尿酸抑制人骨髓间充质干细胞的成脂分化

背景：研究表明一些药物可影响骨髓间充质干细胞的成骨、成脂诱导分化。目的：观察尿酸对人骨髓间充质干细胞成脂分化的影响。方法：全骨髓培养法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,在成脂诱导条件下,分别加入0（对照组）,0.1,0.2,0.4,0.8mmol/L浓度尿酸,诱导14,21d时行油红O染色,倒置显微镜下计数成脂细胞数量。结果与结论：成脂诱导14d后,含不同浓度尿酸的诱导组成脂细胞数量较对照组明显减少（P〈0.05）,且随着尿酸浓度的增加,抑制成脂细胞生成的效果更为明显（P〈0.05）;成脂诱导21d后,尿酸对骨髓间充质干细胞成脂诱导分化的抑制作用较诱导14d时更加明显（P〈0.05）,同样随着尿酸浓度的增加,抑制作用更加明显（P〈0.05）。说明在体外尿酸能够抑制人骨髓间充质干细胞的成脂分化,并且存在一定的浓度依赖性和时间依赖性。     

尿酸抑制人骨髓间充质干细胞的成脂分化

背景:研究表明一些药物可影响骨髓间充质干细胞的成骨、成脂诱导分化。目的:观察尿酸对人骨髓间充质干细胞成脂分化的影响。方法:全骨髓培养法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,在成脂诱导条件下,分别加入0(对照组),0.1,0.2,0.4,0.8mmol/L浓度尿酸,诱导14,21d时行油红O染色,倒置显微镜下计数成脂细胞数量。结果与结论:成脂诱导14d后,含不同浓度尿酸的诱导组成脂细胞数量较对照组明显减少(P<0.05),且随着尿酸浓度的增加,抑制成脂细胞生成的效果更为明显(P<0.05);成脂诱导21d后,尿酸对骨髓间充质干细胞成脂诱导分化的抑制作用较诱导14d时更加明显(P<0.05),同样随着尿酸浓度的增加,抑制作用更加明显(P<0.05)。说明在体外尿酸能够抑制人骨髓间充质干细胞的成脂分化,并且存在一定的浓度依赖性和时间依赖性。     

人骨髓间充质干细胞支持体外造血

体内的稳态造血依赖于复杂而完整的骨髓造血微环境系统,其中的细胞成分是该系统的关键。存在于骨髓中的间充质干细胞（ＭＳＣｓ）是成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多种骨髓基质细胞的前体细胞,在造血调控中可能具有一定的作用。本研究首先建立了成人骨髓ＭＳＣｓ的分离及体外培养的方法,并应用长期骨髓细胞培养体系,观察了ＭＳＣｓ滋养层体外维持长期培养启动细胞（ＬＴＣ－ＩＣ）的能力及其促进造血细胞分化的功能     

人骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞

骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)是一群存在于骨髓腔内的能向骨、软骨、脂肪、肌肉和基质细胞等分化的细胞。最近的骨髓移植动物模型研究显示 ,在体内骨髓细胞具有形成神经元的能力[1 ,2 ] 。与造血细胞相同 ,骨髓中的间充质干细胞也具有可移植性[3] 。因此 ,骨髓移植后形成神经元的细胞可能来源于间充质干细胞。为验证此推测 ,我们进行了如下实验。材料与方法肝素抗凝骨髓取材于异基因骨髓移植过程中正常献髓者。间充质干细胞分离、纯化和体外培养按我们以前报道的方法进行[4] 。形成致密贴壁层的间充质干细胞用 0 .0 5 %…     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的特征及功能

