构建Loa22基因去信号肽片段原核重组表达载体

目的：构建赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22基因去信号肽片段的原核表达载体，并对其进行克隆表达。方法：实验于2004—12／2005—12在四川大学华西医学中心感染免疫研究室完成。以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板，PCR扩增Loa22基因去信号肽片段，亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，经双酶切、PCR鉴定，筛选出阳性重组质粒克隆。经DNA测序正确后，转化大肠杆菌，利用IPTG进行诱导表达，通过SDS—PAGE鉴定表达产物。结果：PCR获得长516bp的片段。Loa22基因去信号肽片段与pGEX-4T-1的重组质粒构建成功。重组质粒经IPTG诱导后能在大肠杆菌中表达Mr45000的融合蛋白。结论：制备了Loa22基因去信号肽片段原核重组表达载体，为钩体新型疫苗的研究奠定基础。     

促Treg细胞生成及活化重组分子的构建与表达

本研究旨在构建促Treg细胞生成及活化的重组分子的原核表达载体,并鉴定其表达。应用RT-PCR获得人TGF-β1及HIV被膜蛋白gp120的C2-C4区基因并将其克隆至pCR2.1 T载体,酶切制备人TGF-β1及C2-C4区DNA片段,通过PCR定向连接两目的片段至原核表达载体pET-28a,生成pET-28a/C2-C4-Linker-hTGF-β1,转染E.coli BL21(DE3)感受态细胞,使用0.1 mmol/L的IPTG诱导蛋白表达,以Western blot方法鉴定表达结果。结果表明,成功扩增人TGF-β1及C2-C4区基因并分别克隆入pCR2.1-T载体,经亚克隆构建了重组蛋白的原核表达质粒pET-28a/C2-C4-Linker-hTGF-β1,并转染E.coli BL21(DE3)感受态细胞获得工程菌株,通过IPTG诱导,重组蛋白以包涵体形式获得表达。结论:本研究成功构建促Treg细胞生成及活化的重组分子的原核表达载体,并获得原核表达。     

SPACR原核表达载体的构建和表达

目的构建Sialoprotein associated with cones and rods（SPACR）原核表达载体并高效表达。方法根据基因文库中SPACR基因的cDNA序列设计引物,采用PCR方法扩增SPACR cDNA片段,并克隆进原核表达载体pGEX-6P-1中,转化于大肠杆菌BL21,测序鉴定后,用IPTG诱导表达出目的蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖柱柱层析纯化,收获表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。结果 PCR后扩增得到的目的片段,经酶切鉴定及DNA序列测定,证实重组载体pGEX-6P-1-SPACR构建正确,表达蛋白分子量约为分别为21.2、22.6、36.2及20.8kDa。结论在大肠杆菌中获得了SPACR片段的高效表达,为研究其蛋白功能奠定了基础。     

肺炎链球菌重组PrtA蛋白克隆与表达的相关研究

目的 构建携带PrtA基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组PrtA融合蛋白.方法 根据GenBank中肺炎链球菌表面蛋白细胞壁相关丝氨酸蛋白酶A(PrtA)蛋白基因序列,设计合成了一对特异性引物,扩增目的 片段,建立了RT-PCR检测方法.应用RT-RCR方法 扩增得到PrtA蛋白基因,并克隆到pMD18-T载体上,筛选、鉴定阳性重组子pMD18-T-PrtA,然后克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,经双酶切、PCR鉴定,获得重组表达质粒pET-30a-PrtA.将含有pET-30a-PrtA的重组菌,经终浓度为0.6 mmol/L的IPTG诱导后,重组PrtA蛋白获得高效表达.通过Western blot检测结果,检测表达的重组PrtA蛋白的反应原性.结果 所获PrtA基因与GenBank的基因序列同源性为99%;重组质粒经IPTG诱导,不同浓度的IPTG均能诱导重组蛋白表达,且IPTG终浓度为0.6 mmol/L时,目的 蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的18%.通过抗-His标签单克隆抗体在IPTG诱导6 h的重组菌蛋白中检测到一条大小约为40×103的特异性清晰条带,与预期结果 相符,表明表达的蛋白为肺炎链球菌重组PrtA蛋白.结论 成功地克隆和表达了肺炎链球菌表面蛋白细胞壁PrtA,为进一步研究以PrtA蛋白作为免疫原预防和治疗由肺炎链球菌引起的疾病奠定基础.     

弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 体外扩增弓形虫RH株膜表面抗原SAG1编码基因，构建原核表达质粒，并表达SAG1编码基因序列。方法 收集、纯化RH株速殖子，提取RNA，据已知的SAG1基因序列，在设计合成的1对引物中引入EcoRI和HindⅢ酶切位点。应用RT—PCR技术，扩增SAG1基因片段，插入原核表达质粒pET28a中，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，重组子经EcoRI和HindⅢ双酶切、PCR鉴定，转化宿主菌BL21，并以IPTG诱导表达。结果 从弓形虫RH株RNA中扩增出1011bp的SAG1基因片段，构建重组质粒pET28a／SAG1，酶切和PCR鉴定产物大小均与预期值相符；IPTG诱导，SDS—PAGE显示表达产物的大小约34．8kD．结论 成功地从弓形虫RH株RNA中获取SAG1基因，构建了pET28a／SAG1重组质粒并获得了高效表达，为免疫学诊断和蛋白质疫苗的研究创造了条件。     

GRIM-19及其截断体原核表达载体的构建及表达与纯化

目的构建GRIM-19及其截断体原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化融合蛋白。方法用RT-PCR法从HeLa细胞中扩增出带BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的GRIM-19及其截断体基因片段,将GRIM-19及其截断体基因片段克隆到pGEX-4T-3原核表达载体上,在大肠杆菌中诱导表达GST-GRIM-19及其截断体融合蛋白,用Glutathione Sepharose 4B纯化,纯化后蛋白经Western-blot鉴定。结果 pGEX-4T-3-GRIM-19及其截断体原核表达载体构建正确,并在大肠杆菌中成功诱导表达,IPTG诱导以浓度0.5mM,时间2h为宜,且通过Glutathione Sepharose4B成功纯化到融合蛋白。结论成功构建GRIM-19及其截断体原核表达载体,诱导表达并纯化GST-GRIM-19及其截断体融合蛋白。     

原核表达载体pGEX-4T-1/Snapin的构建和表达鉴定

目的构建pGEX-4T-1/Snapin原核表达载体并在大肠埃希菌中高效表达,以纯化得到Snapin/GST融合蛋白。方法用RT-PCR从小鼠血小板RNA中扩增Snapin基因。将目的片段装入原核表达载体pGEX-4T-1并转化至大肠埃希菌E.coli DH5α中,经过IPTG诱导,SDS-PAGE及凝胶扫描分析目的蛋白的表达水平。结果成功获得小鼠Snapin基因并构建得到重组表达质粒pGEX-4T-1/Snapin。筛选获得pGEX-4T-1/Snapin/E.coli DH5α重组转化菌株,诱导表达得到融合蛋白Snapin/GST。结论成功构建小鼠Snapin原核表达载体,并在E.coli DH5α中高效表达融合蛋白Snapin/GST,为深入研究Snapin蛋白的生物学结构和功能奠定基础。     

