小鼠卵黄囊间质干细胞向成骨细胞定向分化的实验研究

目的研究卵黄囊间质干细胞的成骨潜能。方法用０．１％的Ⅰ型胶原酶消化获得妊娠第８．５天的小鼠卵黄囊细胞;取贴壁细胞培养,并于接近融合时进行传代培养。对细胞进行形态学观察、碱性磷酸酶（ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ,ＡＫＰ）及Ⅰ、Ⅲ型胶原检测,传代４次后进行成骨诱导,每天观察细胞形态,并于培养７ｄ后测定ＡＫＰ、Ⅰ、Ⅲ型胶原及骨形态发生蛋白－２（ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ－２,ＢＭＰ　－２）的表达,培养８周后进行矿化检测。结果体外可获得纯化的卵黄囊间质干细胞,细胞大小形态均一,呈梭形,ＡＫＰ染色弱阳性,Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性。在体外可诱导卵黄囊间质干细胞定向分化为多形性成骨样细胞,细胞由梭形向星形转化,并形成胞浆突起,相互连接成网状,细胞ＡＫＰ染色阳性,Ⅰ型胶原阳性,Ⅲ型胶原阴性,ＢＭＰ　－２强阳性,８周后矿化区经Ｖｏｎ　Ｋｏｓｓａ　＇ｓ染色呈阳性反应,符合成骨细胞的生物学特征。结论经体外纯化的卵黄囊间质干细胞可诱导向成骨细胞定向分化。     

人卵黄囊间质干细胞多向分化潜能的实验研究

[目的]分离纯化及体外观察人卵黄囊间质干细胞(hYS-MSC)的多向分化潜能.[方法]卵黄囊单细胞悬液经贴壁培养、传代纯化得到hYS-MSC,并从细胞表型及生物学特性等方面对其进行鉴定;采用地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C作成骨诱导剂、β-巯基乙醇或复方丹参注射液作为神经诱导剂、地塞米松、消炎痛、胰岛素作为成脂诱导剂诱导hYS-MSC向成骨细胞、神经细胞及脂肪细胞定向分化.组织化学方法作成骨检测;免疫组化方法检测NSE、NF及GFAP在经神经诱导hYS-MSC中的表达;油红O染色检测中性脂肪.[结果]hYS-MSC易于纯化,在培养过程中保持正常核型,具有较大增殖能力.hYS-MSC CD29、CD44、CD166及CD105表达阳性,CD34、CD45和CD86为阴性;AKP弱阳性.hYS-MSC经成骨诱导AKP强阳性,诱导两周后形成钙盐沉积形成的矿化区.hYS-MSC经神经诱导可见NSE、NF或GFAP阳性细胞,符合神经元及胶质细胞的生物学特征.hYS-MSC经成脂诱导转化为大小不等的园形或椭圆形细胞,胞浆内可见脂滴形成,胞核被挤于细胞的一侧,经油O染色脂滴染橘红色,符合脂肪细胞的生物学特征.[结论]hYS-MSC与成体MSC表型一致,具有较大增殖及多向分化潜能,在体外可以诱导分化为成骨细胞、神经元、胶质细胞及脂肪细胞.     

小鼠骨髓间质干细胞的生物学特点及分化潜能鉴定

目的：建立一种体外分离，培养和鉴定小鼠骨髓间质干细胞的方法，探讨体外培养中间质干细胞的一些生物学特点，为利用MSCs促进创伤修复提供实验基础，方法：分离5－6周龄的小鼠胫骨，股骨，用预冷的IMDM培养基冲洗出骨髓，经密度梯度离心得到骨髓单个核细胞，接种后12－16d形成意志贴壁的成纤维状细胞，体外多向诱导分化鉴定分离的细胞，用传代的细胞进行生长曲线的测定，观察其接种贴壁率，检测细胞周期和超微结构。结果：体外传代培养的MSCs具有分化形成成骨和成脂细胞的能力；MSCs倍增时间约为38h，传代后12h贴壁达90％以上，细胞周期显示有80％细胞处于G0／G1期，并用电镜照片显示其超微结构。结论：在本实验条件下，体外培养的MSCs具有多向分化潜能,体外生长稳定，传代后的细胞适应性强，增殖较快，超微结构和细胞周期表现出较早期细胞特点，可望用于自体创伤促愈。     

小鼠骨髓间质干细胞的体外培养与多向分化潜能的鉴定

【目的】建立小鼠骨髓间质干细胞（MSC）体外培养、纯化、扩增方法,并进行体外定向诱导条件下的多向分化潜能鉴定。【方法】取3～18月雄性C57BL/6J小鼠（共48只）骨髓细胞,贴壁培养后,用免疫磁珠法纯化,观察纯化后的细胞形态,对3、10、20代的MSC进行细胞生长曲线绘制;并检测细胞在不同诱导条件下向成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞的分化能力。【结果】小鼠MSC在体外可以诱导成成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞。MSC连续传代培养达30代以上,细胞的形态、抗原表达无改变,并保持多向分化潜能。【结论】该方法获得的MSC具有高度增殖、多向分化潜能、生物学特性稳定的特点。     

