兔角膜碱烧伤的共焦显微镜及病理观察

目的采用角膜共焦显微镜活体动态观察兔角膜碱烧伤的病理改变,组织化学方法观察角膜组织病理学变化。方法NaOH造成兔角膜碱烧伤模型,烧伤后4d、20d、36d行角膜共焦显微镜检查及组织病理学检查。结果碱烧伤后4d,角膜即有炎性细胞浸润,出现少许CD4+、CD8+细胞;碱烧伤后20d,角膜基质中炎性细胞浸润明显,CD4+、CD8+细胞增多,瘢痕及新生血管形成;碱烧伤后36d,炎性细胞浸润减少,CD4+、CD8+细胞消失,仍可见瘢痕及新生血管。结论角膜共焦显微镜活体观察碱烧伤后角膜的创伤修复,反映角膜的病理状态,有助于指导临床治疗。     

复合自体脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质移植治疗兔角膜碱烧伤

目的:研究复合脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质对碱烧伤角膜的治疗效果。方法:制备晾干的脱细胞猪角膜基质,取第3代体外培养的兔自体脂肪干细胞,体外种植到脱细胞猪角膜基质上,培养3d后用于板层角膜移植。结果:板层角膜移植2mo后,术眼角膜基本恢复透明,未发生排斥反应,新生血管较少,3mo后新生血管基本消退。结论:复合自体脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质对兔碱烧伤角膜具有良好的修复能力。     

活体共聚焦显微镜对角膜移植后排斥反应的观察

目的 应用活体共聚焦显微镜(CMTF)观察角膜移植术后排斥反应。 方法 对穿透角膜移植患者术后定期行CMTF检查。 结果 通过连续共聚焦扫描及焦点分析,得到角膜X、Y轴和Z轴多层精确的、可重复的图像及时间记录四维显示。角膜移植术后角膜可出现多种反应,如角膜上皮反应、基质反应。角膜移植排斥反应主要表现为移植片周围大量圆形细胞浸润、大的异常上皮细胞、基质水肿、基质细胞变为成纤维细胞及细胞排列紊乱。 结论 应用CMTF可直接观测活体角膜各层细胞形态、结构、病理转归及角膜移植免疫排斥的早期反应,以及反应过程的发展,为较早地诊断角膜移植排斥反应提供依据。这是裂隙灯检查所不及的。     

人体角膜移植内皮排斥反应的共焦显微镜研究

目的：应用共焦显微镜探讨活体角膜内皮排斥反应的早期形态学特征和变化。方法：19例(19只眼)角膜移植术后发生内皮排斥反应的人群根据角膜内皮排斥反应轻重的不同分为轻、中、重三组。应用共焦显微镜(Confoscan2．0)对角膜植片进行检查，并分析其相关因素。结果：活体角膜内皮排斥反应特有的共焦显微镜改变主要包括：①早期发现在KP及其附近的内皮细胞面有少量的免疫细胞附着，紧靠KP处的角膜基质细胞出现轻度水肿，细胞排列较混乱，胞浆中出现少量空泡状暗区。②中期发现在内皮细胞表面可见较多的免疫细胞聚集并被完全激活，基质细胞明显水肿，细胞核不清楚，基质中有免疫细胞进入；可见由高反光的免疫细胞和不明成份的组织碎片混合组成内皮排斥线。③在晚期排斥的患者中可见大量“激活”的免疫细胞在角膜内皮细胞面聚集，内皮细胞几乎完全破坏；基质细胞明显水肿，部分被“激活”且伴有大量免疫细胞聚集。结论：①内皮排斥反应的早期能够发现角膜内皮面有免疫细胞沉积；②角膜内皮面的免疫细胞沉积与角膜内皮排斥反应的轻重成正相关；③角膜内皮排斥反应实际上是一个混合排斥反应的过程；④共焦显微镜对角膜内皮排斥反应具有实时、无创、敏感、准确以及可莺蒽、可比较、可活体观察等临床价值。     

