人骨形态发生蛋白质7基因转染兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化

背景：骨形态发生蛋白质是目前发现惟一的一类具有成骨能力的细胞因子，它能刺激基质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞方向分化。目的：应用基因工程方法，观察人骨形态发生蛋白质7基因转染兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的定向分化。设计：单一样本观察。 单位：中山大学附属第一医院骨科。材料：pcDNA1．1／AMP-hBMP7质粒。 方法：实验于2004-05／2005-03在中山大学附属第一医院外科实验室完成。全骨髓培养法培养兔骨髓基质干细胞，在体外分别转染poD．NA1．1／AMP-hBMP7和pcDNA1．1／AMP并留置空白对照。检测转染基因的转录和表达，观察细胞形态和生长情况，通过对感染细胞的碱性磷酸酶染色、钙盐染色、电镜观察胞质中钙质成分以及检测骨钙素鉴定其成骨分化表型。 主要观察指标：①兔骨髓基质干细胞的形态及生长。②表达产物的鉴定。③碱性磷酸酶染色（钙钴法）结果。④茜素红染色结果。⑤透射电镜观察结果。⑥扫描电镜观察结果。⑦骨钙素的测定结果。 结果：人骨形态发生蛋白质7基因存在于转染后的骨髓基质干细胞中并表达相应的mRNA。目的基因表达后的细胞形态略有变化，但生长曲线与未转染组无明显变化。骨钙素表达较未转染组明显增强。转染组细胞的碱性磷酸酶染色和钙盐染色均为阳性。 结论：人骨形态发生蛋白质7基因转染可促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞表型分化。     

pcDNA3.1-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达

背景：成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。目的：观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。方法：构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。结果与结论：实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。     

人骨形态发生蛋白质7基因转染兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化

背景骨形态发生蛋白质是目前发现惟一的一类具有成骨能力的细胞因子,它能刺激基质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞方向分化.目的应用基因工程方法,观察人骨形态发生蛋白质7基因转染兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的定向分化.设计单一样本观察.单位中山大学附属第一医院骨科. 材料pcDNA1.1/AMP-hBMP7质粒.方法实验于2004-05/2005-03在中山大学附属第一医院外科实验室完成.全骨髓培养法培养兔骨髓基质干细胞,在体外分别转染pcD-NA1.1/AMP-hBMP7和pcDNA1.1/AMP并留置空白对照.检测转染基因的转录和表达,观察细胞形态和生长情况,通过对感染细胞的碱性磷酸酶染色、钙盐染色、电镜观察胞质中钙质成分以及检测骨钙素鉴定其成骨分化表型.主要观察指标①兔骨髓基质干细胞的形态及生长.②表达产物的鉴定.③碱性磷酸酶染色(钙钴法)结果.④茜素红染色结果.⑤透射电镜观察结果.⑥扫描电镜观察结果.⑦骨钙素的测定结果.结果人骨形态发生蛋白质7基因存在于转染后的骨髓基质干细胞中并表达相应的mRNA.目的基因表达后的细胞形态略有变化,但生长曲线与未转染组无明显变化.骨钙素表达较未转染组明显增强.转染组细胞的碱性磷酸酶染色和钙盐染色均为阳性.结论人骨形态发生蛋白质7基因转染可促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞表型分化.     

