利用框内缺失法构建变异链球菌srtA基因缺失株

目的 利用框内缺失法,通过IFDC2基因盒及融合聚合酶链反应（PCR）、同源重组技术构建变异链球菌UA159菌株srtA基因缺失株。方法 PCR扩增变异链球菌UA159菌株srtA基因上下游同源片段及IFDC2基因盒,将这些片段连接、转化入UA159,替换srtA基因同源片段,筛选、鉴定红霉素抗性克隆;PCR扩增、连接UA159 srtA基因上下游同源片段,将连接片段转化入前述红霉素抗性克隆中替换IFDC2同源片段,筛选、鉴定抗苯丙氨酸类似物p-chloro-phenylalanine（p-Cl-Phe）克隆。结果 PCR、琼脂糖凝胶电泳及DNA测序结果均证明srtA基因编码区被完全删除,上下游片段无缝连接,成功构建UA159 srtA基因缺失株。结论 本研究成功构建了无标记的变异链球菌UA159 srtA基因缺失株,为进一步研究该基因在生物膜中的作用及其调控机制奠定了基础。     

变异链球菌压力耐受机制的研究进展

口腔环境复杂多变,生活在其中的细菌需随时应对其突然的变化,以确保自身的生存和正常生理活动,这也是致龋菌发挥致龋毒力的前提.本文就变异链球菌在抵御口腔环境压力时,分解代谢途径的改变、细胞膜的改建以及质子移位膜腺苷三磷酸酶、尿素酶和苹果酸发酵、基因调节、蛋白质改变等研究进展作一综述.     

变异链球菌氧化应激调控机制的研究进展

龋病发生发展与牙菌斑生物膜微生态平衡密切相关。氧化应激是调控口腔微生物群落组成及结构的重要因素。变异链球菌与龋病的发生发展密切相关,变异链球菌氧化应激耐受能力会影响其在牙菌斑生物膜中的竞争力。变异链球菌氧化应激调控机制包括合成还原酶、通过金属调节蛋白调控铁、锰等金属离子摄入、转录调节因子Spx、从胞外摄取谷胱甘肽及相关的信号传导系统等。目前的研究焦点为变异链球菌如何通过氧化应激反应适应复杂的外环境及对口腔微生态的影响。通过针对关键信号通路设计靶向小分子化合物等途径,抑制变异链球菌氧化应激能力,削弱其毒力,对于口腔微生态调节和龋病防治具有重要意义。     

变异链球菌转肽酶A基因型与乳牙高龋的相关性

目的在控制乳牙龋危险指标的前提下,探讨乳牙高龋与变异链球菌(简称变链菌)转肽酶A(srt A)基因型的关系。方法采用ABI Variant Reporter软件对121株分离于高龋儿童的变链菌和121株分离于无龋儿童的变链菌srt A基因测序结果进行基因型分析。采用单因素分析方法分析srt A基因型数量、srt A各基因型以及社会、行为变量在两组中的频率分布情况,采用多因素Logistic回归方法控制混杂因素,分析变链菌srt A基因型与乳牙高龋的相关性。结果共发现15种基因型,其中无龋组中9种,高龋组中11种。3A基因型在无龋组中的突变率高于高龋组(P=0.033),3E基因型在高龋组中的突变率高于无龋组(P=0.037)。多因素分析结果表明:高月龄、低出生体重、过长的母乳喂养时间、高固体糖摄入频率、较高的可视菌斑百分率、较少的srt A 3A基因型与乳牙高龋相关。结论在有变链菌定植的儿童中,变链菌srt A 3A基因型与乳牙龋易感性相关。此外,月龄、出生体重、母乳持续喂养时间、固体糖摄入频率、可视菌斑等因素也参与早期儿童龋的发生、发展。     

