FTY720诱导多发性骨髓瘤细胞株U266自噬与凋亡的研究

目的 探讨新型免疫抑制剂FTY720对多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡及自噬的影响,并探讨相关的作用机制.方法 0、2.5、5.0、10.0及20.0μmol/L FTY720处理U266细胞24h后,应用CCK-8方法检测不同浓度FTY720对U266细胞生存率的影响;20.0μmol/L FTY720分别处理细胞0、2、6及24h,通过CCK-8方法检测FTY720作用不同时间对U266细胞生存率的影响.同时应用流式细胞术Annexin Ⅴ-FITC/PI染色检测相应的细胞凋亡率.不同浓度FTY720处理U266细胞后,应用Western blot法检测微管相关蛋白轻链3(LC3)B的表达,明确应用FTY720后是否引起细胞发生自噬.FTY720单用或联合应用自噬抑制剂Bafilomycin A1处理U266细胞24h,检测细胞生存率及凋亡率,并检测其对抗凋亡因子survivin表达的影响.结果 应用FTY720后,U266细胞生存明显受抑制,可引起细胞发生凋亡,作用呈浓度及时间依赖性.LC3B-Ⅱ表达明显增加,呈浓度依赖性,表明FTY720可引起细胞发生自噬.应用自噬抑制剂Bafilomycin A1后,可解救FTY720引起的细胞生存抑制及凋亡,同时可解救FTY720引起的survivin表达下降.结论 FTY720可引起U266细胞发生凋亡及自噬,自噬对凋亡具有促进作用.其机制可能为通过自噬在溶酶体降解了survivin等抗凋亡因子或其上游调控因子,从而促进细胞凋亡.     

Velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡研究

为了研究velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡效应及机制，采用台盼蓝拒染法检测2、10、50和100nmol／L velcade处理U266细胞活率，用流式细胞术分析Annexin—V、线粒体跨膜电位（△ψm）和氧自由基（ROS），用半定量RT—PCR法检测bcl-2 mRNA的表达。结果表明：velcade抑制U266细胞增殖；诱导U266细胞凋亡，24小时Annexin—V阳性细胞比例增高，△ψm降低；12小时时活性氧明显增高，荧光强度增强；抗凋亡基因bcl-2表达降低。结论：velcade对U266细胞具有增殖抑制和杀伤作用。其可通过内源性细胞凋亡信号通路诱导U266细胞凋亡。     

ROS在FTY720诱导U266细胞死亡中的作用机制研究

本研究探讨活性氧（ROS）在FTY720诱导多发性骨髓瘤U266细胞株凋亡及自噬中的作用。不同浓度FTY720处理U266细胞24 h后,应用流式细胞仪检测细胞凋亡,应用Western blot检测LC3B的表达。结果显示：应用FTY720可引起U266细胞发生凋亡及自噬,自噬的发生可促进细胞死亡。自噬抑制剂Bafilomycin A1可降低FTY720导致的细胞生存率下降。应用ROS抑制剂NAC或Tiron后,FTY720引起的细胞凋亡减轻,联合应用NAC或Tiron和FTY720后LC3B-Ⅱ表达较单用FTY720明显下降。结论：FTY720可诱导U266细胞发生凋亡及自噬,ROS是FTY720引起的多发性骨髓瘤细胞凋亡及自噬的共同调节剂。     

藤黄酸诱导骨髓瘤U266细胞凋亡及机制研究

目的探讨藤黄酸对人多发性骨髓瘤U266细胞凋亡的影响及机制。方法不同浓度藤黄酸处理U266细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测对细胞增殖的影响,AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞的凋亡,JC-1染色法检测线粒体跨膜电位水平,流式细胞仪检测荧光素激活的Caspase3、Caspase8、Caspase9阳性细胞水平。结果藤黄酸呈浓度依赖性抑制U266细胞的生长,藤黄酸>0.5μg/ml才出现较明显的诱导凋亡的能力,藤黄酸降低U266细胞线粒体跨膜电位水平。藤黄酸作用U266细胞24h和48h时激活的Caspase3、Caspase8、Caspase9阳性细胞比例分别上升24.9%、31.7%、32.4%和57.0%、64.5%、63.5%。结论藤黄酸可抑制U266细胞的生长,机制与诱导U266细胞凋亡有关,线粒体跨膜电位途径和胞浆激活途径参与了凋亡的发生。     

