大鼠皮层神经元原代培养、鉴定及氧糖剥夺模型的建立

目的 原代培养和鉴定大鼠皮层神经元,并建立大鼠皮层神经元氧糖剥夺(OGD)模型.方法 采用酶消化法和机械分离法相结合进行大鼠神经元原代培养,采用抗NSE免疫细胞化学染色鉴定,应用缺氧D-Hank液及缺氧培养罐行OGD,台盼蓝染色及LDH漏出率检测细胞损伤程度.结果 神经元培养至第6天,NSE染色阳性细胞为86.32%±2.64%;神经元经不同时长的OGD处理后,台盼蓝染色呈现不同形态;OGD 60 min时,神经元LDH漏出率较对照组明显增加(P<0.05).结论 成功完成大鼠皮质神经元原代培养,神经元在培养第6天可用于模型制备,成功建立神经元OGD模型.     

人组织激肽释放酶对糖尿病肾病大鼠的影响

目的：探讨基因重组人组织激肽释放酶（KLK）对大鼠糖尿病肾病的影响。方法：大鼠经链脲佐菌素诱导制成糖尿病（DM）模型于第8、12、16周留取尿标本。比色法检测大鼠血浆KLK变化，放射免疫技术、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫组化技术测定肾组织一氧化氮（NO）、环磷腺苷（cAMP）、血内皮素1（ET-1）变化及光镜电镜观察肾组织形态改变。结果：（1）DM组与正常对照组（C）组大鼠比较，体重（BW）、血浆KLK活性、肾组织中NO、cAMP含量下降（P〈0．01或P〈0．05）。而DM组的血糖（BG）、血肌酐、血尿素氮（BUN）、肾重（KW）体重比值、ET-1、尿白蛋白（Ualb）排泄率、24h尿蛋白定量均高于（NC）组（P〈0．01或P〈0．05）。（2）糖尿病KLK治疗组（DK）组与NC组大鼠比较，BW、血浆KLK活性、肾组织中NO、cAMP含量下降（P〈0．01或P〈0．05）；而BG、KW／BW、Ualb排泄率、24h尿蛋定量均高于c组（P〈0．01或P〈0．05）。DM组、DK组间BG、BUN、BW、KW／BW无显著性差异，血浆KLK活性、肾组织中NO、cAMP含量，DK组明显高于DM组（P〈0．01或P〈0．05）。而血肌酐、Ualb排泄率、24h尿蛋白定量则显著低于DM组（P〈0．01或P〈0．05）。（3）①16周时，DM组血浆KLK活性明显低于8周时的水平（P〈0．01），明显较NC组降低（P〈0．01）；而DK组血浆KLK活性明显高于8周时的水平（P〈0．05），该组病变较DM组轻。②DK组12周、16周尿白蛋白排泄率均低于8周时的水平（P〈0．05），16周时，DK和DM比较尿白蛋排泄率差异显著（P〈0．05）。③16周时，DM组肾组织中NO、cAMP含量则明显低于C组（P〈0．01），而与DM组相比，DK组肾组织中NO、cAMP含量较高（P〈0．01或P〈0．05）。结论：给予外源性人组织KLK可抑制糖尿病大鼠肾小球系膜细胞增殖、基质增多，可使尿蛋白排泄减少，延缓糖尿病肾病的发展。     

激肽释放酶激肽系统与糖尿病肾病

激肽释放酶激肽系统(KKS)包括激肽释放酶、激肽原、激肽和激肽酶.肾脏含有KKS的所有组分.KKS通过影响系膜细胞增生、细胞外基质的合成与降解、足突细胞ZO-1蛋白的重排等而在糖尿病肾病的发生、发展中起重要作用.以KKS为靶向的糖尿病肾病干预策略包括胰激肽原酶、血管紧张素转换酶抑制剂、中性肽链内切酶抑制剂、血管肽酶抑制...     

