋白=1 325.64,P均为0.000),IL-1β的mRNA表达水平及血清浓度各组间比较差异有统计学意义(F_mRNA=1 253.97和F_血清=41.974,P均为0.000)。H1N1组 NLRP3蛋白的mRNA表达水平及蛋白表达水平均高于空白对照组(P均<0.05),IL-1β的mRNA表达水平及血清浓度均高于空白对照组(P均<0.01)。MRSA组NLRP3蛋白的mRNA表达水平高于空白对照组(P<0.05),蛋白表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),MRSA组IL-1β的mRNA表达及血清浓度均高于空白对照组(P均<0.01)。H1N1组 NLRP3蛋白的mRNA表达水平及蛋白表达水平均高于MRSA组(P均<0.05),但MRSA组IL-1β的mRNA表达水平及血清浓度均明显高于H1N1组(P均<0.01),与肺组织病理变化相一致。结论 在甲流病毒性肺炎及MRSA肺炎早期,NLRP3炎症小体介导甲流病毒引起的炎症反应,但并没有在MRSA引起的剧烈炎症反应中起重要作用。     

应用RNAi技术探讨CAP10基因在新型隐球菌感染小鼠中对Th1-Th2型免疫的影响

目的 设计siRNA表达质粒干扰CAP10基因的合成,将siRNA干扰前与干扰后的新型隐球菌菌液经呼吸道感染小鼠分别建立动物模型,行组织病理学检查与细胞因子检测,探讨CAP10基因对Th1/Th2 免疫应答的影响。方法 建立小鼠吸入感染隐球菌模型,在感染后第7 d(急性期),PAS染色观察小鼠肺组织病理变化,并采用酶联免疫吸附试验定量检测小鼠血液中的Th1(IFN-γ、TNF-α)、Th2细胞因子(IL-10)水平。结果 急性期小鼠血液内IFN-γ、TNF-α及IL-10浓度测定分别为:对照组(uninfected组)(19.24±1.31)pg/mL,(36.94±2.04)pg/mL及(18.32±3.00)pg/mL,新型隐球菌未干扰组(WT组)(14.34±1.26)pg/mL,(25.37±1.37)pg/mL及(72.96±8.83)pg/mL,新型隐球菌干扰组(siRNA-CAP10组)(14.63±0.95)pg/mL,(26.22±1.55)pg/mL及(38.73±4.61)pg/mL。与对照组相比,WT组和siRNA-CAP10组Th1因子IFN-γ及TNF-α水平明显降低(P<0.01),Th2细胞因子IL-10水平明显增高。WT组与siRNA-CAP10组相比,IFN-γ及TNF-α水平未见明显增高而IL-10水平明显增高(P<0.01)。IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率分别为:对照组1.08±0.21,2.07±0.34,WT组0.20±0.03,0.35±0.05,siRNA-CAP10组0.38±0.04,0.69±0.09。WT组和siRNA-CAP10组IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率较对照组明显减少(P<0.01);WT组IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率亦明显低于siRNA-CAP10组(P<0.01)。结论 在新型隐球菌感染小鼠中,CAP10基因的表达与抗真菌的免疫反应有关,其下调有利于控制新型隐球菌播散,有利于Th1/Th2比率趋于平衡,在调节炎症反应方面有重要作用,有望成为新的分子治疗靶点。     