马钱子碱诱导人多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡与bax基因的表达

背景:马钱子碱具有抗肿瘤作用,而其对人多发性骨髓瘤细胞生长的影响尚不明确。目的:探讨马钱子碱诱导人多发性骨髓瘤U266细胞凋亡的机制。方法:取对数生长期的U266细胞,分别用0,0.05,0.1,0.2,0.4g/L的马钱子碱干预12,24,48h,通过MTT法测得IC50,并以此浓度干预U266细胞,通过形态学观察、RT-PCR法检测马钱子碱对人多发性骨髓瘤U266细胞株的诱导凋亡作用。结果与结论:马钱子碱诱导U266的凋亡呈时间和浓度依赖性(P<0.05),其作用48h的IC50为0.16g/L。在马钱子碱诱导的凋亡细胞中可见凋亡小体,同时,细胞中的促凋亡基因bax的表达量随马钱子碱作用时间的延长逐渐增加(P<0.01)。说明0.4g/L浓度范围内的马钱子碱具有诱导U266细胞凋亡的作用,这种作用具有浓度和时间依赖性,可能是通过激活bax基因途径实现的。     

马钱子碱诱导人多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡与bax基因的表达

背景：马钱子碱具有抗肿瘤作用,而其对人多发性骨髓瘤细胞生长的影响尚不明确。目的：探讨马钱子碱诱导人多发性骨髓瘤U266细胞凋亡的机制。方法：取对数生长期的U266细胞,分别用0,0.05,0.1,0.2,0.4g/L的马钱子碱干预12,24,48h,通过MTT法测得IC50,并以此浓度干预U266细胞,通过形态学观察、RT-PCR法检测马钱子碱对人多发性骨髓瘤U266细胞株的诱导凋亡作用。结果与结论：马钱子碱诱导U266的凋亡呈时间和浓度依赖性（P〈0.05）,其作用48h的IC50为0.16g/L。在马钱子碱诱导的凋亡细胞中可见凋亡小体,同时,细胞中的促凋亡基因bax的表达量随马钱子碱作用时间的延长逐渐增加（P〈0.01）。说明0.4g/L浓度范围内的马钱子碱具有诱导U266细胞凋亡的作用,这种作用具有浓度和时间依赖性,可能是通过激活bax基因途径实现的。     

亚砷酸联合抗坏血酸诱导多发性骨髓瘤细胞株凋亡机制的研究

目的研究砷剂联合抗坏血酸协同诱导多发性骨髓瘤细胞株凋亡的机制。方法将培养的MM细胞株KM3分为:①对照组;②ATO单药组;③ATO AA组;④AA单药组;⑤ATO α生育酚组;⑥α生育酚单药组。分别检测细胞活力、细胞凋亡率、线粒体膜电位和细胞内GSH、H2O2水平。结果①ATO诱导MM细胞凋亡,AA增强其作用,α生育酚减弱其作用;②AA降低细胞内GSH水平,α生育酚升高细胞内GSH;③AA和α生育酚均升高细胞内H2O2水平;④ATO降低细胞线粒体膜电位,AA增强ATO的作用,α生育酚减弱其作用。结论砷剂诱导肿瘤细胞凋亡敏感性与细胞内GSH水平呈负相关,砷剂通过降低细胞线粒体膜电位,诱导细胞凋亡。AA通过降低细胞内的GSH水平,增加细胞对砷剂的敏感性。选择其他的还原剂无此作用。     

大萼香茶菜甲素A通过抑制蛋白酶体诱导多发性骨髓瘤细胞株U266凋亡

本研究探讨大萼香茶菜甲素A（macrocalyxinA,MA）体外对多发性骨髓瘤细胞株蚤白酶体抑制作用及其诱导凋亡的分子机制。以不同浓度（2、4、8μgm1）的MA体外作用于U266细胞,用Hochest染色法和Annexin V／PI双染色观察MA诱导U266细胞凋亡作用;用Westernblot检测泛素、蛋白酶体19S亚基s6’亚单位和蛋白酶体20S亚基中β1、β1i、β2、β2i、β5、β5i亚单位,以及BAD、BCL-2、FAS、FAS-L、MAPK、PARP、Pro—caspase3、cleaved—caspase3蛋白的表达。结果表明,随着MA作用时间的延长和剂量的增加,Hoechst33258染色的细胞内出现致密颗粒或块状的荧光颗粒,AnnexinV＋／PI。细胞和总凋亡细胞（AnnexinV＋／PI-和AnnexinV＋／PI＋）增加;MA可使U266细胞内泛素化水平增高,抑制20S蛋白酶体亚单位β1i、β2、β5i、和19S蛋白酶体泛素识别亚基s6’表达。与此同时,BCL-2、MAPK、PARP、pro—caspase3表达随着药物作用浓度的增高而下调,BAD、FAS、FAS—L、cleaved—caspase3表达则增加。结论：大萼香茶菜甲素A具有抑制蛋白酶体的作用,线粒体凋亡和死亡受体途径有可能参与MA诱导细胞的凋亡。     