人组织激肽释放酶的神经保护作用

大量临床和实验研究提示,人组织激肽释放酶(HTK)具有神经保护作用,如扩张脑动脉、促进缺血脑内新血管形成、促进神经胶质细胞迁移、抑制细胞凋亡、减少炎症细胞浸润等。基因敲除和转基因模型的建立进一步扩大了对HTK研究的深度和广度,为缺血性脑血管病的治疗和新药开发提供了广阔的前景。     

激肽释放酶-激肽系统与脑缺血

最近的一些研究表明,脑缺血后激肽释放酶-激肽系统被激活。脑缺血后,转移激肽释放酶基因可通过促进胶质细胞存活和迁移,抑制细胞凋亡,促进血管生存和神经生成提供神经保护效应。研究脑缺血后激肽释放酶-激肽系统的内在作用机制,有望为卒中的治疗和康复提供一条新的思路。     

肝硬化患者血浆前激肽释放酶的检测及其临床意义

本文采用底物发色法测定６０例肝硬化患者；３０例健康人的血浆前激肽释放酶水平。结果表明：肝硬化患者血浆ＰＫ水平显著降低，与肝功能损害程度有关，随肝功能损害程度的加重而降低，而且血清白蛋白水平及血浆凝血酶原时间正常的肝化患者血浆ＰＫ水平仍显著你于正常对照组，提示血浆ＰＫ是更为敏感的反映肝功能损害的指标。     

降压宝蓝片对SHR肾损害及激肽释放酶-激肽系统的影响

目的 探讨降压宝蓝片对自发性高血压大鼠(SHR)肾损害及激肽释放酶-激肽系统(KKS)的影响。方法 30只12周龄雄性SHR随机分为模型(SHR)组(0.5%羧甲基纤维素钠)、依那普利组(0.02 g/kg依那普利)、降压宝蓝片组(0.6 g/kg降压宝蓝片),另设同龄正常血压的雄性WKY大鼠为对照(WKY)组(0.5%羧甲基纤维素钠),灌胃给药,连续12 w。取肾组织,苏木素-伊红(HE)及马松三色(Masson)染色观察肾小球硬化指数(GSI)及肾组织间质胶原蛋白容积分数(CVF)变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定肾组织匀浆液低分子量激肽原(LK)、组织激肽释放酶(TK)、缓激肽(BK)、前列环素(PG)I2;Western印迹测定肾组织缓激肽2型受体(B2R)蛋白表达。结果 与WKY组比较,SHR组GSI和CVF显著增加(P<0.01),肾组织BK、PGI2含量及B2R蛋白表达显著降低(P<0.05)。降压宝蓝片能显著降低SHR大鼠GSI、CVF(P<0.01),明显升高肾组织PGI2含量及B2R蛋白表达(P<0.05),对BK、TK、LK含量有升高...     

激肽释放酶在糖尿病肾病中的研究进展

激肽释放酶（kallikrein，KLK）是机体激肽系统（kinin-kallikrein system，KKS）的一个组分。KKS是体内主要的降血压系统之一，由激肽原、KLK、激肽和激肽酶组成。KLK也被称为激肽原酶，是激肽系统的主要限速酶，它作用于激肽原而生成具有活性的激肽。KLK是一组存在于多数组织和体液的丝氨酸蛋白酶，其特异性地在碳末端切割底物肽，产物是激肽。     

17βE2对氧糖剥夺/复糖复氧诱导神经元损伤的保护作用

将培养8d的大鼠皮质神经元分为4组,A组为正常对照组、B组采用氧糖剥夺／复糖复氧（OGD／R）、C组采用17βE2预处理＋OGD／R、D组采用17βE2与PI3K抑制剂LY294002共同预处理＋OGD／R。发现OGD／R后神经元活性逐渐下降,P-Akt、凋亡诱导因子（AIF）表达较正常对照组增加;17βE2可明显提高OGD／R后神经元的存活率,使p-Akt的表达明显增加,AIF表达降低;LY294002与17βE2共同预处理,抑制了17βE2的作用。提示17βE2可减轻OGD／R诱导的皮质神经元损伤,这种保护作用可能与AIF及PI3K／Akt信号通路相关。     