目的：观察人骨髓间充质干细胞体外培养定向分化为肝细胞样细胞的过程及其特征。方法：实验于2003—12／2004—05在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心实验室完成。人骨髓取自髂后上嵴骨髓穿刺的健康供者，来源于中山大学附属第二医院儿科患儿健康家属。全骨髓贴壁筛选法分离出骨髓间充质干细胞，体外扩增后以流式细胞仪鉴定其表面标志。取扩增5代的骨髓间充质干细胞，分为2组，分化组于加入20μg／L肝细胞生长因子和10μg／L成纤维细胞生长因子4的opti-MEMI低血清培养基中诱导分化，空白对照组则不加任何细胞因子。2周后，行细胞形态学观察，并检测成热肝细胞的糖原合成和尿素分泌功能(免疫细胞化学法检测甲胎蛋白、白蛋白及细胞角蛋白18，19表达，反转录-聚合酶链式反应检测甲胎蛋白、白蛋白基因mRNA转录水平，高碘酸-Schiff染色检测糖原及紫外分光光度法测定尿素氮合量)。结果：①流式细胞仪显示第5代骨髓间充质干细胞高表达表面抗原白细胞分化抗原29，不表达白细胞分化抗原34，11b。②分化组骨髓间充质干细胞至第14天，部分细胞分化为多角形的肝细胞样细胞。③免疫细胞化学法检测到细胞特异性表达甲胎蛋白、白蛋白及细胞角蛋白18，19，反转录-聚合酶链式反应显示有甲胎蛋白和白蛋白mRNA转录。④高碘酸-Schiff糖原染色可见胞浆内存在红色颗粒，呈阳性反应，培养液内尿素氮含量亦明显升高。⑤空白对照组骨髓间充质干细胞则未见上述各项变化。结论：在低血清培养体系中，采用成纤维细胞生长因子4和肝细胞生长因子联合诱导，证明人骨髓间充质干细胞在体外能定向分化为肝细胞样细胞，诱导后的骨髓间充质干细胞上有了成熟肝细胞的糖原合成和分泌尿素的特征性功能，表明骨髓间充质干细胞可作为肝细胞移植和人工肝的新型种子细胞。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的特征及功能

目的:观察人骨髓间充质干细胞体外培养定向分化为肝细胞样细胞的过程及其特征。方法:实验于2003-12/2004-05在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心实验室完成。人骨髓取自髂后上嵴骨髓穿刺的健康供者,来源于中山大学附属第二医院儿科患儿健康家属。全骨髓贴壁筛选法分离出骨髓间充质干细胞,体外扩增后以流式细胞仪鉴定其表面标志。取扩增5代的骨髓间充质干细胞,分为2组,分化组于加入20μg/L肝细胞生长因子和10μg/L成纤维细胞生长因子4的opti-MEMI低血清培养基中诱导分化,空白对照组则不加任何细胞因子。2周后,行细胞形态学观察,并检测成热肝细胞的糖原合成和尿素分泌功能(免疫细胞化学法检测甲胎蛋白、白蛋白及细胞角蛋白18,19表达,反转录-聚合酶链式反应检测甲胎蛋白、白蛋白基因mRNA转录水平,高碘酸-Schiff染色检测糖原及紫外分光光度法测定尿素氮合量)。结果:①流式细胞仪显示第5代骨髓间充质干细胞高表达表面抗原白细胞分化抗原29,不表达白细胞分化抗原34,11b。②分化组骨髓间充质干细胞至第14天,部分细胞分化为多角形的肝细胞样细胞。③免疫细胞化学法检测到细胞特异性表达甲胎蛋白、白蛋白及细胞角蛋白18,19,反转录-聚合酶链式反应显示有甲胎蛋白和白蛋白mRNA转录。④高碘酸-Schiff糖原染色可见胞浆内存在红色颗粒,呈阳性反应,培养液内尿素氮含量亦明显升高。⑤空白对照组骨髓间充质干细胞则未见上述各项变化。结论:在低血清培养体系中,采用成纤维细胞生长因子4和肝细胞生长因子联合诱导,证明人骨髓间充质干细胞在体外能定向分化为肝细胞样细胞,诱导后的骨髓间充质干细胞上有了成熟肝细胞的糖原合成和分泌尿素的特征性功能,表明骨髓间充质干细胞可作为肝细胞移植和人工肝的新型种子细胞。     

人骨髓间充质干细胞和汗腺细胞的体外分离与培养

背景：体外研究人骨髓间充质干细胞和汗腺细胞的分离培养与鉴定,可为探讨骨髓间充质干细胞再生汗腺的可行性打下基础。目的：探寻在体外分离培养骨髓间充质干细胞和汗腺细胞的有效方法。方法：采用直接贴壁法从成人骨髓中体外分离培养骨髓间充质干细胞,并进行扩增和鉴定。采用胶原酶消化法从人全层无烧伤皮肤中分离汗腺细胞,并进行扩增和鉴定。结果与结论：倒置显微镜下见分离培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,折光性强,免疫细胞化学染色显示细胞表达CD29、CD105,高表达CD44,不表达造血干细胞表面标志CD34和CD45。汗腺细胞呈扁平多角形,表达汗腺细胞表面标志细胞角蛋白7,8,18,19和癌胚抗原。说明直接贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞和胶原酶消化法分离培养汗腺细胞是可行的。     