变异链球菌的htrA和clpP基因对其生长和饥饿耐受的影响

目的:观察变异链球菌(下称变链菌)htrA-clpP双基因缺陷株的生长特点;比较缺陷株与标准株在饥饿条件下生长情况的差异。方法:将两菌株分别培养在含有10 g/L葡萄糖及无碳源的TPY培养基中,37℃微需氧条件下培养,从接种入培养基开始以2 h为间隔采用酶联免疫检测仪在600 nm下测定各菌株在两种生长条件下的生长曲线并比较其生长情况的差异,同时在各时间点使用葡萄糖氧化酶法试剂盒测定在含葡萄糖培养基中生长的两菌株耗糖情况并比较其差异。结果:①缺陷株在含10 g/L葡萄糖和无碳源TPY培养基中生长时,生长周期都发生了改变,对数期峰值提前且此阶段生长速度较标准株快(P<0.05),而标准株的对数期峰值及平台期A值均明显高于缺陷株(P<0.05);②标准株和缺陷株在无碳源条件下生长时细胞的生长能力较葡萄糖条件下明显降低(P<0.05);③缺陷株消耗葡萄糖的速度较标准株快(P<0.05)。结论:htrA和clpP基因缺陷可在一定程度上导致变链菌的生长及抗饥饿能力降低。     

变异链球菌luxS基因对多糖基质代谢的影响

目的:利用变异链球菌luxS基因敲除的突变株,研究该基因缺陷对于生物膜多糖基质的影响。方法:通过向生物膜培养悬液中加入与细菌直径相近的磁性小珠,利用这些小珠由于生物膜约束而在磁场中位移受限的原理,采用生物膜定量分析仪,定量比较luxS突变株与野生株在利用外源性碳水化合物合成生物膜多糖基质能力方面的差异。采用SPSS 10.0软件包对实验数据,进行Dunnet双侧t检验。结果:变异链球菌luxS基因突变株与野生株均可利用碳水化合物合成胞外多糖基质,且外源性糖的加入可显著促进生物膜的形成。在加入1%蔗糖时,2菌株生物膜均在1h内迅速形成,而两者之间无显著差异。在加入1%葡萄糖时,两菌株的生物膜形成速度均有所加快,突变株的改变则更为明显。结论:luxS基因参与调节细菌对多糖基质代谢的过程,而其对于生物膜形成的影响也更多是通过调节多糖基质代谢实现的。     

变异链球菌vicK基因调控vicR反义RNA影响胞外多糖代谢

目的:探讨vicK调控反义RNA ASvicR(Antisense vicR)及gtfB/C/D表达水平,影响变异链球菌胞外多糖代谢的机制.方法:同源重组法构建vicK缺失株及vicK补偿株,通过RT-qPCR检测与变异链球菌UA159标准株比较ASvicR及gtfB/C/D的表达水平差异.通过Western Blot...     

clpP基因对变异链球菌生长及氧化应激的影响

目的观察变异链球菌clpP基因缺陷株的生长特点;比较标准株与clpP基因缺陷株在氧化应激条件下的生长情况的差异。方法将两菌株分别培养在普通TPY液体培养基和含有H2O2终浓度0.0 005%的TPY培养基中,37℃微需氧条件下培养,从接种入培养基开始以2 h间隔采用酶联免疫检测仪在600 nm下测定各菌株的生长曲线并比较其生长情况的差异。结果①缺陷株在TPY液体培养基中生长时,生长周期发生改变,对数期峰值提前且此阶段生长速度较标准株快(P<0.05),而标准株的对数期峰值及稳定期A值均明显高于缺陷株(P<0.05);②标准株和缺陷株在含有H2O2的TPY液体培养基中生长时生长能力较无H2O2条件下明显降低(P<0.05)。结论 clpP基因的失活一定程度上导致变异链球菌生长能力和氧化应激能力的降低。     