激光扫描共焦显微镜观察穿透角膜移植术后角膜的形态学特征

目的研究活体穿透角膜移植术后各层角膜组织的激光扫描共焦显微镜(Laser Scan-ning Confocal Microscope,LSCM)的形态学特征。方法应用海德堡视网膜激光断层扫描仪Ⅱ/Rostock角膜模块(HRTⅡ)对20例20眼穿透角膜移植术后40天～2年的患者进行检查,记录并分析其各层角膜图像。结果穿透角膜移植术后早期角膜上皮细胞排列欠规则;Bowman膜和Descemet膜在激光共焦显微镜下无细胞结构;所有患者浅基质层细胞均较深基质层密集;稳定角膜植片其内皮细胞排列紧密,形态为均一六边形结构;所有患者均未发现上皮下神经丛及基质神经;术后植片排斥者有其特殊形态学表现。结论激光扫描共焦显微镜可活体检查穿透角膜移植术后角膜各层组织结构和细胞的病理改变,为临床诊断及用药提供有价值的客观依据,并在跟踪随访方面具有重大意义。     

角膜移植排斥反应的共焦显微镜研究

目的：探讨角膜移植术后免疫排斥反应的共焦显微镜特征,在细胞水平为该症的基础和临床研究提供活体、三维与实时的科学依据。方法：应用NIDEK公司提供的共焦显微镜,对11例（11眼）发生角膜移植免疫排斥反应的患眼角膜在不同时期行三维实时扫描成像,并用计算机作定性与定量分析。结果：角膜移植免疫排斥反应的共焦显微镜呈现如下特征：①上皮排斥线是由较小的炎症细胞与受损的较大的上皮细胞混合形成的结构;②上皮下浸润表现为体积较小、折射率高的炎症细胞的聚集,上皮下神经纤维水肿呈串珠状改变,浅基层细胞水肿;③基质排斥反应可见角膜基质细胞水肿,胞体变形,数量减少,并见炎症细胞浸润,后者于缝线周围较明显;④内皮排斥线则是由较小的明亮的炎症细胞与核固缩胞体形态异常的内皮细胞混合而成,随着内皮排斥线的发展,内皮 细胞数量减少,体积变大呈伪足状;⑤以上排斥反应均见新生血管长入植片,并与血管壁可见游动的炎症细胞。结论：应用共焦显微镜可在活体上为角膜移植术后免疫排斥反应提供早期诊断与鉴别诊断的科学依据,并在细胞水平对排斥反应的触发与转归进行活体的动态观察。     

RANTES与SPARC基因在大鼠角膜移植排斥反应中的表达

目的：动态检测激活正常T细胞表达和分泌的调节物（regulated on activation nomal T expressed and secreted,RANTES)和酸性富含胱氨酸分泌型蛋白（secreted protein,acidic and rich in cysteine,SPARC)在异体角膜移植排斥反应中的表达，为角膜移植排斥反应的早期诊断提供依据。方法：首先建立大鼠异体角膜移植动物模型，并设同体角膜移植，角膜碱烧伤模型为对照组，在不同时间段提取各组角膜上皮细胞总RNA。分别进行逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增，电泳，半定量检测RANTES和SPARCmRNA的表达水平，然后酶切验证表达结果。结果：（1）正常角膜上皮细胞未见RANTES基因表达，可见SPARC基因的低表达；（2）异体角膜移植3天后各时间点均见排斥眼RANTES基因的高表达，同体移植及碱烧伤后未见表达。（3）SPARC在角膜移植及碱烧伤后均见较高水平表达，且与正常细胞表达有显著差异；（4）用RT－PCR方法检测基因变化诊断排斥反应早于裂隙灯检查结果。结论：大鼠角膜上皮RANTESmRNA表达上调与角膜移植排斥反应特异性相关。同时，SPARC在角膜移植排斥反应，碱烧伤和创伤过程中具有高水平表达，依时间顺序，RANTES和SPARC早期高表达早于临床观察的排斥反应至少一周，由此，选择性对细胞因子mRNA扩增，是早期诊断角膜移植排斥反应的有效方法。     