重组pcDNA3．1-BMP7转染兔膝关节软骨细胞及其表达

目的：将重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体转染至培养的兔膝关节软骨细胞中，观察BMP7基因在兔关节软骨细胞中的表达。 方法：实验于2003-08／2004-08在哈尔滨兽医研究所完成。①选取清洁级健康成年家兔1只，兔膝关节软骨切碎后取2．0-2．5kg软骨组织，进行关节软骨细胞的分离与培养。②脂质体与pcDNA3.1-BMP7 DNA质粒形成脂质体-DNA质粒复合物，复合物的最佳比例为脂质体10μL、pcDNA3.1-BMP7质粒4μg。用含G418的正常培养液筛选转pcDNA3.1-BMP7质粒μg400mg／L的正常培养液筛选转染pcDNA3.1-BMP7DNA质粒的软骨细胞，显微镜观察细胞的形态及活性。③软骨细胞转染后7d和28d，分别用聚合酶链式反应、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western blot、免疫荧光、原位杂交检测等方法测定BMP7蛋白在软骨细胞中的表达。 结果：①家兔膝关节软骨细胞的分离与培养情况：家兔膝关节软骨切碎后用胰蛋白酶／Ⅱ型胶原酶进行消化，能使细胞与细胞外基质很好地分离。接种24h，部分细胞开始贴壁生长，72h后分裂增殖，7d时细胞融合率为90％～100％。贴壁初期细胞呈圆形或三角形，以三角形为主，每7d传代1次。②脂质体介导下pcDNA3.1-BMP7质粒转染兔软骨细胞情况：转染后的软骨细胞用G418筛选，4d转染效率约15％，阳性克隆细胞七八天融合率约为90％。G418连续筛选28d，阳性克隆细胞仍然存活，细胞融合率为100％。未转染pcDNA3.1-BMP7质粒的细胞，G418筛选4d时细胞全部死亡。③转染后兔软骨细胞聚合酶链式反应检测结果：聚合酶链式反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，结果在1．3kb处可见DNA条带，作为对照的软骨细胞未见此DNA条带。④转染后软骨细胞BMP7蛋白表达电泳检测结果：在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上可见相对分子质量约为18000的电泳条带。⑤转染后软骨细胞BMP7蛋白表达的Western blot检测结果：可见相对分子质量约为18000的特异性条带。⑥转染后软骨细胞蛋白表达的免疫荧光检测结果：转染7，28d的软骨细胞核周围均可见绿色荧光，未转染的软骨细胞未见BMP7蛋白表达。⑦转染后软骨细胞原位杂交检测结果：转染pcDNA3.1-BMP7质粒且G418筛选7，28d的软骨细胞细胞核周围均呈黄褐色，未转染的软骨细胞未见BMP7表达。 结论：用脂质体将pcDNA3.1-BMP7 DNA质粒转染至兔关节软骨细胞。BMP7在关节软骨细胞中获得表达，为软骨损伤的基因治疗及用作种子细胞构建组织工程软骨奠定实验基础。     

pcDNA3.1-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达（英文）

背景:成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。目的:观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。方法:构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。结果与结论:实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。     

转基因骨髓基质细胞修复骨缺损

背景：转基因细胞移植可以提高成骨细胞数量及成骨活性，有可能成为骨缺损的重要修复方法。目的：构建人骨形态发生蛋白2真核表达载体，鉴定并转染兔骨髓基质细胞，应用基因治疗的方法修复兔桡骨缺损，观察其成骨效果。设计、时间及地点：单一样本观察及同体对照动物实验，于2004-06/2006-02在哈尔滨医科大学附属第一医院中心实验室完成。材料：克隆质粒psp-65BMP2为解放军第四军医大学171腔医院惠赠；pcDNA3．1表达载体购自Invitrogen公司；清洁级新西兰白兔32只，雌雄不限，体质量为2～2．5kg。方法：双酶切克隆载体将骨形态发生蛋白2目的基因与真核表达载体pcDNA3．1连接。将自体骨髓基质细胞修复兔桡骨缺损。分别于16只新西兰白兔缺损处植入载有转基因细胞的胶原，对侧植入单纯胶原对照。16只新西兰白兔缺损处植入载有自体细胞的胶原，对侧植入单纯胶原对照。主要观察指标：①免疫组织化学及Western blotting检测转染骨形态发生蛋白2基因骨髓基质细胞的表达效果。②术后12周麻醉后处死动物，行缺损处大体观察、X射线观察及组织学和电镜观察。结果：①成功构建骨形态发生蛋白2真核表达载体，转染骨髓基质细胞后，免疫组织化学染色，可在骨髓基质细胞胞浆显示棕色阳性染色：Western blotting检测有针对骨形态发生蛋白2抗体的蛋白条带，证实骨形态发生蛋白2表达。②组织学和电镜观察实验侧骨缺损处可见大量成骨细胞及新生基质。对照侧仅在断端间见少量骨细胞，断端处为纤维组织充填：转基因骨髓基质细胞修复骨缺损完全愈合：大体及X射线观察转染实验侧有连续骨痂通过骨缺损处，对照侧无连续骨痂通过断端。结论：骨髓基质细胞经基因转染后可以表达骨形态发生蛋白2，并可以修复骨缺损。     