变异链球菌LuxS基因缺陷突变株的构建及其生物膜结构的初步观察研究

目的:通过同源重组法构建变异链球菌LuxS基因缺陷突变菌株,比较其与变异链球菌UA159标准株在生物膜形成上的差异。方法:运用基因同源重组方法将氯霉素抗性基因(Cmr)与LuxS基因上下游区域的2个基因片段按一定顺序重组到PUC载体的多克隆位点中,构建出带氯霉素抗性标志的重组质粒,将载体质粒转化到含完整LuxS基因的变异链球菌UA159中,利用氯霉素抗性筛选出LuxS基因缺陷的突变株,并利用聚合酶链式反应(PCR)和哈氏弧菌发光实验进行检测。以釉质磨片为载体,在扫描电镜下观察上述两菌株含有20 g/L葡萄糖、20 g/L蔗糖的乳酪消化胨酵母(TPY)液体培养基中形成24 h的生物膜。结果:PCR基因扩增结果显示:突变株LuxS基因已被Cmr基因完全替换,成功的构建了变异链球菌LuxS基因突变株,并且突变株不能诱导哈氏弧菌BB170的生物发光。当用葡萄糖作为补充糖源时,变异链球菌UA159标准株和LuxS基因突变株所形成的生物膜表现型未见明显差异;而用蔗糖作为补充糖源时,两菌株所形成的生物膜有明显不同,UA159生物膜相对平滑均质,而LuxS基因突变株生物膜呈松散的蜂房状,基质间有较大的间隙,形成较大的团簇状菌落。结论:成功构建出LuxS基因缺陷的变异链球菌突变株,与变异链球菌UA159标准株其生物膜结构发生改变,提示LuxS会影响变异链球菌生物膜的形成。     

csn2基因缺失对变异链球菌饥饿耐受和寡营养环境下胞外多糖合成的影响

目的探索csn2基因缺失对变异链球菌(Streptococcus mutans,Sm)饥饿耐受和寡营养环境下胞外多糖合成的影响。方法培养Sm csn2基因的缺失菌株及回补菌株,通过设置不同浓度梯度培养基创造寡营养生长环境供其生长。生长曲线检测寡营养生长环境下Sm的生长,结晶紫染色,扫描电镜、激光共聚焦显微镜检测寡营养生长环境下Sm的生物膜表型,蒽酮硫酸法检测Sm生物膜中胞外多糖的量,实时荧光定量PCR检测胞外多糖合成相关基因的表达。结果生长曲线结果显示csn2基因缺失抑制了饥饿胁迫下Sm的生长,激光扫描共聚焦显微镜检测结果显示野生型菌株、csn2基因缺陷株、回补菌株在营养充足培养条件下所得生物膜胞外多糖/细菌比值为0.44±0.07、1.05±0.13和0.57±0.08,在寡营养条件下所得生物膜胞外多糖/细菌比值为0.93±0.24、3.05±0.21和1.32±0.46,表明csn2基因缺失增强了Sm在寡营养环境下胞外多糖的合成能力;在饥饿胁迫下,胞外多糖合成相关基因gtfB、gtfC的表达水平分别显示出2.5和1.8倍的增加,gtfD的表达水平下调2/3。结论csn2基因对Sm的生理功能及毒力特性表现出多种影响,包括饥饿耐受和胞外多糖合成,这些改变可能与csn2基因缺失引发复杂的调控网络相关。     

变形链球菌耐酸反应机制的研究进展

耐酸性是变形链球菌的重要致龋毒力之一。耐酸反应被认为是影响细菌生存及致龋性的重要因素。随着分子生物学的发展，对变形链球菌耐酸反应机制的研究越来越深入。本文就近年来有关变形链球菌耐酸反应机制的研究作一综述。     

Role of two component signaling response regulators in acid tolerance of Streptococcus mutans

