小鼠noggin基因的重组腺病毒构建与鉴定

目的：构建小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法：采用基因工程技术。经过2次亚克隆将 noggin 基因片段克隆至穿梭质粒 AdTrack-CMV 上,利用 pAdEasy-1系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染 293T 细胞包装、扩增。采用 PCR 方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白 GFP 报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果：酶切鉴定及 PCR 结果证明 noggin 基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达6．3×10~(10)pfu/ml。结论：应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体。     

BDNF重组腺病毒的构建及在大鼠骨髓间质干细胞的表达

目的:利用大肠杆菌细菌内同源重组构建带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的脑源性神经营养因子前体(proBDNF)和脑源性神经营养因子(BDNF)重组腺病毒并在大鼠骨髓间质干细胞(rMSC)高效表达。方法:采用两步亚克隆的方法将proBDNF和BDNF构建入带有EGFP表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移载体pAdTrack-proBDNF和pAdTrack-BDNF,采用化学转化法在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒载体pAd-proBDNF和pAd-BDNF;转染293细胞,包装成重组病毒颗粒;将重组病毒上清感染rMSC,用荧光显微镜下观察和Western-blotting鉴定重组病毒在rMSC表达;用Ad-proBDNF和Ad-BDNF感染的rMSC在体外诱导向神经样细胞分化;用Ad-proBDNF和Ad-BDNF的感染的rMSC接种于裸鼠肌肉内,两周后荧光显微镜下直接观察。结果:成功地构建了proBDNF和BDNF重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒,重组病毒能在体外培养的rMSC高效表达并不影响其分化潜能,体内移植实验表明Ad-proBDNF和Ad-BDNF感染的rMSC能在体内表达。结论:重组腺病毒具有较高的介导proBDNF和BDNF基因表达于rMSC的效率,带有报告基因EGFP的Ad-proBDNF和Ad-BDNF感染的rMSC可以用于体内移植实验。     

人EPO基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的:制备表达人促红细胞生成素基因(hEPO)的重组腺病毒。方法:将hEPO基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带hEPO基因的重组腺病毒载体。获得的重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞,包装、扩增出重组腺病毒,氯化铯梯度离心法进行纯化,PCR和电镜负染鉴定重组腺病毒,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并检测重组腺病毒的滴度。继而用纯化的重组腺病毒感染HeLa细胞,测定转染效率,以Western blot检测hEPO蛋白的表达。结果:成功构建了携带hEPO基因的重组腺病毒载体pAd-hEPO,PCR、透射电镜和绿色荧光鉴定证实病毒包装成功,并且具有感染力,病毒的滴度可达1.8×1010pfu/mL。Western blot检测表明RAd-hEPO感染的HeLa细胞中hEPO基因能够有效表达。结论:制备的RAd-hEPO可成功表达hEPO基因,为后续开展RAd-hEPO治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。     

HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定

目的 构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack-CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5α;筛选出重组质粒pAdTrack-CMV- HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pAd-HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad-HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT-PCR、Western 印迹鉴定外源基因HAX1的表达.BrdU检测感染了Ad-HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况.结果 pAdTrack-CMV-HAX1重组质粒构建成功.pAdTrack-CMV-HAX1 质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符.构建好的Ad-HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达.HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高.结论 成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖.     

人胸腺基质淋巴生成素基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的: 构建含人胸腺基质淋巴生成素基因(TSLP)的重组腺病毒载体并表达, 以研究其免疫学功能。方法: 将由人胚肺细胞扩增得到的TSLP基因, 克隆于真核表达载体pcDNA3. 1中, 再亚克隆至穿梭质粒pShuttle中, 并与腺病毒骨架载体pAdEasy -1共同转化大肠杆菌。以获得的重组质粒线性化后转染HEK293细胞, 并包装成病毒颗粒。采用PCR法对重组腺病毒基因进行鉴定, 并以Westernblot检测TSLP蛋白的表达。结果: 通过细菌内同源重组, 成功构建带有人胸腺基质淋巴生成素基因的重组腺病毒质粒, 转染 293细胞后, 包装的重组病毒经PCR检测表明, 基因组含有目的基因,病毒的滴度可达 1×1011pfu/L。Westernblot证实, 感染的肿瘤细胞中有相应基因产物的表达。结论: 通过菌内重组可高效制备带有特定基因的重组病毒。所制备的Ad -TSLP可成功表达相应基因产物, 为进一步研究这一新型细胞因子的功能奠定了基础。     

重组人肝细胞生长因子-NK4腺病毒的制备及初步鉴定

目的 制备表达人肝细胞生长因子(HGF)-NK4蛋白的复制缺陷型重组腺病毒.方法 酶切pcDNA3-hNK4质粒获得NK4基因编码区序列并克隆至穿梭载体构建重组pAdTrack-CMV-NK4载体,线性化后与pAdEasy-1共转化BJ5183,通过同源重组得到重组pAd-NK4病毒载体.将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒,用病毒悬液感染人肝癌细胞株HepG2.RT-PCR法检测感染肿瘤细胞中NK4 mRNA表达.结果 酶切鉴定得到阳性pAd-NK4重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装.在转染2d后能观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达.制备的Ad- NK4在体外能有效感染HepG2细胞并获得NK4基因高水平表达.结论 成功构建了NK4基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒,为进一步研究NK4基因的功能及应用NK4进行基因治疗提供实验依据.     