小鼠骨髓间质干细胞的体外培养与多向分化潜能的鉴定

 【目的】 建立小鼠骨髓间质干细胞(MSC)体外培养?纯化?扩增方法,并进行体外定向诱导条件下的多向分化潜能鉴定?【方法】 取3～18月雄性C57BL/6J小鼠(共48只)骨髓细胞,贴壁培养后,用免疫磁珠法纯化,观察纯化后的细胞形态,对3?10?20代的MSC进行细胞生长曲线绘制;并检测细胞在不同诱导条件下向成骨细胞?脂肪细胞?肌肉细胞的分化能力?【结果】 小鼠MSC在体外可以诱导成成骨细胞?脂肪细胞?肌肉细胞?MSC连续传代培养达30代以上,细胞的形态?抗原表达无改变,并保持多向分化潜能?【结论】 该方法获得的MSC具有高度增殖?多向分化潜能?生物学特性稳定的特点?     

脐带间质干细胞多向分化潜能的鉴定

目的:研究脐带间质干细胞的多向分化潜能,为心血管组织工程研究提供一个新的种子细胞来源?方法:采用胶原酶胰酶消化脐带组织,将获得的细胞传代培养,流式细胞仪鉴定细胞表面分子,再以不同方法使其向骨?脂肪?心肌和内皮细胞方向诱导,分别采用Von Kossa?油红O染色和免疫组化对分化的细胞进行鉴定?结果:脐带间质干细胞分别向成骨细胞和成脂肪细胞诱导培养后,Von Kossa染色和油红O染色阳性?在5-氮胞苷诱导后,心肌特异性抗体肌动蛋白α-actin和肌球蛋白myosin免疫组化染色阳性?在VEGF诱导后,细胞形成网格样结构,免疫荧光示CD31?CD34染色阳性?结论:脐带间质干细胞具有分化为骨?脂肪?心肌和内皮细胞的潜能,是非常有前途的心血管组织工程种子细胞来源?     

人脐血间质干细胞一般特性及其多向分化潜能

【目的】观察人脐血间质干细胞增殖能力、细胞表面分子标志及多向分化潜能。【方法】从人脐血中分离出单个核贴壁细胞并进行体外培养。将细胞以单克隆抗体标记后用流式细胞仪进行检测。向培养细胞中加入成骨、成软骨和成脂肪诱导剂，检测其多向分化能力。【结果】脐血间质干细胞原代培养时间为7周。流式细胞分析显示这些细胞CD29、CD13、CD44等表达为阳性，但是它们不表达造血干细胞表面标志物。加入成骨诱导剂会导致细胞碱性磷酸酶的表达。采用微球培养法并加入软骨诱导剂对细胞进行诱导，用阿尔新蓝染色显示有蛋白多糖表达。在加入成脂诱导剂后，会导致细胞形态学改变，且油红O染色为阳性。【结论】通过体外传代培养的方法可以从人脐血单个核贴壁细胞中得到纯化的间质干细胞。脐血有望成为间质干细胞的替代来源。     

骨髓间充质干细胞多向分化的研究

干细胞是体内存在的一类特殊细胞,既能自我更新又能多向分化。骨髓间充质干细胞作为干细胞中的一种,可分化成多种具有特定功能的细胞,并且证实其可分化为多种组织细胞参与组织损伤的再生和修复。     

人脐血间质干细胞一般特性及其多向分化潜能

 【目的】观察人脐血间质干细胞增殖能力、细胞表面分子标志及多向分化潜能。【方法】从人脐血中分离出单个核贴壁细胞并进行体外培养。将细胞以单克隆抗体标记后用流式细胞仪进行检测。向培养细胞中加入成骨、成软骨和成脂肪诱导剂，检测其多向分化能力。【结果】脐血间质干细胞原代培养时间为7周。流式细胞分析显示这些细胞CD29、CD13、CD44等表达为阳性，但是它们不表达造血干细胞表面标志物。加入成骨诱导剂会导致细胞碱性磷酸酶的表达。采用微球培养法并加入软骨诱导剂对细胞进行诱导，用阿尔新蓝染色显示有蛋白多糖表达。在加入成脂诱导剂后，会导致细胞形态学改变，且油红O染色为阳性。【结论】通过体外传代培养的方法可以从人脐血单个核贴壁细胞中得到纯化的间质干细胞。脐血有望成为间质干细胞的替代来源。     