Introduction: In bacteria, two‐component systems (TCS) involving the products of a histidine kinase gene (hk) and a response regulator gene (rr) play important roles in adaptation to environmental changes. Fourteen hk‐rr homologs and one orphan rr homolog were identified in the Streptococcus mutans UA159 genome database. There have been no comprehensive evaluations of the roles of rr homologs in the acid tolerance of S. mutans. Methods: The TCS genes (tcs) of S. mutans were designated smtcs01–15. Mutants of S. mutans UA159 with deletions of rr and hk‐rr were constructed. Acid tolerance was evaluated by comparing the doubling times at pH 7.2 and pH 5.5 between the wild‐type and mutant strains. Results: Excluding smtcs10 and 12, for which viable mutants could not be obtained, a total of 13 rr deletion mutants were constructed. The rr deletions in smtcs03, 05, 08, and 13 resulted in diminished acid tolerance in comparison with UA159. The hk‐rr double‐mutants exhibited acid sensitivity levels similar to those of the corresponding rr mutants. The results of the present study reveal the involvement of the rr genes of smtcs03 and 05 in acid tolerance. Deletion of hk and/or rr in smtcs03 generated an acid‐sensitive phenotype. In contrast, for smtcs05, while deletion of rr resulted in reduced acid tolerance, a single‐deletion of hk had no effect on acid tolerance. Conclusions: We implicated two rr genes in the acid tolerance of S. mutans. In particular, smtcs05 is a novel tcs, the sole rr of which is involved in the acid tolerance of S. mutans.     

变形链球菌耐酸性相关基因的初步研究

目的　寻找一个新的与变形链球菌耐酸性相关的基因。方法　Tn917随机诱变变形链球菌UA15 9,筛选在 pH值为 5 0不能生长的突变株 ,对比其与野生株在不同 pH值时的生长、糖酵解耐酸性和致死性pH值。不对称PCR法获得Tn917插入位点附近的基因片段 ,测序并分析。结果　筛选出一株耐酸性缺陷株b2 3。b2 3在低 pH值的生长及糖酵解耐酸性均低于UA15 9,致死性pH值高于UA15 9。Tn917插入位点在UA15 9的第 996 12 3个碱基处。 结论　构建了一株变形链球菌耐酸性缺陷株b2 3,发现了一个新的与其耐酸性相关的基因     

变异链球菌噬菌体在龋病防治中的研究进展

变异链球菌作为主要致龋病原菌之一,其在牙菌斑生物膜中的过度增殖,是龋病发生发展的重要原因。细菌病毒——噬菌体可特异性感染细菌并有效降解细菌生物膜,因此变异链球菌噬菌体可能用于防治龋病。基于噬菌体的疗法已在多个领域进行临床应用,但变异链球菌噬菌体在龋病中的应用仍处于探索阶段。本文对变异链球菌噬菌体在龋病防治方面的应用进行综述,旨在为龋病的临床预防工作提供新的思路。文献复习结果表明,活噬菌体制剂具有特异性强、亲和力高以及安全性良好的优点,但由于其结构较不稳定,可以通过冻干、喷雾干燥、添加稳定性增强剂等方式,或将噬菌体并入软膏、可生物降解聚合物基质或微粒中加工成较稳定的制剂,在一定程度上提高稳定性;噬菌体产生的裂解酶可以消化细菌细胞壁,从而释放组装好的噬菌体颗粒,其在裂解生物膜中也同样表现优异;通过噬菌体展示技术筛选出针对致龋病原体的抗原结合片段库,利用抗原结合片段的被动免疫也可达到防治龋病的目的。然而,噬菌体的宿主范围狭窄,因此在临床龋病防治工作中可以通过噬菌体联合传统治疗或其他药物使用,或使用多种噬菌体的鸡尾酒治疗。     

变异链球菌耐酸分子机制的研究进展

耐酸性是变异链球菌重要的致龋因素之一,虽然其分子机制尚不明了,但目前己分离、测序并克隆了数个相关基因。下面就己发现的影响变异链球菌耐酸性的基因及其结构、功能和可能的作用机制作一综述。     

htrA、clpP基因缺失对变异链球菌耐酸性的影响

目的 探讨htrA、clpP基因缺失对变异链球菌耐酸性的影响.方法 变异链球菌标准株及htrA缺陷株、clpP缺陷株培养至对数中期分成两组,一组作为实验组进行5 h预酸化处理(pH:5.5),一组作为对照组在普通乳酪消化胨酵母(TPY)培养液中处理5 h,然后将两组菌株在致死性酸环境(pH:3.0)处理3 h,每隔1 h取菌液采用平板活菌计数法测定活菌数,计算得到生存率,统计学分析.结果 3 h内.未经预酸化处理三种菌株生存率相比差异无统计学意义(P>0.05),预酸化处理后,与标准株相比htrA缺陷株和clpP缺陷株生存率都有下降(P<0.05),两种缺陷株相比生存率差异无统计学意义(P>0.05),预酸化处理的标准株和htrA缺陷株生存率均明显高于未经预酸化处理(P<0.05),预酸化处理对生存率的影响大于两种基因分别缺失(P<0.05).结论 与变异链球菌标准株相比,htrA缺陷株和clpP缺陷株耐酸能力有不同程度的下降.     