胰岛素样生长因子Ⅱ基因转染骨髓基质细胞后的生物学活性

目的：将人胰岛素样生长因子Ⅱ基因的真核表达载体pcDNA3-胰岛素样生长因子Ⅱ，转染兔骨髓基质细胞，使其在该细胞中瞬时表达，并观察该表达载体促进骨髓基质细胞增殖的生物学活性。方法：实验于2004—08／12在解放军总医院骨科研究所完成。①骨髓基质细胞培养：取4周龄雄性新西兰大白兔1只用于骨髓基质细胞提取。培养的第2代细胞用于实验。②基因转染：将人胰岛素样生长因子Ⅱ基因的真核表达载体pcDNA3-胰岛素样生长因子Ⅱ，转染兔骨髓基质细胞，对照组则为空载体pcDNA3。③转染与非转染骨髓基质细胞胰岛素样生长因子ⅡmRNA表达：采用反转录-聚合酶链反应检测。④转染细胞的增殖状况检测：采用四甲基偶氮唑盐法测定各组吸光度（A）值（A值越大表示细胞增殖越强）。结果：①转染与非转染骨髓基质细胞胰岛素样生长因子ⅡmRNA表达：琼脂糖凝胶电泳的结果显示，未转染和转染pcDNA3质粒的细胞仅出现内参照β-肌动蛋白的条带，而转染的细胞出现胰岛素样生长因子Ⅱ和β-肌动蛋白的两条带。（2）转染细胞的增殖状况：24，48，72h各时间点单纯骨髓基质细胞组和转染胰岛素样生长因子Ⅱ的骨髓基质细胞组细胞增殖均显著高于与对照组（72h：1.233&;#177;0.45，1．575&;#177;0.45，0．482&;#177;0．04，P〈0．01）；转染胰岛素样生长因子Ⅱ的骨髓基质细胞组显著性高于单纯骨髓基质细胞组（P〈0．01）。结论：将具有多重生物学效应的胰岛素样生长因子Ⅱ基因转入软骨组织工程最佳种子细胞-骨髓基质细胞，明确胰岛素样生长因子Ⅱ促进骨髓基质细胞增殖分化效应，并初步证实了其促进种子细胞的成骨活性。     

脂质体介导pcDNA3/hVEGF165转染骨髓基质干细胞复合冻干骨的体内成骨和血管化

背景：以往的研究表明血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子可以促进移植物的存活和体内生长。目的：观察脂质体介导的pcDNA3/hVEGF165转染骨髓基质干细胞后复合冻干松质骨在体内的成骨和血管化效果。方法：取同种异体新西兰大白兔的耾骨和股骨制备冻干骨,用脂质体将血管内皮生长因子转染入体外培养扩增新西兰大白兔骨髓基质干细胞中,使其附着于同种异体冻干松质骨。将新西兰大白兔分为3组,于兔竖脊肌分别植入单纯冻干骨、单纯骨髓间充质干细胞复合冻干骨组、转染有血管内皮生长因子的骨髓基质干细胞复合冻干松质骨。结果与结论：植入后8周时可见到转染血管内皮细胞生长因子的骨髓基质干细胞复合冻干松质骨标本的表面有软骨和骨质形成,有成骨和破骨细胞出现,并形成类骨质,在移植骨周围组织中有大量血管形成,其他两组仅有大量纤维包裹。说明,脂质体介导的pcDNA3/hVEGF165转染后骨髓基质干细胞复合冻干骨具有较好成骨活性,优于单纯骨髓基质干细胞复合冻干松质骨和单纯冻干骨。     