人骨髓间充质干细胞体外扩增的可行性研究

目的：探索和建立人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)体外分离和培养的技术方法，鉴定其生物学特性，为进一步建立基因工程细胞做准备。方法：采用低糖DMEM培养液加100mL／L胎牛血清体外培养BM-MSCs。描记生长曲线；流式细胞仪分析BM-MSCs的表面标记。结果：BM-MSCs为单层贴壁生长，成规则的集束辐射状排列；表达CD13，CD29，CD59，不表达CD11，CD14，CD31,CD34，CD45，CD80，CD86，CD117，HLA-DR；采用脂质体介导方法，以pEGFP-N1质粒转染BM-MSCs。结论：该培养条件能获得大量高度均一的BM-MSCs；传代后的BM-MSCs有相同的生物学特性，以脂质体介导进行的pEGFP-N1基因转染具有可行性。     

人骨髓间充质干细胞体外扩增的可行性研究

目的:探索和建立人骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BM-MSCs)体外分离和培养的技术方法,鉴定其生物学特性,为进一步建立基因工程细胞做准备。方法:采用低糖DMEM培养液加100mL/L胎牛血清体外培养BM-MSCs,描记生长曲线;流式细胞仪分析BM-MSCs的表面标记。结果:BM-MSCs为单层贴壁生长,成规则的集束辐射状排列;表达CD13,CD29,CD59,不表达CD11,CD14,CD31,CD34,CD45,CD80,CD86,CD117,HLA-DR;采用脂质体介导方法,以pEGFP-N1质粒转染BM-MSCs。结论:该培养条件能获得大量高度均一的BM-MSCs;传代后的BM-MSCs有相同的生物学特性,以脂质体介导进行的pEGFP-N1基因转染具有可行性。     

人骨髓间充质干细胞的体外培养、鉴定及成骨分化

背景：国内外对骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导分化研究手段、测定指标均不够全面。目的：建立并完善一整套人骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定方法,探讨其体外成骨分化能力。方法：采用密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞,流式细胞仪鉴定细胞表面表型。传至第3代时更换成骨诱导培养基进行成骨分化诱导。结果与结论：人骨髓间充质干细胞生长旺盛,传代后增殖旺盛,第3代骨髓间充质干细胞表面表型CD44、CD73、CD90表达阳性,CD34表达阴性。诱导后的成骨细胞碱性磷酸酶活性增加,Gomori、Vonkossa、茜素红染色均阳性。RT-PCR检测诱导后细胞有Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素、骨唾液酸蛋白、骨桥蛋白及骨连接蛋白基因的表达,证明了人骨髓间充质干细胞成功向成骨方向分化。表明实验建立了一整套稳定、成熟的骨髓间充质干细胞分离、培养、扩增方案。     

葛根素抑制酒精导致人骨髓间充质干细胞的成脂分化

背景:葛根素属异黄酮类物质,研究发现其具有减轻酒精毒性和酒精成断症状的作用,此外还可以抗氧化、清除组织及细胞产生的氧自由基、减轻脂质过氧化对细胞的损害.目的:探讨葛根素对酒精导致的人骨髓间充质干细胞成脂分化的抑制作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-10在郑州大学基础医学院生物化学与分予牛物学教研室实验室完成.材料:骨髓取自健康成人志愿者,由郑州大学第一附属医院骨科提供.葛根素标准品由中国药品生物制品检定所提供.方法:采用梯度离心法分离培养入骨髓间充质干细胞,取传2代细胞,随机分为3组:空白对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基;模型组每天加入乙醇0.09 mol/L;实验组每天加入酒精0.09 mol/L,每两三天更换培养液时加入葛根素10-6moll/L.各组细胞培养7d.主要观察指标:采用RT-PCR法检测PPAR-γ2基因的表达,油红"O"染色进行脂肪细胞计数,测定细胞内碱性磷酸酶活性.结果:模型组PPAR-γ2 mRNA呈高表达,明显高于实验组和空白对照组(P＜0.05);实验组PPAR-γ2mRNA表达略高于对照组,但差异无显著性意义(P＞0.05).模型组脂肪细胞最多,细胞内脂滴大而丰富;实验组脂肪细胞较模型组显著减少(P＜0.05);空白对照组脂肪细胞极少.与窄白对照组比较,模型组细胞内碱性磷酸晦活性明显降低(P＜0.05);与模型组比较.实验组细胞内碱性磷酸酶活性明显升高(P＜0.05).结论:葛根素能抑制酒精导致的骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化.     