Macrophage secretory products induce an inflammatory phenotype in hepatocytes

AIM: To investigate the influence of macrophages on hepatocyte phenotype and function.METHODS: Macrophages were differentiated from THP-1 monocytes via phorbol myristate acetate stimulation and the effects of monocyte or macrophage-conditioned medium on HepG2 mRNA and protein expression determined. The in vivo relevance of these findings was confirmed using liver biopsies from 147 patients with hepatitis C virus (HCV) infection.RESULTS: Conditioned media from macrophages, but not monocytes, induced a transient morphological change in hepatocytes associated with upregulation of vimentin (7.8 ± 2.5-fold, P = 0.045) and transforming growth factor (TGF)-β1 (2.6 ± 0.2-fold, P < 0.001) and downregulation of epithelial cadherin (1.7 ± 0.02-fold, P = 0.017) mRNA expression. Microarray analysis revealed significant upregulation of lipocalin-2 (17-fold, P < 0.001) and pathways associated with inflammation, and substantial downregulation of pathways related to hepatocyte function. In patients with chronic HCV, real-time polymerase chain reaction and immunohistochemistry confirmed an increase in lipocalin-2 mRNA (F0 1.0 ± 0.3, F1 2.2 ± 0.2, F2 3.0 ± 9.3, F3/4 4.0 ± 0.8, P = 0.003) and protein expression (F1 1.0 ± 0.5, F2 1.3 ± 0.4, F3/4 3.6 ± 0.4, P = 0.014) with increasing liver injury. High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis identified elevated levels of matrix metalloproteinase (MMP)-9 in macrophage-conditioned medium, and a chemical inhibitor of MMP-9 attenuated the change in morphology and mRNA expression of TGF-β1 (2.9 ± 0.2 vs 1.04 ± 0.1, P < 0.001) in macrophage-conditioned media treated HepG2 cells. In patients with chronic HCV infection, hepatic mRNA expression of CD163 (F0 1.0 ± 0.2, F1/2 2.8 ± 0.3, F3/4 5.3 ± 1.0, P = 0.001) and MMP-9 (F0 1.0 ± 0.4, F1/2 2.8 ± 0.3, F3/4 4.1 ± 0.8, P = 0.011) was significantly associated with increasing stage of fibrosis.CONCLUSION: Secreted macrophage products alter the phenotype and function of hepatocytes, with increased expression of inflammatory mediators, suggesting that hepatocytes actively participate in liver injury.     

Lipopolysaccharide induces and activates the Nalp3 inflammasome in the liver

AIM:To examine the activation of the Nalp3 inflammasome and its downstream targets following lipopolysaccharide(LPS) -induced stimulation in the liver. METHODS:Six-to-eight-week-old C57BL/6 chow fed mice were injected intraperitoneally with 0.5μg/g bodyweight LPS and sacrificed 2,4,6,18 or 24 h later. LPS-induced liver damage was confirmed by a biochemical assay to detect alanine aminotransferase(ALT) levels.To determine if LPS stimulation in the liver led to activation of the inflammasome,real-time quantit...     

Guggulsterone induces apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells through intrinsic mitochondrial pathway

AIM: To investigate the effects of guggulsterone on the proliferation and apoptosis of human hepatoma Hep G2 cells in vitro and relevant mechanisms.METHODS: Human hepatocellular carcinoma Hep G2 cells and normal human liver L-02 cells were treated with different concentrations of guggulsterone(5-100 μmol/L) for 24-72 h. Cell proliferation was tested by MTT assay. Cell cycle and apoptosis were investigated using flow cytometry(FACS). Bcl-2 and Bax m RNA and protein expression was detected by real-time PCR and Western blot, respectively. TGF-β1, TNF-α, and VEGF contents were determined by ELISA.RESULTS: Guggulsterone significantly inhibited Hep G2 cell proliferation in a dose- and time-dependent manner. FACS showed that guggulsterone arrested Hep G2 cell cycle at G0/G1 phase. Guggulsterone induced apoptosis was also observed in Hep G2 cells, with 24.91% ± 2.41% and 53.03% ± 2.28% of apoptotic cells in response to the treatment with 50 μmol/L and 75 μmol/L guggulsterone, respectively. Bax m RNA and protein expression was significantly increased and Bcl-2 m RNA and protein expression was decreased. ELISA analysis showed that the concentrations of TGF-β1 and VEGF were significantly decreased and TNF-α concentration was increased.CONCLUSION: Guggulsterone exerts its anticancer effects by inhibiting cell proliferation and inducing apoptosis in Hep G2 cells. Guggulsterone induces apoptosis by activation of the intrinsic mitochondrial pathway.