hVEGF165基因转染后骨髓间充质干细胞蛋白分泌功能及成骨活性的检测

目的：血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在血管再生和骨组织再生过程中起着重要的调节作用。观察hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞分泌VEGF的功能及转染后细胞的成骨活性。 方法：实验于2004—07／2005—12在江苏省血液研究所国家重点实验室完成。①体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞，传代培养后以1μg PcDNA3．1-hVEGF165：3μL阳离子脂质体Lipofectamine的比例转染，通过免疫组织化学SP方法检测转染后细胞中外源性VEGF的表达。②体外分离、培养大鼠肾微血管内皮细胞，分别加入hVEGF165基因转染48h及1周后细胞上清、空载体转染及未转染组细胞上清，MTT法观察细胞增殖情况，以了解转染后细胞培养上清中VEGF的生物学活性。③测定在正常条件培养和成骨条件培养下，转染后细胞上清中碱性磷酸酶、骨钙素的水平。 结果：①hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF蛋白。②hVEGF165基因转染48h组大鼠肾微血管内皮细胞A值高于空载体转染及未转染组（P〈0．05），但低于hVEGF165基因转染1周组。③成骨条件培养下，基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的分泌量明显高于未转染组（P〈0．05）；而在正常条件培养下，基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的表达分泌量较低。 结论：①采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF，且这种生物学活性呈剂量依赖性。②在成骨条件培养下，转染hVEGF165基因后骨髓间充质干细胞的成骨能力增强。     

同种异体骨髓基质细胞修复大鼠股骨缺损

目的：评估腺病毒介导的转BMP-2基因的同种异体骨髓基质干细胞的成骨潜能和免疫原性，探索骨缺损修复新途径。方法：将编码骨髓基质干细胞的基因，通过腺病毒介导转染同种异体骨髓基质干细胞后复合藻酸钙凝胶植入骨缺损部位并应用免疫抑制剂FK506。结果：术后8周检查，Adv—hBMP-2转染的同系骨髓基质干细胞-藻酸钙复合体组、Adv—hBMP-2转染的同种异体骨髓基质干细胞-藻酸钙-FK506复合体组以板层骨为主；Adv—hBMP-2转染的同种异体骨髓基质干细胞-藻酸钙复合体组以编织骨和类骨质为主，内有炎症细胞浸润；Adv-βgal转染的同系骨髓基质干细胞一藻酸钙复合体组、Adv-βgal转染的同种异体骨髓基质干细胞-藻酸钙-FK506复合体组、Adv-βgal转染的同种异体骨髓基质干细胞一藻酸钙复合体组无明显新骨形成．缺损区内为纤维结缔组织。结论：Adv—hBMP-2转染同种异体骨髓基质干细胞-藻酸钙一-FK506复合体可促进长骨干节段性骨缺损的修复。     

血管内皮细胞生长因子在兔骨髓基质干细胞内的表达及影响

目的:构建血管内皮细胞生长因子pcDNA3/hVEGF165真核表达载体,并用脂质体法转染骨髓基质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),观察血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)转染后对骨髓MSCs的生长、转化的影响。方法:采用贴壁法分离骨髓MSCs,脂质体法转染。100g/L胎牛血清DMEM培养MSCs,计数法绘制生长曲线,特殊染色观察MSCs的转化,免疫组织化学法观察转染后VEGF的表达。结果:转染了pcDNA3/hVEGF165的骨髓MSCs胞浆内出现VEGF阳性颗粒,而转染了pcDNA3组及未转染组中未出现阳性颗粒,生长曲线在3组中无明显差别。特殊染色出现的时间亦无明显差别。而且,注射有转染了pcDNA3/hVEGF165的MSCs的大白兔局部皮下血管数量增加,其他两组未发现。结论:本实验成功构建了pcDNA3/hVEGF165真核表达载体并能够在MSCs细胞内表达VEGF,其表达产物具有血管内皮增殖刺激活性。     