组织激肽释放酶对酸敏感离子通道1a介导的大鼠酸中毒神经元氧化应激的影响

目的探讨组织激肽释放酶（TK）对酸中毒损伤神经元的保护作用及对酸敏感离子通道1a（ASIC1a）介导的氧化应激反应的影响。方法取原代培养8～10 d的新生SD大鼠皮质神经元,随机分为正常对照组,酸中毒组（pH=6.0的细胞外液处理4 h）,TK（100 nmol/L）、缓激肽B2受体（B2R）激动剂（缓激肽,100 nmol/L）、ASIC1a阻断剂（狼蛛毒素,100 ng/ml）及B2R拮抗剂（HOE140）预处理组。TK、B2R激动剂、ASIC1a阻断剂预处理组在给予酸性液处理前,先给予相应药物预处理30 min;B2R拮抗剂预处理组,在TK干预前30 min,给予HOE140（500 nmol/L）,30 min后给予酸性液处理。采用活细胞计数试剂盒（CCK-8）测定各组神经元的存活率。应用不同的荧光探针标记细胞内活性氧（ROS）,一氧化氮（NO）,线粒体膜电位（MMP）以及细胞内游离Ca2＋,采用荧光酶标仪测定上述各组细胞内各荧光物质的相对强度,计算各物质的相对含量。结果①正常对照组,TK、ASIC1a阻断剂及B2R激动剂预处理组的神经元存活率分别为（96.6±2.6）%、（79.7±5.9）%、（74.2±4.6）%、（77.7±5.0）%,与酸中毒组的（59.0±6.0）%比较,差异均有统计学意义（P〈0.01）。B2R拮抗剂预处理组为（64.6±3.8）%,与TK预处理组比较差异有统计学意义（P〈0.01）。②与正常对照组比较,酸中毒组细胞内ROS、NO及游离Ca2＋水平显著增高（P〈0.01）,MMP水平显著下降（P〈0.01）;与酸中毒组比较,TK、ASIC1a阻断剂及B2R拮抗剂预处理组细胞内ROS、NO及Ca2＋水平显著下降,MMP水平显著增高（P〈0.01或P〈0.05）;而与TK预处理组比较,B2R拮抗剂预处理组细胞内ROS、NO含量,游离Ca2＋水平明显增高,MMP水平明显下降,P〈0.01。结论在酸性环境下,ASIC1a激活介导了神经元内氧化应激反应,诱导神经元损伤;TK通过B2R能够减轻ASIC1a介导的氧化应激性损伤。     

HSP70蛋白在神经元样PC12细胞氧糖剥夺后的表达变化

目的 探讨神经细胞氧糖剥夺(OGD)造模后PC12细胞凋亡和热休克蛋白(HSP)70水平,评价OGD模型.方法 利用PC12细胞,经NGF刺激诱导向神经细胞分化,利用OGD建立神经细胞OGD模型;利用MTT法、共聚焦显微镜鉴定PC12细胞转化为神经元样细胞及OGD模型的建立,Western印迹检测OGD后HSP70蛋白的表达.结果 应用终浓度50 ng/ml NGF的DMEM完全培养基培养PC12细胞,随培养时间的增加细胞呈典型的神经元形态.微管相关蛋白(MAP)2免疫荧光细胞化学染色呈强阳性;建立OGD后神经元出现不同程度的损伤、坏死及凋亡,随OGD时间延长存活率逐渐降低、凋亡率升高、HSP70蛋白表达增加.结论 NGF有效地诱导PC12细胞转化为神经细胞,OGD可以有效诱导HSP70表达.     

激肽释放酶-激肽系统对心血管系统的保护作用

1909年Abelous等[1]首次报道静脉注射人尿液可引起狗的血压短暂下降,发现尿中存在降压物质。1930年Kraut等[2]在胰腺发现高浓度此物质,命名为“Kallikrein”,即激肽释放酶(KLK)。近30年来,随着分子生物学和细胞生物学技术的发展和应用,发现激肽释放酶-激肽系统(kallikrein kini     

激肽释放酶-激肽系统与血管内皮细胞功能关系研究新进展

激肽释放酶-激肽系统（kallikrein—kinin system，KKS）是机体重要的调节系统，广泛存在于许多组织和器官中，参与多种生理和病生理过程。许多临床研究和基础实验已证实KKS具有强大的心血管保护作用，新近研究表明KKS与血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）功能的关系密切。     