三氧化二砷对骨髓瘤细胞系U266抑制增殖及诱导凋亡的机制研究

本研究探讨三氧化二砷(As2O3)在体外对骨髓瘤细胞系U266的生物学效应及其机制。用MTT法观察As2O3对U266细胞增殖的影响,用流式细胞术、DNA凝胶电泳法分析As2O3对U266细胞凋亡的影响,以RT-PCR法检测2μmol/LAs2O3不同处理时间对U266细胞人端粒酶逆转录酶蛋白催化亚单位(hTERT)mRNA的表达变化,用Western blot法检测As2O3不同处理时间对U266细胞procaspase-3、bcl-2及hTERT蛋白水平的表达变化。结果表明:As2O3能明显抑制U266细胞增殖,半数抑制浓度(IC50)为2μmol/L;As2O3能诱导U266细胞凋亡,呈现剂量和时间依赖性;2μmol/L As2O3不同时间处理U266细胞后procaspase-3蛋白及hTERT mRNA、蛋白表达呈时间依赖性降低,而bcl-2蛋白表达未发生变化。结论:As2O3通过改变线粒体跨膜电位,触发了U266细胞的线粒体凋亡途径,导致了caspase-3的活化,最终诱导U266细胞凋亡;hTERT表达下调也是As2O3诱导U266细胞凋亡的重要作用机制。     

阿扎胞苷诱导多发性骨髓瘤细胞株的凋亡及其机制的研究

目的:探讨阿扎胞苷对多发性骨髓瘤细胞株U266和H929的抑制增殖、诱导凋亡的作用及其机制。方法:采用CCK-8分析阿扎胞苷对多发性骨髓瘤细胞株的增殖的抑制作用,应用吖啶橙染色和流式细胞术分析细胞DNA含量以判断阿扎胞苷对多发性骨髓瘤细胞株诱导凋亡作用,流式细胞术分析细胞周期以判断阿扎胞苷对多发性骨髓瘤细胞株细胞周期的影响,RT-PCR检BCL-2、BAX的表达,Western blot检测caspase-3和p-ERK1/2性以分析阿扎胞苷诱导骨髓瘤细胞凋亡的可能机制。结果:阿扎胞苷抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖,导致多发性骨髓瘤细胞BCL-2/BAX比例下降,caspase-3和p-ERK1/2活性增高,使多发性骨髓瘤细胞周期停止在G_2/M期,诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡且呈剂量依赖性。结论:阿扎胞苷对多发性骨髓瘤细胞具有抑制增殖和诱导凋亡作用,其作用机制可能与BCL-2/BAX比例下降,caspase-3活化以及影响细胞周期有关。     

二甲双胍通过线粒体途径诱导人骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡

目的:二甲双胍具有体外抑制肿瘤细胞生长的作用,但是对于多发性骨髓瘤细胞生长的影响和作用机制尚未可知。本研究探讨二甲双胍对人骨髓瘤细胞株U266的生长抑制作用及其可能的机制。方法:将不同浓度的二甲双胍作用于骨髓瘤细胞,采用MTT法检测细胞增殖抑制率、PI单染检测细胞周期。Western blot检测BCL-2蛋白家族蛋白表达水平的变化以及细胞色素C的释放。结果:二甲双胍可抑制U266细胞增殖,且抑制率呈时间和浓度依赖性变化;与对照组相比,二甲双胍作用48 h,细胞阻滞于G_1/G_0期;BCL-2、BCL-XL的蛋白表达水平降低、而BAX的蛋白表达水平明显升高;细胞色素C从线粒体释放到细胞质中的量增加,PARP的蛋白质剪切明显增强。结论:二甲双胍能够抑制U266细胞增殖及诱导细胞凋亡,线粒体凋亡途径可能是二甲双胍诱导细胞凋亡的机制之一。     