3T3-L1前脂肪细胞与蚕丝支架的体外共培养

蚕丝具各较好的力学性能,生物相容性优于传统的人工合成的可降解高分子材料.实验拟观察蚕丝对3T3-L1前脂肪细胞吸附作用及对细胞形态和功能的影响.将原料蚕丝与经胰蛋白酶消化后的原料蚕丝制成蚕丝复合物三维支架:制备3T3-L1前脂肪细胞悬液,调整细胞浓度为6×1010 L1;将3T3-L1前脂肪细胞悬液接种在支架上,培养1～4周,倒置显微镜观察可见3T3-L1前脂肪细胞伸出细长的突起沿着蚕丝不断向前迁移延伸,细胞首尾相互融合,渐渐连成一片分布于蚕丝网眼内;扫描电镜观察可见细胞与支架紧密贴附,适度伸展,并有基质分泌.结果表明蚕丝复合物三维支架对3T3-L1前脂肪细胞具有良好的吸附作用,并能维持3T3-L1前脂肪细胞正常形态和功能.     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导

背景：骨髓间充质干细胞作为良好的种子细胞,将其复合于生物支架治疗骨缺损取得了良好的进展,是当今研究的一大热点。目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向成骨样细胞分化的效果。方法：采用贴壁筛选法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分为2组,对照组细胞仅用DMEM/F12培养基培养;实验组以含成骨诱导剂的DMEM/F12培养基培养。结果与结论：全骨髓贴壁法培养的原代骨髓间充质干细胞呈梭形或多角形贴壁生长;经成骨诱导剂诱导后骨髓间充质干细胞呈圆形或卵圆形贴壁生长,碱性磷酸酶活性明显强于对照组（P〈0.01）;茜素红染色出现阳性的钙化结节;Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组有明显增加（P〈0.01）;骨钙素ELISA定量分析较对照组明显升高（P〈0.01）。提示全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞方法简单、实用,所培养的骨髓间充质干细胞在成骨诱导后表现了成骨细胞的形态学和生物学特性。     

脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞成软骨能力的比较

背景：脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞是软骨组织工程中应用较多细胞,二者在生物学特性上有诸多相似之处。目的：比较脂肪来源和骨髓来源的2种间充质干细胞的成软骨分化能力。方法：选取3月龄新西兰大白兔,取腹部脂肪,分离提取脂肪干细胞。取兔双侧股骨,采用贴壁筛选法分离提取骨髓间充质干细胞。绘制第3代脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞的生长曲线,比较2种细胞的倍增时间。对第3代脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞进行成软骨诱导,分别对诱导14d的2种细胞行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果与结论：骨髓间充质干细胞原代细胞呈聚集样生长,而脂肪干细胞原代细胞呈单个、散在生长。脂肪干细胞增殖速度要快于骨髓间充质干细胞,倍增时间短于骨髓间充质干细胞h。2种细胞成软骨诱导14d后,均表达糖胺聚糖和Ⅱ型胶原,且骨髓间充质干细胞成软骨诱导后表达Ⅱ型胶原水平高于脂肪干细胞。说明脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞体外增殖皆迅速且稳定,但是脂肪干细胞的生长增殖速度更快。单层培养时,特定条件下,脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞均能向软骨细胞转化,但是骨髓间充质干细胞比脂肪干细胞具有更高的潜能。     

人脐血间充质干细胞的体外成骨

背景：用免疫细胞阴性筛选法可以排除造血干细胞对于间充质干细胞生长的影响,较快的获得具有表达间充质干细胞的细胞群。目的：探讨人脐静脉血间充质干细胞向成骨样细胞分化的能力。方法：用免疫磁珠阳性筛选法分离脐血间充质干细胞后进行培养。取P2代细胞行成骨诱导分化。结果与结论：人脐血间充质干细胞贴壁生长,长梭形,3周长满瓶底,传代后细胞增殖迅速。细胞表型为高表达CD44＋,CD29＋和CD166＋。在成骨诱导后碱性磷酸酶染色阳性,Von-Kossa染色提示钙化结节形成。提示脐血间充质干细胞能够在体外分化为成骨样细胞。     

人脐血间充质干细胞的体外成骨

背景:用免疫细胞阴性筛选法可以排除造血干细胞对于间充质干细胞生长的影响,较快的获得具有表达间充质干细胞的细胞群。目的:探讨人脐静脉血间充质干细胞向成骨样细胞分化的能力。方法:用免疫磁珠阳性筛选法分离脐血间充质干细胞后进行培养。取P2代细胞行成骨诱导分化。结果与结论:人脐血间充质干细胞贴壁生长,长梭形,3周长满瓶底,传代后细胞增殖迅速。细胞表型为高表达CD44+,CD29+和CD166+。在成骨诱导后碱性磷酸酶染色阳性,Von-Kossa染色提示钙化结节形成。提示脐血间充质干细胞能够在体外分化为成骨样细胞。     