氧糖剥夺影响人脐静脉内皮细胞紧密连接相关蛋白的机制研究

目的 探究氧糖剥夺影响人脐静脉内皮细胞（HUVEC）紧密连接相关蛋白的机制。方法 本实验时间为2021年5月至2022年1月。将HUVEC分为正常组、氧糖剥夺6 h组和氧糖剥夺24 h组。正常组HUVEC进行正常培养;氧糖剥夺6 h组HUVEC制备氧糖剥夺模型,并在缺氧培养箱中培养6 h;氧糖剥夺24 h组HUVEC制备氧糖剥夺模型,并在缺氧培养箱中培养24 h。在倒置显微镜下观察HUVEC的形态并拍照,采用CCK-8检测孵育1、2、3、4 d细胞增殖水平。将HUVEC分为氧糖剥夺组、空质粒组、排斥导向分子（RGM）a质粒敲减组。氧糖剥夺组HUVEC制备氧糖剥夺模型,并在缺氧培养箱中培养24 h;空质粒组HUVEC在氧糖剥夺组基础上,转染空载体;RGMa质粒敲减组HUVEC在氧糖剥夺组基础上,转染慢病毒。采用Western blot法检测RGMa、紧密连接相关蛋白（Claudin-5和ZO-1）、基质金属蛋白酶（MMP）-9、CDC42。结果 与正常组相比,氧糖剥夺6 h组、氧糖剥夺24 h组细胞体肿胀或变形,光晕消失,细胞边缘不清晰,细胞体内出现空泡,突起缩短,连接断裂,视野内颗粒样...     

窖蛋白1对大鼠星形胶质细胞糖氧剥夺损伤的影响

目的探讨糖氧剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)对体外培养的大鼠星形胶质细胞窖蛋白1(caveolin-1,Cav-1)的影响。方法原代培养出生24h内SD大鼠大脑皮质星形胶质细胞,分为对照组和OGD组(给予星形胶质细胞6h的OGD和24h的再灌注损伤,建立OGD损伤模型)。用多重免疫荧光的方法检测星形胶质细胞Cav-1表达,实时荧光定量PCR和Western blot的方法检测星形胶质细胞Cav-1表达的变化。根据小干扰RNA(siRNA)的原理,将Cav-1siRNA转染星形胶质细胞,采用CCK-8的方法检测星形胶质细胞活力。结果大鼠大脑皮质星形胶质细胞Cav-1普遍表达。与对照组比较,OGD组星形胶质细胞Cav-1mRNA和蛋白表达量下降(P<0.05)。siRNA转染后,与对照组比较,OGD组星形胶质细胞活力下降(P<0.05)。结论 SD大鼠大脑皮质星形胶质细胞Cav-1表达的下调,导致OGD后细胞损伤加重,提示Cav-1对星形胶质细胞具有保护作用。     

51例急性心肌梗塞患者血浆前激肽释放酶活性变化的分析

为了解急性心肌梗塞(AMI)血浆激肽系统的变化,我们动态观察51例AMI后血浆前激肽释放酶(PK)的活性变化,与40例正常人血浆PK进行比较。结果表明,AMI一周内血浆PK最低,以后逐步恢复正常;有并发症组低于无并发症组,死亡组明显低于存活组。这提示,AMI时测定血浆PK浓度可反映病情的严重程度,对了解预后亦有一定价值。     

血浆前激肽释放酶在血管疾病中的研究进展

生物体内,血浆激肽释放酶(kallikrein,Kal)以其无活性的前体-血浆前激肽释放酶(prekallikrein,PK)的形式存在,属于胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族.PK参与调控多种生理途径,如凝血途径,纤维蛋白溶解、炎症反应和补体途径等.因此,PK被认为是多种疾病的潜在靶标,包括遗传性血管水肿、糖尿病的微血管并发...     