美兰对变形链球菌及菌斑抑制的实验研究

的　研究美兰对变形链球菌生长和产酸代谢的作用以及对体外菌斑糖酵解模型产酸代谢的作用,以探讨美兰防龋的可行性。方法　采用比浊法测定不同培养条件下变形链球菌培养液的OD值;采用气相色谱法检测不同培养条件下变形链球菌培养液中有机酸的种类和数量;测定不同处理条件下体外菌斑糖酵解模型产酸液的 pH值。结果　(1)美兰组细菌OD值低于生理盐水组,二者之间的差异具有统计学意义;(2)不同血清型变形链球菌的3个处理组中均可检测到有机酸的产生,葡萄糖组有机酸的总量最多,美兰组有机酸的总量最少;(3)美兰组产酸液的pH值与阴性对照组之间的差异有统计学意义,与阳性对照组之间的差异无统计学意义。结论　美兰可以抑制变形链球菌的生长、产酸代谢以及菌斑的产酸代谢。     

酪蛋白裂解酶P对变异链球菌致龋性的影响

变异链球菌是人类龋病的主要致病菌,不仅在数量上优势明显,而且其产酸和耐酸能力较强,其生物膜黏附于牙表面是其毒性致龋的首要步骤。酪蛋白裂解酶P（ClpP）是细菌体内一种介导蛋白质水解的热休克蛋白,可清除细菌体内的变性蛋白质,影响细菌的生物膜形成并且在细菌对生存环境的诸多应激反应中发挥着一定的作用。本文就ClpP,变异链球菌ClpP,其他致病微生物的ClpP等研究进展作一综述。     

Deletion of gtfC of Streptococcus mutans has no influence on the composition of a mixed-species in vitro biofilm model of supragingival plaque

Glucosyltransferases from Streptococcus mutans are thought to play an important role in bacterial adherence to the tooth surface. The goal of the present study was to determine the effect of the deletion of the gtfC gene, which encodes a glucosyltransferase that catalyses primarily the formation of insoluble glucan (mutan), on colonization of S. mutans in a mixed-species biofilm model of supragingival plaque. A gtfC deletion mutant of S. mutans UA159 grew poorly in biofilms on a polystyrene surface in Todd–Hewitt medium containing sucrose, but biofilm formation in the semi-defined fluid universal medium (FUM) was not affected. The S. mutans gtfC mutant colonized with the same efficiency as the wild-type strain when grown together with five other species in a mixed-species biofilm on hydroxyapatite in a mixture of FUM and saliva with pulses of sucrose and showed the same ability to demineralize enamel in vitro . Colonization of mutant and wild-type strains was also equal in an association experiment in specific-pathogen-free rats. However, the gtfC mutant gave rise to more dentinal fissure lesions and smooth surface caries than the wild-type strain; this could be caused by a change in diffusion properties as a result of to the lack of mutan.     

变形链球菌菌斑生物膜相关基因突变的研究进展

变形链球菌能生成菌斑生物膜,后者与龋病的发生密切相关.随着现代口腔医学和分子生物学的发展,菌斑生物膜相关基因的研究也越来越多,发现了许多与之相关的基因,主要包括与黏附力相关的基因、与群体感应信号系统相关的基因等.对变形链球菌菌斑生物膜相关基因的研究可以更深入地了解其致龋机制,并对寻找防龋新途径作出有益的探索.本文就近年来与变形链球菌菌斑生物膜相关的基因突变研究作一综述.