人EGFR胞外段原核表达及免疫原性研究

目的：研究人EGFR胞外段在原核本质的表达，纯化条件以及对小鼠的免疫原性。方法：以既往构建包含人EGFR胞外段基因的表达质粒为基础，采用基因工程方法构建pET原核表达载体。在大肠杆菌中表达目的蛋白，表达蛋白在变性条件下，通过Ni^2 柱亲和层析纯化以包涵体形式存在的His-Tag融合蛋白，SDS－PAGE检测其纯度。去余His-Tag的纯化蛋白在梯度尿素中透析复性。以复性蛋白免疫小鼠获得抗血清，western blotting及流式细胞仪器检测特异抗体的存在。结论：通过限制酶切分析及测序鉴定表明获得了人EGFR胞外段基因的pET原核表达载体，SDS－PAGE分析表明在IPTG诱导下可以表达90Kd目的蛋白其纯度大于95％，所产生抗体可以识别复性蛋白及表达于A549细胞上的EGFR。提示在大肠杆菌中表达的人EGFR胞外段重组蛋白具有免疫原性，可以进一步用于EGFR免疫研究。     

恙虫病东方体Kato株56kD蛋白基因的克隆与表达

目的　表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi) 5 6kD保护性抗原蛋白 ,探索其作为诊断抗原的可能性。 方法　采用PCR方法 ,从O .tsutsugamushiKato株菌种基因组DNA中扩增出 5 6kD基因片段 ,将该片段克隆于原核表达载体pQE30 ,构建成重组质粒pQE 5 6 ,IPTG诱导表达 ,SDS PAGE检测有无蛋白的表达。结果　 (1)获得长约 15 0 0bp的PCR片段 ,序列分析结果与已知Kato株 5 6kD基因序列相同 ;(2 )SDS PAGE检测表达产物 ,在相对分子量 5 6× 10 4处有表达带 ;(3)表达后菌体超声破碎后 ,目的蛋白主要以包涵体形式存在。结论　获得了 5 6kD基因片段 ,并在大肠杆菌中实现了表达。     

乙型脑炎病毒NS1基因片段的克隆、表达及鉴定

目的 构建乙型脑炎病毒NS1基因的重组原核表达质粒,诱导重组蛋白表达及免疫学鉴定. 方法 以乙型脑炎病毒基因组为模板,RT-PCR扩增NS1基因片段,构建其重组原核表达载体,并采用Western Blot方法初步鉴定该蛋白的特异性. 结果 成功扩增出乙型脑炎病毒NS1基因片段,该基因在大肠杆菌表达系统中得到表达,并且特...     

小鼠Foxp3融合蛋白的原核表达及纯化

目的克隆小鼠Foxp3(MFoxp3)基因,构建含该基因的原核表达载体,并表达、纯化出小鼠的Foxp3融合蛋白。方法RT-PCR方法从小鼠淋巴细胞扩增出小鼠Foxp3基因,连入T Easy Vector进行测序,然后将序列正确的小鼠Foxp3基因用酶切的方法从T Easy vector切下,并将其连接到用相同酶切,含有硫氧还蛋白(含6个组氨酸“标签”)的pET 32a( )原核表达载体中构建pET 32a( )-MFoxp3表达载体。用IPTG诱导转化pET 32a( )-MFoxp3表达载体的大肠杆菌BL21(DE3),并以镍螯合层析法纯化MFoxp3融合蛋白。结果经RT-PCR成功地克隆了1,290 bp的小鼠Foxp3基因,测序正确后转化大肠杆菌原核表达载体pET 32a( ),重组质粒在BL21(DE3)中成功表达出分子质量约为63 kD的融合蛋白,运用Ni-NTA方法纯化出目的蛋白,纯化后的蛋白纯度达80%,并用Western Blotting检测蛋白的灵敏度和特异性。结论构建了小鼠Foxp3的融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化出小鼠Foxp3的融合蛋白。     

融合蛋白hJagged1^ext-Fc毕赤酵母表达载体的构建及表达

本研究旨在构建人IgG1 Fc蛋白及融合蛋白hJagged1^ext-Fc，并在毕赤酵母GS115中表达。用RT—PCR法从人骨髓细胞中扩增hJagged1基因的胞外段。在测序正确后，将hJagged1基因的胞外段插入构建好的PIC—Fc载体，得到PIC—hJagged1^ext-Fc。用MD平板筛选重组子，G418法筛选高拷贝转化子，经甲醇诱导表达后，采用SDS—PAGE分析表达蛋白。结果表明：hJagged1基因的胞外段被有效地扩增。序列分析显示所构建的含phJagged1^ext-Fc融合基因的质粒与设计相同，人IgG1Fc蛋白及融合蛋白hJagged11^extFc得到正确表达。结论：成功地构建了hJagged1^ext-Fc融合基因的毕赤酵母表达载体，并在毕赤酵母中正确表达，为进一步研究Jagged1在造血干／祖细胞的体外扩增奠定了基础。     