血浆人源性激肽释放酶结合蛋白水平对严重脓毒症患者预后评估的意义

目的:探讨血浆人源性激肽释放酶结合蛋白(Kal)水平对严重脓毒症患者预后评估的意义。方法:选择严重脓毒症和脓毒性休克患者88例。根据60 d后患者临床结局分为存活组(58例)和死亡组(30例)。比较2组患者在临床特征方面的差异,探讨Kal水平与各临床参数之间相关性及影响严重脓毒症和脓毒性休克患者预后的因素。结果:2组患者在年龄、急性呼吸窘迫综合征例数、脓毒性休克例数、APACHEⅡ评分、SOFA评分、ICU时间、机械通气时间、Kal水平、CRP水平方面差异显著(均P 0. 05)。Kal水平与年龄、急性呼吸窘迫综合征、有创机械通气、脓毒性休克、APACHEⅡ评分、SOFA评分、ICU时间、机械通气时间、CRP水平呈负相关(均P 0. 05)。APACHEⅡ评分高、SOFA评分高、Kal水平偏低、CRP水平偏高是影响严重脓毒症和脓毒性休克患者预后的危险性因素(均P 0. 05)。其中,入住ICU时血浆Kal水平4μg/mL提示患者预后差。结论:入住ICU时血浆Kal水平4μg/m L提示严重脓毒症和脓毒性休克患者预后不良,血浆Kal水平可作为严重脓毒症和脓毒性休克患者预后评估的重要指标。     

结直肠癌组织中血浆激肽释放酶B1蛋白的表达变化及其临床意义

目的 观察结直肠癌组织中血浆激肽释放酶B1(KLKB1)蛋白的表达变化,并探讨其临床意义.方法 结直肠癌患者86例,均接受根治性手术治疗,术中留取癌组织及癌旁组织,采用免疫组织化学法检测结直肠癌组织及癌旁正常组织中KLKB1蛋白,分析KLKB1蛋白阳性表达与结直肠癌患者临床病理参数的关系及相关性.结果 结直肠癌组织及癌...     

人激肽释放酶重组腺相关病毒对人脐静脉内皮细胞的影响

目的:构建携带人激肽释放酶(kallikrein,KK)基因的重组腺相关病毒载体,并导入体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC),观察其对缓激肽(BK)、一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)水平和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达的影响。方法:(1)将KK基因定向克隆入腺相关病毒载体质粒pAAV-MCS中,构建成pAAV-KK;(2)分别将pAAV-KK及pAAV-LacZ与另外两种质粒pHelper、pAAV-RC通过脂质体共同转染AAV-293细胞,包装出rAAV-KK和rAAV-LacZ重组腺相关病毒。将rAAV-LacZ原液稀释成不同浓度梯度并感染HT-1080细胞,通过β-半乳糖苷酶染色测定病毒感染滴度,并观察LacZ传代HT-1080细胞的表达情况;(3)将rAAV-KK感染HUVEC,检测其对缓激肽、NO、ET-1水平和eNOS基因表达的影响。结果:(1)成功构建了带有KK目的基因的重组腺相关病毒载体和带有LacZ报告基因的重组腺相关病毒载体(对照载体);(2)rAAV-LacZ重组病毒以感染滴度6.2×107I U/ml感染HT-1080细胞后,LacZ基因能够在连续传代的HT-1080细胞内稳定持续表达;(3)与空白组、LacZ组(对照组)相比,KK感染组的HUVEC细胞培养液中BK[(2.864±1.36)pmol/ml∶(2.782±1.48)pmol/ml∶(6.576±2.08)pmol/ml]、NO[(16.42±1.02)μmol/L∶(16.46±1.25)μmol/L∶(21.28±1.46)μmol/L]水平明显增加,eNOS基因[(0.353±0.031)∶(0.364±0.049)∶(0.423±0.038)]表达明显增强,ET-1[(262.91±17.85)pg/ml∶(263.56±15.87)pg/ml∶(199.48±16.99)pg/ml]水平显著下降(P均0.01)。结论:(1)成功构建了携带有人激肽释放酶基因的重组腺相关病毒,rAAV-KK感染体外培养的人脐静脉内皮细胞;(2)可使细胞分泌BK、NO,以及表达eNOS基因增加,ET-1减少,改善内皮细胞功能。