BMP‐2‐transduced human bone marrow stem cells enhance neo‐bone formation in a rat critical‐sized femur defect

Synthetic graft materials are considered as possible substitutes for cancellous bone, but lack osteogenic and osteoinductive properties. In this study, we investigated how composite scaffolds of βTCP containing osteogenic human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs) and osteoinductive bone morphogenetic protein‐2 (BMP‐2) influenced the process of fracture healing. hBMSCs were loaded into βTCP scaffolds 24 h before implantation in a rat critical‐sized bone defect. hBMSCs were either stimulated with rhBMP‐2 or transduced with BMP‐2 by gene transfer. The effect of both protein stimulation and gene transfer was compared for osteogenic outcome. X‐rays were conducted at weeks 0, 1, 3, 6, 9 and 12 post‐operatively. In addition, bone‐labelling fluorochromes were applied at 0, 3, 6 and 9 weeks. Histological analysis was performed for the amount of callus tissue and cartilage formation. At 6 weeks, the critical‐sized defect in 33% of the rats treated with the Ad‐BMP‐2‐transduced hBMSCs/βTCP scaffolds was radiographically bridged. In contrast, in only 10% of the rats treated with rhBMP2/hBMSCs, 12 weeks post‐treatment, the bone defect was closed in all treated rats of the Ad‐BMP‐2 group except for one. Histology showed significantly higher amounts of callus formation in both Ad‐BMP‐2‐ and rhBMP‐2‐treated rats. The amount of neocartilage was less pronounced in both BMP‐2‐related groups. In summary, scaffolds with BMP‐2‐transduced hBMSCs performed better than those with the rhBMP2/hBMSCs protein. These results suggest that combinations of osteoconductive biomaterials with genetically modified MSCs capable of secreting osteoinductive proteins may represent a promising alternative for bone regeneration. Copyright © 2015 John Wiley & Sons, Ltd.     

重组Osf2定向调控骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

目的研究成骨细胞特异性因子(Osf2)调控骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化为成骨细胞(OB)的分子机制。方法用Percoll密度梯度离心法分离获得大鼠的MSCs,通过细胞免疫化学、免疫荧光、透射电镜及流式细胞仪等方法进行鉴定。构建真核表达载体pcDNA3.1( )/Osf2,通过脂质体系统转染传代培养后的MSCs,用Northern Blot检测三种OB细胞外基质蛋白mRNA的表达情况。结果转染后的MSCs都表达OB特异性基质蛋白骨钙素、骨桥接蛋白和I型胶原。结论Osf2在转录水平定向调控MSCs分化为成骨细胞,可应用于骨质疏松、骨缺损等疾患的基因治疗。     