大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体及在乳鼠心肌细胞中的表达

背景：过氧化物酶体增生因子活化受体α是调节心脏脂肪酸氧化的重要核转录因子,利用基因工程技术构建其重组腺病毒载体对研究心脏能量代谢障碍机制具有重要意义。 目的：构建大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体,评价其在原代培养的乳鼠心肌细胞中的表达效率。 方法：采用RT-PCR法自SD大鼠肝脏扩增过氧化物酶体增生因子活化受体α基因,将其克隆至带有增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒载体pAd-Track-CMV。线性化重组穿梭质粒载体并转化入含有腺病毒骨架质粒pAd-Easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。用脂质体将线性化的重组腺病毒载体质粒转染于人胚肾293细胞以包装、扩增,纯化病毒后计算滴度。用纯化的重组腺病毒转染心肌细胞,荧光显微镜观察转染效率;荧光定量PCR、免疫印迹法检测细胞过氧化物酶体增生因子活化受体α mRNA、蛋白表达。 结果与结论：成功构建携带大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因的重组腺病毒载体,病毒滴度为3.5×10¹¹ pfu/L。重组腺病毒转染心肌细胞的效率达90%以上,被转染细胞目的基因mRNA、蛋白表达显著增高。该载体的成功构建为研究过氧化物酶体增生因子活化受体α基因在心肌能量代谢障碍中的作用奠定基础。     

小鼠T-bet基因重组腺病毒载体的构建及制备

目的 构建小鼠T-bet基因重组腺病毒.方法 采用RT-PCR方法从小鼠脾脏活化的T淋巴细胞中扩增的cDNA序列,并将其克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV中,形成转移质粒,酶切线性化后,与超螺旋腺病毒骨架质粒pAdEasy-l以电穿孔的方法共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组,经酶切鉴定筛选正确重组子,以线性化重组质粒转染293细胞,制备重组腺病毒小鼠T-bet重组腺病毒AdT-bet,最后以PCR及Western blot方法鉴定T-bet的表达.结果 感受态大肠杆菌BJ5183细菌内同源重组24 h后共获得35%阳性重组质粒克隆,经酶切获得一个30 kb的大片段和一个4.5 kb的小片断.该质粒转染293细胞后获得的重组腺病毒可高效表达T-bet,纯化后病毒滴度为2.0×1011 PFU/mL.结论 应用细菌内同源重组法成功快捷构建了含小鼠T-bet基因的重组腺病毒,所获得的AdT-bet可进一步应用支气管哮喘等疾病的基因治疗研究.     

人KLK1和EGFP双顺反子重组腺病毒构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的：构建携EGFP为报告基因和人组织激肽释放酶1(hKLK1)基因双顺反子的重组腺病毒（Ad-hKLK1-IRES-EGFP）,并观察在自发性高血压大鼠（SHR）血管平滑肌细胞（VSMCs）中的表达变化。方法:通过双酶切质粒pBluescritII KS-hKLK1，将hKLK1基因定向克隆至带有IRES-EGFP的腺病毒穿梭质粒pDC316中，构建成重组穿梭质粒 ，将其与腺病毒骨架质粒BHGloxE1，3Cre共转染293A细胞，经包装并获得重组腺病毒，用PCR、酶切及测序方法对其进行鉴定，测定病毒滴度；用重组腺病毒感染VSMCs，用荧光显微镜下观察到的绿色荧光来测定感染率，用RT－PCR和Western blotting法测定hKLK1基因在VSMCs中的表达。结果:PCR、酶切和测序表明携EGFP的重组穿梭质粒pDC316-hKLK1-IRES-EGFP构建正确，并与骨架质粒在293A细胞中成功包装出重组腺病毒Ad-hKLK1-IRES-EGFP，其滴度为4.5×10¹¹/L。重组腺病毒感染VSMCs后，在荧光显微镜下观察到明亮绿色荧光蛋白表达，感染率高达90％以上，可检测到hKLK1基因的mRNA及蛋白表达，并与感染时间(1 d-7 d) 有显著依赖关系，峰值感染复数为100 MOI。结论:成功构建并包装了携EGFP和hKLK1基因的双顺反子重组腺病毒载体系统Ad-hKLK1-IRES-EGFP；感染VSMCs可检测到基因hKLK1和EGFP的独立共同高表达，该系统为一直观、安全、高效的基因转移系统。     