葡萄糖调节蛋白78真核表达载体及稳定转染人视网膜色素上皮细胞株的构建

背景：葡萄糖调节蛋白78是存在于内质网上最多的分子伴侣蛋白,具有保护细胞对抗细胞调亡的作用。目的：构建携带并正确表达外源性人葡萄糖调节蛋白78基因的重组真核表达载体,建立葡萄糖调节蛋白78基因稳定转染的人视网膜色素上皮细胞系。方法：扩增人葡萄糖调节蛋白78全长编码序列,将该目的基因与真核表达载体PEGFP-N1进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞,以PCR方法鉴定阳性克隆,并进行测序和分析比对,获得融合蛋白表达质粒载体pEGFP-grp78。通过阳离子脂质体介导将重组质粒pEGFP-grp78转染入体外培养的人视网膜色素上皮细胞,经G418筛选,建立稳定表达细胞系。结果与结论：体外培养的人视网膜色素上皮细胞株作为真核细胞表达系统,经荧光显微镜和RT-PCR方法检测,G418筛选的稳定转染细胞系中GFP大量表达,葡萄糖调节蛋白78mRNA的表达量是正常视网膜色素上皮细胞的4倍左右,表示脂质体介导的pEGFP-grp78质粒成功转染视网膜色素上皮细胞,并高效稳定表达葡萄糖调节蛋白78。     

人心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)在大肠杆菌中的表达和纯化

目的获得重组人心肌型脂肪酸结合蛋白,为进一步开发应用奠定基础。方法根据已报道的心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因序列,采用RT-PCR的方法获得心肌型脂肪酸结合蛋白基因。将所得的PCR产物插入原核表达载体pQE30中,得重组质粒(pQE-H-FABP)并转化大肠杆菌(E.coli)M15,通过IPTG诱导表达出带有六个组氨酸的融合蛋白。经镍固定金属亲和层析纯化。结果序列分析表明:H-FABP基因成熟肽编码区含有396bp,编码132个氨基酸;与GenBank(NM004012)中已报道的H-FABP分离物的核苷酸序列有99·9%同源性。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的27%,分子质量约为15kDa并与商品化的H-FABP单抗(Clone6B6)呈特异性反应。经Ni 2-NTAagarose纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带。结论在大肠杆菌中获得了人心肌型脂肪酸结合蛋白的高效表达,为研究其生物学功能和制备单克隆抗体奠定了基础。     

人B型钠尿肽原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

目的构建人B型钠尿肽(Human B-type Natriurtic Peptide,BNP)原核表达载体并诱导其表达、纯化及鉴定。方法根据已报道的人BNP基因序列,采用RT-PCR技术从人心肌组织中获得B型钠尿肽cDNA序列。将所得的PCR产物插入克隆载体pGEM-T-easy中,得重组质粒,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将酶切目的片段插入原核表达载体pGEX-6P-1中并转化大肠杆菌E.coliBL21,通过IPTG诱导表达出带有GST-BNP的融合蛋白。经Glutathione Sepharose4B亲和层析纯化融合蛋白。结果序列分析表明,人B型钠尿肽基因活性肽编码区含有96bp,编码32个氨基酸,与GenBank(NM002521)中已报道的BNP核苷酸序列一致。经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的30%,相对分子质量约为29KD,并与商品化的人BNP单抗呈特异性反应。经Glu-tathione Sepharose4B纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带。结论获得了人GST-BNP蛋白,为制备BNP检测试剂奠定了基础。     