骨髓间充质干细胞与髓核细胞的体外共培养

背景:细胞移植治疗椎间盘退行性变目前尚处在实验室研究阶段.目的:通过SD大鼠骨髓间充质干细胞与退行性改变的髓核细胞体外共培养,探索骨髓间充质干细胞能否通过直接接触促进髓核细胞外基质的表达以及髓核细胞能否诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化.方法:取已自然退变的第6 代髓核细胞与生长良好的第4 代骨髓间充质干细胞按不同比例(75∶25,50∶50 和25∶75)体外共培养7 d,单独髓核细胞(100∶0)与单独骨髓间充质干细胞(0∶100)分别作为阳性对照和阴性对照.结果与结论:RT-PCR 检测显示共培养组(75∶25 和50∶50)蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白条带均明显亮于单独髓核细胞培养组(100∶0),吸光度值比较差异有显著性意义;免疫组织化学检测显示Ⅱ型胶原蛋白在共培养组(75∶25 和50∶50)胞浆内的表达明显高于单独髓核细胞培养组(100∶0).共培养组中可见骨髓间充质干细胞由长梭形向多角形、类圆形转变,胞浆内异染颗粒增多.提示通过体外直接接触共培养,骨髓间充质干细胞能逆转髓核细胞退变,而且髓核细胞能诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞转换.     

骨髓间充质干细胞与髓核细胞的体外共培养

背景：细胞移植治疗椎间盘退行性变目前尚处在实验室研究阶段。目的：通过SD大鼠骨髓间充质干细胞与退行性改变的髓核细胞体外共培养,探索骨髓间充质干细胞能否通过直接接触促进髓核细胞外基质的表达以及髓核细胞能否诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化。方法：取已自然退变的第6代髓核细胞与生长良好的第4代骨髓间充质干细胞按不同比例（75：25,50：50和25：75）体外共培养7d,单独髓核细胞（100：0）与单独骨髓间充质干细胞（0：100）分别作为阳性对照和阴性对照。结果与结论：RT-PCR检测显示共培养组（75：25和50：50）蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白条带均明显亮于单独髓核细胞培养组（100：0）,吸光度值比较差异有显著性意义;免疫组织化学检测显示Ⅱ型胶原蛋白在共培养组（75：25和50：50）胞浆内的表达明显高于单独髓核细胞培养组（100：0）。共培养组中可见骨髓间充质干细胞由长梭形向多角形、类圆形转变,胞浆内异染颗粒增多。提示通过体外直接接触共培养,骨髓间充质干细胞能逆转髓核细胞退变,而且髓核细胞能诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞转换。     

人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养

目的:验证贴壁方式分离人骨髓间充质干细胞,并进行体外扩增培养的可行性。方法:实验于2006-02/12在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。①实验材料:骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者,对本实验知情同意。基础培养液由含体积分数为0.15胎牛血清和低糖α-MEM配置。②实验方法:无菌条件下髂后上棘穿刺抽取骨髓组织6mL,进行细胞培养,观察细胞生长情况,待细胞融合成片、长满培养瓶底部后,用质量浓度为2.5g/L的胰蛋白酶流过所有细胞表面。倒置显微镜下观察细胞变圆、部分脱壁后,立即加入有血清培养液终止消化。③实验评估:取第3代生长状态良好的细胞,胰蛋白酶消化制成细胞悬液,接种,以细胞数为纵坐标,时间为横坐标,绘制细胞生长曲线。同时每隔2h进行细胞贴壁率检测。结果:①骨髓间充质干细胞的形态学观察:倒置显微镜下,骨髓间充质干细胞接种1d即贴壁,去除悬浮细胞后继续培养3d贴壁细胞开始增殖,伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等。至14d细胞密集在集落中心,基本铺满瓶底,第3～5代细胞呈均匀一致的长梭型,排列成旋涡状或放射状。②骨髓间充质干细胞的生长曲线:细胞传代后3d内处于潜伏期,3d后进入生长期,7d后进入平台期。③骨髓间充质干细胞的贴壁率:随着培养时间的延长,骨髓间充质干细胞贴壁率逐渐升高。传代后2,4,6,8,10,12,14,16,18,20h细胞贴壁率分别为(20.20±0.25)%,(33.00±0.29)%,(46.50±0.32)%,(69.20±0.30)%,(76.60±0.34)%,(86.50±0.27)%,(90.30±0.20)%,(96.10±0.28)%,(98.50±0.12)%,(99.00±0.07)%。结论:贴壁法分离骨髓间充质干细胞操作简便,经体外扩增培养后细胞增殖活性强,传代周期为7d,是比较理想的骨髓间充质干细胞培养方法。