人LIGHT基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的 克隆人LIGHT基因，构建其重组腺病毒载体，以研究LIGHT过表达与腺病毒感染对细胞生长的影响。方法 用RT-PCR法从人外周血单个核细胞（PBMC）中克隆人的LIGHT全长基因。将LIGHT cDNA克隆到穿棱载体pAdTrack-CMV-LIGHT重组质粒中，经酶切线性化后，将重组质粒pAdTrack-CMV-LIGHT和骨架质粒pAdEasy-1，以电穿孔法共转染大肠杆菌BJ5183，获得重组腺病毒质粒。最后，将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒，用荧光显微镜、PCR及Western blot分析LIGHT基因的表达。结果 用RT－PCR法从人的PBMC中，扩增出723bp的cDNA，测序证实为人LIGHT基因。荧光显微镜、PCR及Western blot证实，LIGHT重组腺病毒可感染293细胞，并在293细胞内进行有效的复制。结论 成功地克隆了人LIGHT基因，并构建了其重组腺病毒载体，为进一步研究LIGHT基因的功能提供了条件。     

Transductional targeting with recombinant adenovirus vectors

Replication-deficient adenoviruses are considered as gene delivery vectors for the genetic treatment of a variety of diseases. The ability of such vectors to mediate efficient expression of therapeutic genes in a broad spectrum of dividing and non-dividing cell types constitutes an advantage over alternative gene transfer vectors. However, this broad tissue tropism may also turn disadvantageous when genes encoding potentially harmful proteins (e.g. cytokines, toxic proteins) are expressed in surrounding normal tissues. Therefore, specific restrictions of the viral tropism would represent a significant technological advance towards safer and more efficient gene delivery vectors, in particular for cancer gene therapy applications. In this review, we summarize various strategies used to selectively modify the natural tropism of recombinant adenoviruses. The advantages, limitations and potential impact on gene therapy operations of such modified vectors are discussed.     

携带野生型PTEN基因的腺病毒载体的构建

目的 构建携带野生型PFEN(Phosphatase and tensinhomolog deleted on chromosome ten)基因的腺病毒载体,为研究PFEN功能和作用机制提供手段。方法将野生型PFEN基因克隆入含有绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)基因的pAdTrack-CMV质粒,在含有pAdEasy-1病毒骨架的BJ5183大肠杆菌内进行同源重组;重组子通过脂质体介导转染AD293细胞,并在AD293细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒;通过反复感染扩增病毒以达到感染靶细胞的适当滴度,通过GFP表达来监控腺病毒扩增;Western blot检测靶细胞内PFEN蛋白的表达。结果感染腺病毒载体的AD293细胞表达GFP,随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE),经过3轮扩增,病毒达到合适的滴度。受腺病毒感染心肌细胞内PTEN蛋白表达明显增高。结论成功构建了携带PFEN基因的腺病毒载体。     

壳蛋白免疫法测定重组腺病毒滴度的方法学评价

目的：介绍壳蛋白免疫法（hexon immunoassay），并同传统细胞病变（CPE）法比较，检测其可靠性和可重复性。 方法： 3种重组腺病毒（Ad-lacz、Ad-hEndo和dl1520）扩增、提纯后，用壳蛋白免疫法、CPE法测定病毒滴度及A260值法测定病毒总颗粒数。 结果： 壳蛋白免疫法和CPE法同时测定3种同批次病毒滴度，结果一致，P>0.05；对不同批次3种腺病毒滴度测定，结果仍相似，平均差值±s=0.1527±0.3270，P>0.05，两法有很好的相关性，r＝0.913；壳蛋白免疫法对同批dl1520测定19次，变异系数仅为1.42%。 结论： 壳蛋白免疫法是测定腺病毒滴度的有效方法，系统误差小、重复性好、结果客观可靠，可避免CPE法中由于细胞退化和工作人员主观判断造成的系统误差，比CPE法更精确、更省时。     

T-cell immunity generated by recombinant adenovirus vaccines

Recombinant adenovirus vaccines show great promise for generating protective immunity against infectious agents and tumors. Our studies have identified several interesting biological features of the adenovirus vector that influence the T-cell response. Notably, we have demonstrated that following immunization with adenovirus vaccines, the transgene antigen remains available to the system for a longer period than would be expected, resulting in a T-cell population with a sustained effector phenotype. The implications of these observations with regards to the utility of adenovirus vaccines are discussed.     