共焦显微镜在角膜病的应用

共焦显微镜（ｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）是一种在四维（Ｘ，Ｙ，Ｚ轴和实时）观察活体角膜细胞水平，且无创伤的显微镜，其特点是无论在透明或混浊的角膜均能在三维空间和实时条件下显示角膜细胞结构和病理改变，尤其对角膜棘阿米巴，病毒感染等能在病因学上的作出诊断，对角膜移植术后的排斥反应能早期发现，对角膜的各种创伤愈合亦能观察到细胞，神经的动态改变，共焦显微镜被认为是继角膜内皮镜后，更具意义的新型角     

共焦显微镜在角膜病的应用

共焦显微镜（Confocalmicroscopy）是一种在四维（X、Y、Z轴和实时）观察活体角膜细胞水平，且无创伤的显微镜。其特点是无论在透明或混浊的角膜均能在三维空间和实时条件下显示角膜细胞结构和病理改变，尤其对角膜棘阿米巴、病毒感染等能在病因学上作出诊断，对角膜移植术后的排斥反应能早期发现，对角膜的各种创伤愈合亦能观察到细胞、神经的动态改变。共焦显微镜被认为是继角膜内皮镜后，更具意义的新型角膜病研究工具，具有广泛的应用前景。     

生物工程角膜移植术后排斥反应的临床及免疫病理观察:附5例报告

目的：对生物工程角膜移植术后发生免疫排斥反应患者进行激光共焦显微镜观察和免疫病理研究,初步探究生物工程角膜移植排斥反应的发生机制。

方法：回顾性病例研究。纳入2018-09/2020-12我院收治的感染性角膜炎行生物工程角膜移植术后发生免疫排斥患者5例5眼。裂隙灯检查角膜透明度、角膜新生血管; 激光共焦显微镜对角膜进行动态观察,记录免疫排斥反应后角膜上皮下朗格罕氏细胞和基质炎症细胞密度,并以对侧眼作为对照进行统计分析。行同种异体角膜移植时取下生物工程角膜,免疫组织化学染色后对CD4⁺细胞和CD8⁺细胞及炎症细胞的浸润和分布进行观察。

结果：激光共焦显微镜显示,术眼角膜上皮下可见大量活化郎格罕氏细胞,其活化比例与对侧眼比较有差异(χ²=38.29,P<0.001)。基质层大量炎症细胞,与对侧眼比较具有差异(t=32.5,P<0.05)。对生物工程角膜组织进行免疫组织化学染色和HE染色,角膜基质层均可见CD4⁺细胞和CD8⁺细胞,仅1眼角膜基质层可见大量嗜酸性粒细胞。

结论：生物工程角膜移植术后免疫排斥反应经免疫病理证实以T细胞介导的细胞免疫在发病机制中具有重要作用,对异种抗原的超敏反应可能参与其中。     

加强我国角膜移植免疫研究

通过角膜移植更换混浊或病变的角膜,是帮助角膜盲患者恢复视力的有效措施,但植片排斥反应的发生是导致角膜移植手术远期失败的主要原因,如何减少因植片排斥引起的再次致盲是角膜病研究的重点。本文分析了我国角膜移植免疫研究存在的问题：（1）没有建立标准的抗排斥治疗方案;（2）缺乏安全、有效的抗排斥反应治疗药物;（3）忽视围手术期的并发症处理;（4）角膜移植免疫基础研究薄弱。针对上述问题产生的原因,提出了相应的处理措施和建议,以增强角膜病专科医生对角膜移植免疫临床和基础研究的重视,促进我国角膜盲的防治工作取得更大的发展。     