融合蛋白TRX-hJagged1原核表达载体的构建及其在BL21中的表达

本研究旨在构建原核表达载体并原核表达Notch配体Jagged1。构建不同长度但均包含DSL区的原核表达载体pET-hJagged1,将构建重组原核表达载体pET—hJagged1转化大肠杆菌BL21后,予以IPTG诱导,优化诱导条件,使目的蛋白TRX—hJagged1在上清中有较大量表达。诱导工程菌并以镍柱纯化对可溶性的目的蛋白进行纯化。结果表明,成功构建了原核表达载体pET—ldaggedl（Bg1Ⅱ）、pET—hJagged1（Hind1）及pET-hJagged1（stuI）,但仅pET—hJagged1（StuI）表达可溶性的TRX—hJagged1。通过镍柱纯化获得了较单一的TRX—Jagged1蛋白,WesternBlot证实了其为目的蛋白。结论：成功地构建了原核表达载体pET—hJagged1,并在原核表达系统表达了TRX-Jagged1融舍蛋白,为进一步研究Jagged1在淋巴造血系统中的作用奠定了基础。     

单链可变区片段与趋化因子融合的独特型淋巴瘤疫苗原核表达质粒的构建及表达

本研究目的在于克隆小鼠B细胞淋巴瘤细胞膜免疫球蛋白（Ig）的单链可变区片段（scFv），与单核细胞趋化因子（MCP-3）的基因融合，构建融合基因scFv-MCP-3的表达载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白，制备作为治疗B细胞淋巴瘤的独特型融合蛋白疫苗。采用RT-PCR法扩增BALB／c小鼠源B细胞淋巴瘤A20细胞株的Ig VH和Ig VL基因，重组PCR法用一段编码（Gly4Ser），连接肽的基因序列连接两基因，制备scFv片段。用相同PCR方法，选用一段编码NDAQAPKS连接肽的基因序列，连接scFv与MCP-3基因，获得scFv-MCP-3融合基因片段。定向克隆到原核表达质粒pGLo中，并在大肠杆菌中表达融合蛋白。测序结果表明：分别成功克隆A20细胞的Ig VH和Ig VL基因，并成功制备了scFv片段和scFv-MCP-3融合基因片段；限制性酶切方法证实，重组pGLo／scFv-MCP-3原核表达质粒中融合基因准确插入。SDS-PAGE电泳分析显示，融合蛋白分子量约65kD，与预期蛋白分子量一致，并且目的蛋白占菌体蛋白的30％。结论：本研究成功构建鼠源scFv片段与趋化因子MCP-3融合的独特型B细胞淋巴瘤疫苗表达质粒pGLo／scFv-MCP-3，并实现融合蛋白的初步表达。     

刚地弓形虫RH株主要表面抗原1的基因克隆及原核表达

目的 从刚地弓形虫RH株基因组DNA中扩增出其主要表面抗原1(SAG1)全长的基因编码序列，构建重组原核表达载体并在大肠埃希菌中进行表达，为进一步研制弓形虫病免疫诊断试剂盒打下基础。方法 根据弓形虫RH株主要表面抗原SAG1的cDNA序列设计一对引物，利用聚合酶链反应(PCR)技术从RH株弓形虫基因组中扩增出SAGl的全长基因，将其克隆到载体pGEX-4T-3中，并通过基因测序加以证实；重新设计引物将其亚克隆至原核表达载体pET-32c中，在大肠埃希菌中经IPTG诱导表达。结果 从刚地弓形虫RH株基因组中成功扩增到1030bp的全长SAG1基因，该基因在原核系统中经诱导表达出一分子量约37000大小的融合蛋白，表达产物以包涵体的形式存在。结论 SAG1是弓形虫主要的表面抗原，原核表达的sAG1融合蛋白在弓形虫病的免疫诊断中具有明显的潜在应用价值。