表达miR-10α的重组腺病毒的构建与鉴定

目的构建表达miR．10a的重组腺病毒（adenovirus,Ad）载体。方法用红色荧光蛋白mCherry基因替换穿梭质粒pDC316-EGFP—U6的增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）报告基因。利用表达siRNA的策略,合成编码miR-10a的长链DNA序列,双链退火后克隆至pDC316,mCherry—U6获得pDC316-mCherry—U6-miR-10α。pDC316-mCherry-U6-miR-10α与骨架质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,包装成复制缺陷型重组腺病毒Ad-miR-10α空斑形成实验纯化、扩增、滴定重组腺病毒。Ad-miR-10α感染HeLa细胞后在荧光显微镜下观察mCherry表达,用RT—qPCR检测miR-10α表达。结果构建的pDC316-mCherry—U6-miR-10α序列正确,荧光显微镜下可见mCherry的表达,重组腺病毒Ad—miR-10α滴度为1．8×10^7pfu／mL,感染HeLa细胞后miR-10α表达较mock高40倍。结论成功构建了表达miR-10α的首组腺病毒．siRNA表达策略可用于miRNA的人工表达。     

人sCD40L-Ig重组腺病毒载体的构建、表达及功能检测

目的:构建含有分泌型人胞外区CD40L融合蛋白(sCD40L-Ig)基因的重组腺病毒载体,确定其表达和功能学意义。方法:通过PCR获得人源IgGFc和sCD40L基因并予以连接,将其插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,构建重组质粒pAdTrack-sCD40L-Ig。将其与pAdEasy-1-BJ5183菌行同源重组后,用293细胞包装,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)和Western blot分析等方法鉴定重组腺病毒,并进行双向混合淋巴细胞反应(MLR)以确定其功能。结果:所构建的sCD40L-Ig基因的重组腺病毒,经酶切和PCR鉴定正确。原代腺病毒的滴度达到2.69×1011pfu/L,并有相对分子质量(Mr)为61×103的目的蛋白表达。MLR显示,重组腺病毒对淋巴细胞的增殖有抑制作用。结论:成功地构建了含有sCD40L-Ig基因的重组腺病毒,并对MLR有抑制作用。     

小鼠GITRL基因腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建重组腺病毒pAdEasy-GFP-GITRL,并测定病毒滴度。方法:从PIRES-GITRL载体上用BglⅡ和SalⅠ双酶切,回收目的基因GITRL,插入同样用BglⅡ和SalⅠ双酶切的穿梭质粒pAdtrack-CMV中,将线性化穿梭质粒骨架质粒pAdEasy-1共转染BJ5183菌,鉴定正确后,将重组腺病毒载体pAdEasy-GFP-GITRL转染HEK293细胞,以包装出完整腺病毒。TCID50法测定重组腺病毒滴度,Western blot法检测GITRL蛋白表达。结果:成功构建小鼠GITRL基因的重组腺病毒载体(pAdEasy-GFP-GITRL),经包装后获得高滴度表达GITRL基因的重组腺病毒,病毒滴度为2.0×109pfu/mL。Western blot结果显示重组病毒载体能表达GITRL蛋白。结论:重组腺病毒表达载体(pAdEasy-GFP-GITRL)的成功构建及重组腺病毒的获得为GITRL基因干预治疗奠定了基础。     

Construction and characterization of an adenovirus type 5/adenovirus type 12 recombinant virus

We have constructed an adenovirus type 5 (Ad5) recombinant virus in which the early region 1b (E1b) of the nononcogenic Ad5 is replaced by the E1b region of the highly oncogenic Ad12. Analysis of cells lytically infected with the recombinant virus showed that both the Ad5 E1a genes and the Ad12 E1b genes are faithfully expressed. The recombinant virus replicates efficiently in human embryonic kidney cells and in HeLa cells, indicating that the Ad12 E1b region can fully replace the Ad5 E1b region in lytic infection. Inoculation of the Ad5/Ad12 hybrid virus into newborn hamsters did not result in development of tumors. This shows that the E1b region of Ad12, previously shown to be responsible for the high oncogenic potential of Ad12-transformed cells in nude mice is not capable of converting the nononcogenic Ad5 into an oncogenic virus.     

Spatial patterning of gene expression using surface-immobilized recombinant adenovirus

Spatially patterned gene expression drives tissue organization and is a critical determinant of tissue function. Approaches in functional tissue engineering will require not only the spatial organization of cells but also control of their gene expression patterns. We report a method to generate patterns of gene expression within a monolayer of cells by using surface-immobilized recombinant adenovirus. This study represents a new approach to engineering tissues that relies on controlling spatial patterns of gene expression, and can be used independently or in combination with positioning of different cell types. This technique may have broad applications in biotechnology including tissue engineering and targeted gene delivery.