地塞米松诱导联合骨形成蛋白2基因修饰兔骨髓间质干细胞的成骨转化

背景:骨髓间质干细胞在地塞米松等骨诱导剂的作用下能够向成骨细胞分化;同时骨形成蛋白2在骨修复过程中促进细胞增殖分化和基质分泌,在体内外均可诱导骨形成,以上二者联合应用可能会产生一定的协同效应.目的:分析体外经地塞米松诱导是否能增强骨形成蛋白2基因修饰的骨髓间质干细胞的成骨转化能力.设计:随机化配对设计.单位:解放军第四军医大学西京医院.材料:实验于2004-02/2004-08在解放军第四军医大学全军骨肿瘤研究所完成.选用2月龄新西兰白兔20只,由解放军第四军医大学实验动物中心提供(许可证号:军动管字第2005C00117号).室温、常湿,正常喂食.双侧取材,左侧肢体来源骨髓间质干细胞为地塞米松诱导组,右侧为对照组(未经诱导).方法:将地塞米松诱导组和对照组兔骨髓间质干细胞分别转导含有人骨形成蛋白2基因的复制缺陷重组腺病毒Ad-BMP-2后,以反转录-聚合酶链反应和免疫组化方法检测细胞中骨形成蛋白2的表达情况.观察骨髓间质干细胞的生长情况,并应用碱性磷酸酶检测试剂盒及骨钙素放免试剂盒测定Ad-BMP-2转导5 d后两组骨髓间质干细胞的碱性磷酸酶活性和骨钙素含量.主要观察指标:①骨髓间质干细胞中骨形成蛋白2的表达情况.②骨髓间质干细胞的形态学变化.③骨髓间质干细胞中碱性磷酸酶活性和骨钙素含量.结果:①转导后骨形成蛋白2基因在地塞米松诱导组和对照组兔骨髓间质干细胞中均有表达.②骨髓间质干细胞经地塞米松成骨诱导后形态较不规则,呈三角形、多角形改变,较基础培养基培养细胞生长缓慢.基因转导后细胞形态无明显改变.③转基因5 d后,地塞米松诱导组骨髓间质干细胞培养上清中碱性磷酸酶活性高于对照组[(134.36±8.84,104.02±7.83) nkat/L(t =3.350 6,P＜0.01,n =20)];地塞米松诱导组骨髓间质干细胞骨钙素分泌量高于对照组[(14.68±0.73,6.52±1.21) μg/L(t =3.568 2,P＜0.01,n =20)].结论:转基因前的地塞米松诱导能够促进骨形成蛋白2基因修饰的骨髓间质干细胞增殖和成骨转化.     

大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后的表达

背景将生物材料复合细胞因子基因,或复合转入细胞因子基因的细胞植入骨缺损处可以促进骨修复.目的观察将大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后进行骨缺损基因治疗的可行性.设计对照观察实验.单位华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科.对象新生SD大鼠5只,雌雄不限.方法实验于2000-02/09在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成.通过脂质体介导将转化生长因子β1基因导入大鼠成骨细胞,并以质粒pcDNA3转染细胞作为对照.转染24 h后通过链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测目的基因瞬时表达的情况.采用G418筛选转染细胞2周,获得阳性细胞克隆,用链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法检测转染细胞稳定表达转化生长因子β1的情况.主要观察指标链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测转染细胞基因表达情况.结果①pcDNA3-TGF-β1转染成骨细胞瞬时表达组化检测和原位杂交检测结果24 h转染成骨细胞胞浆中充满染色的棕黄色颗粒,对照组空载体转染细胞胞浆中则没有棕黄色颗粒,说明转基因细胞中转化生长因子β1 mRNA明显增高.②G418筛选转基因细胞组化检测G418筛选2周后的转染细胞仍然有较高的转化生长因子β1表达.结论利用基因转染技术可使成骨细胞瞬时、高效表达细胞因子,转染后瞬时和筛选2周后,均呈现转化生长因子β1基因转染成骨细胞后稳定的高表达,说明采用细胞因子基因转染成骨细胞进行骨缺损的基因治疗具有可行性.     

Osteogenic matrix sheet-cell transplantation using osteoblastic cell sheet resulted in bone formation without scaffold at an ectopic site