大鼠骨髓间质干细胞多向分化研究

目的:分离和培养大鼠骨髓间质干细胞(BMSCs),并进行多向分化研究。方法:体外分离培养大鼠骨髓单个核细胞,以流式细胞仪检测其表面抗原(CD44、CD90、CD45)的表达。传至第3代后,分别进行成脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞及成肝细胞的诱导。结果:通过流式细胞仪器检测表明培养的细胞为大鼠BMSCs。BMSCs经诱导后分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞及肝细胞。结论:大鼠BMSCs具有多向分化潜能,可作为组织工程的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞的体外培养

目的:体外分离培养骨髓间充质干细胞(MSCs)。方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,并于体外扩增、培养、鉴定。应用免疫组化法和流式细胞术评估实验结果。结果:骨髓间充质干细胞易于培养,扩增明显。结论:骨髓间充质干细胞取材方便易于诱导,作为种子细胞具有良好的应用前景。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养及其向神经元样细胞诱导分化的实验研究

目的：探讨在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的方法。方法：分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞并用β-巯基乙醇诱导分化为神经元样细胞,使用免疫组化方法鉴定其神经元特异性巢蛋白（nestin）的表达,同时应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL法）对神经元样细胞的凋亡情况进行定性检测。结果：β-巯基乙醇诱导后MSCs分化为具有典型的神经元形态的细胞,免疫组化实验显示Nestin呈强阳性反应,表明MSCs在体外诱导分化为神经元样细胞。但该细胞在诱导5小时后开始死亡,形态学观察和TUNEL法均确定该死亡为细胞调亡,提示MSCs诱导为神经元样细胞后出现凋亡现象。结论：大鼠MSCs在体外可定向诱导分化为神经元样细胞,其随后发生的细胞死亡属细胞凋亡。     

胚胎神经上皮干细胞体外克隆增殖与分化的实验研究

目的观察胚胎神经上皮干细胞在体外克隆增殖和诱导分化的情况。方法取孕11 d大鼠的胚胎,经分离获得神经管上皮细胞,在无血清培养基内克隆、增殖、传代。取不同时期的神经球进行神经干细胞的鉴定和诱导分化,并通过免疫组织化学染色鉴定分化的结果。结果胚胎神经上皮干细胞在体外能够克隆、增殖,形成的神经球呈nestin阳性,在分化培养基内可分化为星型胶质细胞和神经元。结论胚胎神经上皮干细胞可在体外进行单细胞克隆和诱导分化。     

POSTEMBRYONIC SUBTOTIPOTENT STEM CELLS DERIVED FROM A VARIETY OF FETAL TISSUES HAVE MULTIPLE DIFFERENTIATION POTENTIAL AND GREATLY CONTRIBUTE TO STEM CELL PLASTICITY

Ｒｅｃｅｎｔｌｙｅｖｉｄｅｎｃｅｓｈａｖｅｂｅｅｎｆｌｏｏｄｉｎｇｉｎｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇｔｈａｔｔｉｓｓｕｅ -ｓｐｅｃｉｆｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃａｎｄｉｆ ｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｌｉｎｅａｇｅｓｏｔｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｔｉｓｓｕｅｓｔｈｅｙｒｅ ｓｉｄｅ .Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｏｆｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｖｉｖｏｃａｎｇｉｖｅｒｉｓｅｔｏｃｅｌｌｓｏｆｂｏｎｅ ,ｃａｒｔｉｌａｇｅ ,ｎｅｒｖｅ ,ｅｔｃ[1～ 6 ] .Ａｄｕｌｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｒｅｓｅａｒｃ…     

骨髓间充质干细胞体外诱导为神经元及其死亡现象的研究

目的:探索大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)在体外定向分化为神经元样细胞的方法并研究其死亡的影响因素.方法:分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞并用2-巯基乙醇诱导分化为神经元样细胞,使用免疫组化方法鉴定其神经元特异性巢蛋白(Nestin)的表达,通过MTT、免疫组化及形态学方法观察丝裂原活化蛋白激酶激酶1/2(mitogen-activated protein kinase kinase 1/2,MEK1/2)阻断剂U0126及缩胆囊肽(cholecystokinin,CCK)对细胞转化及活性的影响.结果:诱导后MSCs分化为具有典型的神经元形态的细胞,免疫组化实验显示Nestin呈强阳性反应,同时免疫组化及MTT方法显示U0126可以显著提高细胞Nestin的表达强度和神经元样细胞的活性,CCK虽可轻度增强神经元样细胞的活性,且CCK可延长已分化神经元的存活时间,但其作用不具统计学意义.结论:大鼠MSCs在体外可定向诱导分化为神经元样细胞,且通过阻断MEK1/2信号通路可以提高其阳性分化率和细胞活性,提示大鼠MSCs诱导分化的神经元样细胞的死亡机制可能涉及MEK1/2信号通路.CCK可能具有对已分化神经元的保护作用.     