苦参碱诱导多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226凋亡的实验研究

本研究探讨苦参碱对人骨髓瘤细胞株RPMI8226的作用及其机制。用不同浓度苦参碱处理RPMI8226细胞24、48小时,通过形态学观察、Annexin-V分析、DNA琼脂糖电泳、线粒体膜电位检测观察苦参碱对RPMI8226细胞的促凋亡作用。结果表明：RPMI8226细胞经苦参碱处理后,出现典型的细胞凋亡形态,凋亡早期细胞膜外翻,DNA琼脂糖电泳出现典型的梯状结构,线粒体膜电位崩塌。结论：苦参碱能有效地诱导骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞凋亡,凋亡率与药物剂量和作用时间呈依赖性。     

冬凌草甲素诱导多发性骨髓瘤U266细胞、RPMI8226细胞增殖和凋亡实验研究

目的 探究冬凌草甲素对多发性骨髓瘤(MM)U266细胞、RPMI8226细胞增殖和凋亡的影响。方法 通过细胞培养和处理方法,采用0、10、20、30、40、50μmol/L的冬凌草甲素处理MM相关U266细胞、RPMI8226细胞48 h。采用MTT法测定U266细胞、RPMI8226细胞的增殖情况,采用Annexin V-FITC/PI染色试剂盒检测U266细胞、RPMI8226细胞凋亡情况,并采用蛋白质印迹法测定Bax、Bcl-2蛋白表达。结果 处理48 h后,随着冬凌草甲素浓度(10～50μmol/L)的增加,U266细胞、RPMI8226细胞的细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。处理48 h后,随着冬凌草甲素浓度(10～50μmol/L)的升高,促凋亡蛋白Bax表达量逐渐升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达量逐渐降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 冬凌草甲素具有抑制MM细胞增殖和诱导细胞凋亡的潜力,其作用机制可能与促进Bax表达,抑制Bcl-2表达,改变细胞Bcl-2/Bax比例,调节细胞凋亡有关。     

C反应蛋白对多发性骨髓瘤细胞系U266增殖机制的研究

为了观察C反应蛋白（CRP）对人骨髓瘤细胞系U266细胞增殖活性的作用机制,将液氮冻存的U266细胞复苏后,悬浮培养,第3天收集细胞备用,分别以不同浓度CRP（0、5、10、20mg／L）培养24小时,采用血液分析仪检测细胞增殖情况,采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测凋亡相关蛋白survivin和HSP90ct的表达。结果发现：CRP处理的细胞组增殖率及survivin、HSP90α的表达量均高于对照组（P〈0．05）,20mg／LCRP组作用最显著;survivin、HSP90α之间表达具有显著相关性（r=0．737,P〈0．0001）。结论：CRP是通过调节凋亡抑制蛋白Survivin及HSP90α的表达发挥促进U266细胞增殖的作用。     

浅蓝菌素改变多发性骨髓瘤U266细胞凋亡相关基因表达谱的研究

目的研究浅蓝菌素改变多发性骨髓瘤（MM）细胞系U266细胞凋亡相关基因的表达谱变化，进一步明确浅蓝菌素引起U266细胞凋亡的分子机制。方法用SuperArray cDNA基因芯片，分析U266细胞在浅蓝菌素（20μg／ml）处理前后细胞凋亡相关基因的表达谱变化，对Rip2、caspase9及TRAF2代表性主要差异基因进行半定量RT-PCR进行验证。结果浅蓝菌素处理U266细胞12h后，与空白对照组比较，在研究的96个基因中，共有44个细胞凋亡相关基因表达改变较明显，其中表达上调2倍以上的基因41个，表达下调2倍以上的基因3个。caspase9表达的显著上调，说明线粒体途径在凋亡中起了主要作用；TRAF2基因表达的变化，提示在凋亡过程中有细胞核内转录因子的参与。结论浅蓝菌素引起U266细胞的凋亡有死亡受体信号通路和死亡受体非依赖的信号通路共同参与，线粒体途径在凋亡中起了主要作用，细胞核内转录因子参与了浅蓝菌素引起U266细胞的凋亡。     

地西他滨对多发性骨髓瘤U266细胞株生物学行为的影响

本研究以多发性骨髓瘤U266细胞株为实验对象,探讨地西他滨对其生物学功能的影响,为MM的临床治疗提供新思路及实验依据,也为MM的发病机制提供进一步的佐证。应用MTT实验、平板克隆形成试验、FCM分析细胞周期、transw ell迁移及m atrigel侵袭试验分别检测地西他滨对U266细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。结果表明,地西他滨随着浓度增加对U266细胞增殖抑制作用增强,呈剂量和时间依赖性;FCM检测结果表明地西他滨处理后,G0-G1期U266细胞明显增加,S期和G2-M期细胞降低(p<0.05),表明地西他滨可抑制U266细胞DNA合成,将细胞周期阻滞在G0-G1期;低浓度(0.8mm o l/L)地西他滨处理后,U266细胞迁移能力及侵袭力明显降低(p<0.05)。结论:地西他滨对U266细胞的增殖、迁移、侵袭能力均有抑制作用,本研究为地西他滨应用于MM临床治疗提供了一定的实验依据。     