We previously reported that in vivo bone formation could be observed in composites of porous hydroxyapatite (HA) scaffolds and cultured mesenchymal stem cells (MSCs). In the present study, we developed a new method for transplantation of cultured MSCs without the necessity of using a scaffold to form bone tissue. MSCs were culture-expanded and lifted as cell sheet structures. These cell sheets, designated osteogenic matrix sheets, showed positive alkaline phosphatase (ALP) staining, high ALP activities and high osteocalcin (OC) contents, indicating their osteogenic potential. We transplanted these sheets into subcutaneous sites in rats to assess whether they possessed in vivo bone-forming capability. The transplanted sheets showed mineralized matrix together with osteocytes and an active osteoblast lining, indicating new bone formation, at 6 weeks after transplantation. HA scaffolds were also wrapped with the sheets to make HA/sheet composites and implanted into subcutaneous sites in rats. Histological sections of the composites revealed bone formation in the HA pores at 4 weeks after implantation. Our present results indicate that MSCs can be cultured as sheet structures, and the resulting sheets themselves or HA-sheet composites represent osteogenic implants that can be used for hard tissue reconstruction.     

Cbfa1对骨髓间充质干细胞分化的定向调控研究

目的研究Cbfa1调控间充质干细胞(MSCs)分化为成骨细胞的分子机制。方法用Percoll密度梯度离心法分离获得人、大鼠和小鼠的MSCs,通过苏木精-伊红染色、细胞化学、免疫细胞化学、免疫荧光及透射电镜等方法进行鉴定。传代培养后的MSCs分别用重组真核表达载体pcD-NA3.1(+)/Cbfa1-II通过脂质体系统转染,用NorthernBlot检测三种成骨细胞特异性细胞外基质蛋白mRNA的表达情况。结果转染后人、大鼠和小鼠的MSCs都有骨钙素、骨桥接蛋白和I型胶原的表达,三者间无明显差别。结论Cbfa1在转录水平定向调控间充质干细胞分化为成骨细胞,可应用于骨科疾患的基因治疗。     

Bone morphogenetic protein-2 in biodegradable gelatin and β-tricalcium phosphate sponges enhances the in vivo bone-forming capability of bone marrow mesenchymal stem cells

Bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) have been used for bone tissue engineering due to their osteogenic differentiation capability, but their application is controversial. To enhance their capability, we prepared biodegradable gelatin sponges incorporating β-tricalcium phosphate ceramics (GT sponge), which has been shown to possess excellent controlled drug-release properties. The GT sponge was used as a carrier for both rat MSCs and bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) and osteogenic differentiation was assessed by subcutaneous implantation of four different kinds of implants, i.e. GT-alone, MSC-GT composites, BMP-GT composites and BMP-GT composites supplemented with MSCs (BMP-MSC-GT) in rats. Two weeks after implantation, histological sections showed new bone formation in the peripheral parts of the BMP-GT and in almost the total volume of the BMP-MSC-GT implants. After 4 weeks, histology as well as microCT analyses demonstrated extensive bone formation in BMP-MSC-GT implants. Gene expression and biochemical analyses of both alkaline phosphatase and bone-specific osteocalcin confirmed the histological findings. These results indicate that the combination of MSCs, GT and BMP synergistically enhances osteogenic capability and provides a rational basis for their clinical application in bone reconstruction.     

Neotendon formation induced by manipulation of the Smad8 signalling pathway in mesenchymal stem cells

Tissue regeneration requires the recruitment of adult stem cells and their differentiation into mature committed cells. In this study we describe what we believe to be a novel approach for tendon regeneration based on a specific signalling molecule, Smad8, which mediates the differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) into tendon-like cells. A biologically active Smad8 variant was transfected into an MSC line that coexpressed the osteogenic gene bone morphogenetic protein 2 (BMP2). The engineered cells demonstrated the morphological characteristics and gene expression profile of tendon cells both in vitro and in vivo. In addition, following implantation in an Achilles tendon partial defect, the engineered cells were capable of inducing tendon regeneration demonstrated by double quantum filtered MRI. The results indicate what we believe to be a novel mechanism in which Smad8 inhibits the osteogenic pathway in MSCs known to be induced by BMP2 while promoting tendon differentiation. These findings may have considerable importance for the therapeutic replacement of tendons or ligaments and for engineering other tissues in which BMP plays a pivotal developmental role.