诱导供体特异性前房相关免疫偏离对高危角膜移植排斥反应的影响

目的:探讨诱导供体特异性的前房相关免疫偏离(anterior chamber-associated immune deviation,ACAID)对高危角膜移植排斥反应的影响。方法:采用新西兰白兔眼角膜建立碱烧伤眼模型,实验动物随机分为4组,A:正常角膜常规角膜移植组(正常对照组);B:碱烧伤常规角膜移植组(碱烧伤对照组);C:正常角膜诱导ACAID的角膜移植组(正常诱导组)。D:碱烧伤后诱导ACAID的角膜移植组(碱烧伤诱导组)。B,D组进行左眼碱烧伤,烧伤后1mo进行角膜移植。C,D组在角膜移植前2wk于右眼前房注入可溶性抗原以预先诱导供体特异性ACAID。A,B组右眼前房注等量平衡盐溶液。术后记录植片存活时间;对角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)生长情况进行评分;记录移植排斥指数(rejection index,RI);角膜固定、包埋后制作切片行HE染色。结果:A、C组角膜植片长期存活,碱烧伤对照组植片平均存活25.13±0.64d,碱烧伤诱导组角膜植片平均存活时间为38.25±1.28d。与碱烧伤对照组相比,碱烧伤诱导ACAID组角膜植片平均存活时间显著延长,两组植片存活时间的差异具有统计学意义(P=0.00)。结论:诱导供体特异性ACAID可以延长碱烧伤高危眼角膜植片的存活时间。     

DCD角膜移植术后角膜内皮细胞与排斥反应的相关性分析

目的：探讨心脏死亡供体器官捐献(donation after cardiac death,DCD)来源角膜植片术后排斥反应与角膜内皮细胞的相关性。

方法：用角膜内皮显微镜对心脏死亡供体来源角膜植片行穿透性角膜移植术后发生排斥反应的28例28眼角膜植片分别于术后<1、2～3、4～6、7～12mo行角膜内皮镜检查。

结果： 28例患者术后<1、2～3、4～6、7～12mo的角膜内皮细胞变异系数分别为38.23%、49.56%、57.18%、65.04%; 角膜内皮细胞密度分别为2071.15±311.47、1771.33±348.18、1626.59±353.92、1553.14±307.31个/mm²; 角膜内皮细胞变异系数与排斥反应呈正相关关系(r=0.95,P<0.05); 术后角膜内皮细胞密度与排斥反应呈负相关关系(r=-0.93,P<0.05)。

结论：DCD穿透性角膜移植术后发生排斥反应时有角膜内皮细胞变异系数逐步增高,角膜内皮细胞密度逐步降低的趋势; 角膜内皮细胞变异系数、角膜内皮细胞密度可作为早期检测术后排斥反应的指标。     

Graft epithelial mapping following penetrating keratoplasty using anterior segment optical coherence tomography

AIM: To evaluate the changes in corneal epithelial thickness in corneal grafts following penetrating keratoplasty (PK) using anterior segment optical coherence tomography (AS-OCT), and to determine the role of epithelial thickness mapping in the early detection of graft rejection. METHODS: This prospective comparative observational study included 20 patients (20 eyes) who underwent PK as study group and 16 patients (16 eyes) as control group. Corneal epithelial thickness mapping using AS-OCT was performed at 2wk, 1 and 3mo postoperatively. The parameters of epithelial thickness and distribution at the 3mo were compared to 16 patients (16 eyes) with allograft rejection following PK. RESULTS: There was significant decline in the superior, inferior, maximum, and minimum epithelial thickness values of the study group at 1mo compared to 2wk (P=0.0004, 0.0001, 0.0001, 0.04 respectively) with no significant differences at 3mo compared to 1mo (P=0.4, 0.1, 0.8) respectively. Percentage of reduction in epithelial thickness was significantly higher than that of stromal thickness at 1mo compared to 2wk (P=0.04). The epithelial thickness maps showed a similar pattern of epithelial thickness distribution in the study group and in the rejection group showing considerable corneal edema. However, the allograft rejection group showed irregular pattern of epithelial thickness distribution in patients showing relatively higher central corneal thickness (CCT) as measured by pachymetry map. CONCLUSION: Quantitative assessment of graft epithelial remodeling following PK shows early changes that contribute to significant corneal graft thickness changes. Changes in corneal epithelial thickness and pattern of distribution could be used as an indicator for corneal graft rejection.     