U266多发性骨髓瘤细胞株中CD138阴性细胞的分离和培养

目的从U266多发性骨髓瘤细胞株中分离CD138阴性细胞,对其进行培养,观察分离到的CD138阴性细胞的生长特性。方法用免疫磁珠法分离U266多发性骨髓瘤细胞株中的CD138阴性细胞,用干细胞培养基进行培养。结果从U266多发性骨髓瘤细胞株中分离CD138阴性细胞在干细胞培养基内呈球体生长。结论 CD138阴性细胞具有干细胞生长的相关特征。     

多发性骨髓瘤U266细胞株DNA甲基转移酶和甲基结合蛋白的表达

目的检测多发性骨髓瘤（MM）细胞DNA甲基转移酶（DNMTs）及甲基结合结构域（MBD）蛋白[包括甲基CpG结合结构域蛋白（MeCP2）和MBD2]的表达状况,探索其在基因甲基化过程的作用。并观察5-氮杂-2＇-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）和/或曲古霉素A（TSA）对DNMTs及MeCP2和MBD2的作用。方法利用荧光定量聚合酶链反应（PCR）分析MMU266细胞株DNMTs（DNMT1、DNMT3a、DNMT3b）及MeCP2和MBD2蛋白的mRNA水平,与10名正常人单个核细胞（PBMC）mRNA比较。4μmol/L5-Aza-CdR和/或0.1μmol/LTSA与U266细胞共培养,分析MBD2和MeCP2蛋白mRNA的变化情况。WesternBlot检测这2种药物对U266细胞MBD2蛋白的影响。结果各甲基化调控蛋白mRNA与PBMCmRNA相比,差异有统计学意义（P均〈0.05）。其中DNMTs和MBD2蛋白在U266细胞中表达升高,而MeCP2蛋白表达下降。经5-Aza-CdR和/或TSA作用后,MBD2表达下降,MeCP2升高。5-Aza-CdR在蛋白水平对MBD2的作用亦不显著;TSA可明显降低MBD2的表达,且具有时间依赖性。结论 DNMTs和MBD2、MeCP2蛋白在MMU266细胞中表达异常,可能与U266细胞多个抑癌基因启动子高甲基化相关。5-Aza-CdR和TSA可以逆转U266细胞MBD2和MeCP2的表达。     

尿多酸肽通过调节caspase家族诱导多发性骨髓瘤细胞U266凋亡的实验研究

目的探讨尿多酸肽抑制多发性骨髓瘤（MM）细胞株U266增值及其机制。 方法采用四甲基偶氮唑（MTT）比色法计算不同尿多酸肽浓度（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/g）对U266细胞生长的抑制率,Hoechst33258染色观察尿多酸肽作用后的细胞凋亡情况,Annexin-V/碘化丙啶（PI）检测尿多酸肽作用6、12、24 h后与对照组细胞（加细胞未加药物）的细胞凋亡率。使用Western-blotting法检测caspase 8、caspase 3及其激活物在U266细胞株经尿多酸肽（4 mg/g）作用6、12、24 h后的表达改变。 结果随着尿多酸肽浓度提高,U266细胞抑制率显著上升（F= 17.276,P< 0.001）。经尿多酸肽作用后,Hoechst33258荧光染色提示细胞核浓集及出现凋亡小体。Annexin-V/PI分析显示,尿多酸肽处理6、12、24 h后细胞凋亡率显著高于对照组细胞[（5.53 ± 0.28）%、（9.43 ± 1.78）%、（21.50 ± 2.45）%、（3.03 ± 0.11）%,F= 12.242,P<0.001]。同时,随着尿多酸肽作用时间延长,pro-caspase 8、pro-caspase 3表达明显下降（F= 18.241,P<0.001;F= 4.924,P= 0.005）,而active-caspase 8、active-caspase 3表达明显上升（F= 22.322,P<0.001;F= 6.213,P= 0.002）。 结论尿多酸肽可抑制U266细胞增殖,且可能通过caspase凋亡途径在其中起主要作用。