骨髓间充质干细胞向肝细胞的体外诱导分化

目的：探索肝细胞生长因子（HGF）、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）、制瘤素M（OSM）诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）为肝细胞的能力及效果。方法：采用红细胞裂解＋贴壁法分离纯化大鼠骨髓MSCs,取第4代MSCs,按如下分组诱导其向肝细胞分化：①MSCs组（空白对照）：不加细胞因子;②H＋a组：20μg/LHGF＋20μg/LaFGF;③H＋O组：20μg/LHGF＋20μg/LOSM;④a＋O组：20μg/LaFGF＋20μg/LOSM;⑤H＋a＋O组：20μg/LHGF＋20μg/LaFGF＋20μg/LOSM;⑥H＋a＋O（分）组：20μg/LHGF（1～9d）＋20μg/LaFGF（9～18d）＋20μg/LOSM（9～21d）。于不同时间点采用RT-PCR检测甲胎蛋白（AFP）和细胞角蛋白18（CK18）的表达,溴甲酚绿法检测其中白蛋白（ALB）的含量,谷氨酸脱氢酶法检测其中尿素（Urea）含量。结果：除对照组外,其余各组在7～14d可见AFP mRNA的表达,21d仅a＋O组表达阳性。除对照组及a＋O组外,其余各组均出现CK18 mRNA、ALB及Urea,在同一时间点,H＋a＋O组表达量高于其余各组（P〈0.05）。结论：HGF联合aFGF/OSM能够成功诱导MSCs分化为肝细胞;aFGF与OSM不能诱导MSCs向较为成熟的肝细胞的分化,但与HGF联合使用能明显提高分化率。     

人骨髓间充质干细胞全细胞钙离子通道电生理实验研究

目的:探讨入骨髓间充质干细胞钙离子通道的电生理学特性.方法:采用梯度离心法和单层贴附培养法分离,纯化,获取人骨髓间充质干细胞,并对所获取的P1～P2代骨髓间充质干细胞的钙离子通道进行全细胞膜片钳的记录与分析.结果:在骨髓间充质干细胞膜上可记录到对Nicardipine敏感的钙离子通道电流,在阻断膜上钠、钾电流后,当钳制为-90mV,膜上钙电流可被连续记录,从-110～-10mV持续钳制用10mV阶跃去极化,在-60mV获得钙离子通道的反转电流.结论:骨髓间充质干细胞膜上用全细胞膜片钳可记录到钙离子通道电流,其电生理学特性符合非兴奋细胞膜上的钙离子通道特点.     

小儿卵黄囊瘤

本院1966年～1989年共收治小儿卵黄囊瘤37例,经血清甲胎蛋白(AFP)测定,光镜确定诊断又通过10例电镜观察,8例AFP免疫组化观察,文献复习,本文支持Teilum提出该瘤来源于卵黄囊瘤背壁的全能性生殖细胞的组织发生观点;1.胚胎卵黄囊有合成AFP能力,本文意儿血清AFP明显升高,免疫酶标可作AFP定位。2.超微结构观察:肿瘤形态与妊娠7周卵黄囊相似,电镜下可见到上皮性及间叶性成份相当于胚外内胚层及胚外中胚层成份。且讨论了该瘤的命名与畸胎瘤关系和免疫组化的应用     

低氧促进人脐带血间充质干细胞向神经细胞分化

目的探讨低氧环境对脐带血间充质干细胞诱导分化成神经细胞的促进作用。方法收集4例志愿者脐带血,分离获得间充干细胞,体外扩增培养。研究分为常氧组、常氧诱导组、低氧组、低氧诱导组。研究低氧诱导培养的脐带血间充质干细胞组与对照组比较在细胞生物学特征、诱导分化能力等方面的差异。结果在5%含氧量条件下细胞的增生能力不同程度的提高;在诱导成神经细胞的过程中,低氧诱导的间充质干细胞向神经细胞的分化能力增强。神经细胞表面标记Nestin、NF-M表达阳性。与常氧诱导的脐带血间充质干细胞组比具有显著性差异（P〈0.05）。结论低氧条件可以提高脐带血间充质干细胞向神经细胞分化的产率。     

兔骨髓基质干细胞体外培养的生物学特性

目的：分离培养兔骨髓基质干细胞并探讨其体外生物学特性。方法：通过梯度密度离心法分离兔骨髓基质干细胞，体外培养、扩增，观察细胞的大体形态和超微结构；通过绘制细胞生长曲线、MTT实验来研究细胞的增殖能力争代谢活性。结果：兔骨髓基质干细胞呈梭形。胞质内有丰富的粗面内质网和线粒体，具有很强的增殖能力和代谢活性。结论：本实验方法取材方便，能较容易地获得大量的兔骨髓基质干细胞。