角膜移植与B7分子

随着角膜移植手术技巧的改进,移植成功率明显提高,移植术后的免疫排斥反应越来越成为移植失败的主要原因。角膜移植免疫排斥反应是一个复杂的反应过程,受多种因素的调节。致敏T淋巴细胞在角膜移植排斥反应中起着重要的作用,是角膜排斥过程中的主要效应细胞。而T淋巴细胞的激活需要两个信号刺激,即除了通过APC递呈MHC处理过的抗原给抗原特异性T细胞提供第1信号外,还需协同刺激分子作为辅助信号的协同作用,才能使T细胞产生正常的免疫应答。如果缺少协同刺激分子的第2信号,将会导致调节性T细胞的无反应性或特异性免疫耐受。随着研究的深入,协同刺激信号已逐渐成为角膜移植免疫学研究的热点领域。B7分子作为重要的协同刺激分子,在角膜移植免疫排斥反应的发生及其治疗中起着重要作用。     

Lymphocyte infiltration and activation in iris-ciliary body and anterior chamber of mice in corneal allograft rejection

AIM: To investigate the infiltration and activation of lymphocyte in iris-ciliary body and anterior chamber after allogenic penetrating keratoplasty (PK), for further revealing the role of iris-ciliary body in corneal allograft immune rejection. METHODS: In the mice models of PK, BALB/C mice received orthotopic isografts (n =35) or C57BL/6 donor allografts (n =25). Grafts were examined daily for 3 weeks by slit-lamp microscopy and scored for opacity. The infiltration of CD4+ T lymphocyte in iris-ciliary body and anterior chamber was examined by immunohistology and the mRNA of CD80 and CD86 in both cornea graft and iris-ciliary body by RT-PCR was analyzed in allograft recipient at days 3, 6, 10 and the day when graft rejection occurred. Isograft recipients were examined as control at the corresponding time points. Transmission electron microscope was used to study the ultrastructure, especially cell infiltration, of iris-cilary body and corneal graft at day 3, 7 and the day when rejection occurred after allogenic PK. RESULTS: Rejection was observed in all the allograft recipients followed more than 10 days, at a median time of 15 days (range 12-18 days), but not in any of isografts. CD4+ T cells were first detected at day 6 after transplantation in limbus and Ciliary body, and then in the stroma of recipient, iris, anterior chamber and corneal allograft with an increased number until graft rejection occurred. CD80 and CD86 mRNA were detected under RT-PCR examination in both graft and iris-ciliary body of allograft recipient, but not in any of isograft recipient. Three days after operation, lymphocytes and monocytes macrophages were visible in iris blood vessels and the anterior chamber, and vascular endothelial cell proliferation and activation were significant under transmission electron microscopy examination. At day 7, corneal endothelial cells became thinner. Lymphocytes and mononuclear macrophages were found with great number in the anterior chamber and adhered to the corneal endothelium. Blood vessels in iris increased and were filled with lymphocytes. And lymphocytes were detected to migrate through endothelial cell gap out of vessels. When allograft rejection occurred, macrophages attached to endothelial cells with large number of lymphocytes and macrophages infiltrating in iris. CONCLUSION: Lymphocyte infiltration and activation occurred in iris-ciliary body after allogenic PK, and the lymphocytes could migrate from iris blood vessel to the anterior chamber, which might play an important role in corneal allograft immune rejection.     

前段光学相干断层扫描在穿透性角膜移植术后移植上皮变化中的应用

目的:使用前段光学相干断层扫描(AS-OCT)评估在穿透性角膜移植术(PK)后角膜上皮厚度的变化,并确定上皮厚度在移植排斥反应早期检测中的作用。方法:前瞻性比较观察研究。共纳入20例20眼接受穿透性角膜移植术患者做为研究组,对照组16例16眼。术后2wk、1mo和3mo使用AS-OCT测量角膜厚度。术后3mo,与对照组排斥反应和上皮厚度及分布参数进行比较。结果:术后1mo,研究组的上、下、最大和最小上皮厚度值均显著低于术后2wk(P=0.0004,0.0001,0.0001,0.04),术后3mo与1mo相比无显著差异(P=0.4,0.1,0.8)。与术后2wk相比,1mo时上皮厚度的降低明显高于基质厚度(P=0.04)。角膜上皮厚度变化显示,研究组和对照组的角膜上皮厚度分布模式相似,出现明显的角膜水肿。但是,对照组中央角膜厚度(CCT)明显更高。结论:角膜移植术后移植物上皮重塑的定量评估显示,早期变化有助于角膜移植物厚度的显著改善。角膜上皮厚度和分布模式的变化可作为角膜移植排斥反应的指标。