金黄色葡萄球菌L型菌落细胞渗透稳定性的测定

通常认为细菌,尤其是革兰氏阳性细菌,形成L型后其渗透性敏感,故需用高渗透性的培养基培养。但已屡见细菌L型广泛存在于人体各种组织和体液中,并且可在细菌学常规增菌培养中生长繁殖的报道。我们也成功地用非高渗透性培养基培养了金黄色葡萄球菌等细菌的L型。本文用金黄色葡萄球菌L型菌落做L型细菌渗透脆性试验,现报道如下。     

伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌的稳定L型染色体DNA内切酶谱

细菌细胞壁的完整性被破坏或其合成受到抑制后,在一定条件下可以 L 型生存。传统认为 L 型是表型变异,在无诱导剂存在的环境中可重新合成细胞壁而返祖,但近年来已发现有些 L 型是稳定的,在无诱导剂的培养基中生长不能自发返祖。我们用青霉素诱导伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌形成 L 型,在不含诱导剂的非高渗透性培养基或常规细菌学培养基中经一年余时间数十代培养未发生自发返祖,表明这些 L 型具有稳定的遗传性质。本文提取伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌的稳定 L 型和细菌型的染色体 DNA,用核酸内切酶消化。研究其 DNA 内切酶谱特点以及稳定 L 型变异的     

苯唑西林诱导金黄色葡萄球菌形成L型研究

目的 用苯唑西林(青霉素类抗生素)诱导金黄色葡萄球菌形成L型.方法 用抗生素诱导法(液体法),用高渗培养进行金黄色葡萄球菌L型的诱导,用含药平板法进行细菌L型的筛选及菌落计数.对细菌L型的培养物进行革兰和细胞壁染色;对金黄色葡萄球菌原型及回复型菌进行MIC测定.结果 与结论苯唑西林在50μg·mL-1时,可诱导金黄色葡萄球菌形成L型.     

用营养琼脂培养细菌L型的研究

我们前文报道了用不含血清的非高渗透性液体培养基培养细菌 L 型的结果。现将沙门氏菌、白喉棒状杆菌和葡萄球菌的 L 型接种于细菌学常规的营养琼脂培养基传代培养,以及对其生物学、病原性等特性进行的研究报道如下。     

cppB基因PCR检测淋病奈瑟菌稳定L型的评价

目的 对淋病奈瑟菌隐蔽性质粒B（cryptic plasmidB,cppB)基因用于淋病奈瑟菌稳定L型基因诊断的评价。方法 用非高渗液体培养基培养青霉素诱导形成和自发形成的淋病奈瑟菌稳定L型，获得纯培养物以特异性cppB基因引物进行聚合酶链反应（PCR）检测。结果 淋病奈瑟菌细菌型可检出cppB基因，但不论诱导形成还是自发形成的稳定L型传5代后纯培养物cppB基因检测均为阴性反应。结论 细胞壁缺陷可导致淋病奈瑟菌cppB基因丢失。导致cppB基因鉴定淋病奈瑟菌的假阴性或诊断淋病的漏诊和误诊。     

结核菌L型的形成及其分离与鉴定

目的 探讨结核分枝杆菌L型的形成规律及其检测与鉴定方法。方法 将结核分枝杆菌分别接种于苏通液体培养基以及含最低抑菌浓度（MIC）的利福平、异烟肼、乙胺丁醇的苏通液体培养基内培养,L型自发形成或被诱导形成后过滤和传代培养获得L型纯培养物。观察L型纯培养物的形态与生长特性以及用结核分枝杆菌特异性基因片段的引物对L型进行菌种的PCR检测与鉴定。结果 结核分枝杆菌在非高渗透压培养基内培养3天后可自发形成L型,最低抑菌浓度的利福平、异烟肼、乙胺丁醇能够迅速诱导结核分枝杆菌大量形成L型。培养物经0．22μm孔径滤菌器过滤后传代培养可获得L型纯培养物,结核分枝杆菌特异性基因片段的PCR反应能够检测结核分枝杆菌L型并且对L型进行菌种的快速鉴定。结论 结核分枝杆菌能够自发形成和在抗结核药物的诱导下形成L型,从而导致病原学检查的漏诊或误诊以及影响治疗效果。采用非高渗培养法能够有效检出结核分枝杆菌L型,用结核分枝杆菌特异性基因片段的P（R反应能够对结核分枝杆菌稳定L型进行菌种快速鉴定。     

细胞壁缺陷肺炎链球菌青霉素结合蛋白2b基因片段的检测

目的 了解细胞壁缺陷肺炎链球菌青霉素结合蛋白2b基因(pbp2b)片段的检测及其意义.方法 用青霉素诱导肺炎链球菌形成L型,分离稳定L型纯培养物.提取L型染色体DNA,用肺炎链球菌pbp2b序列特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)并检测扩增产物的核苷酸序列,测得序列与GenBank公布的肺炎链球菌R6菌株种特异性pbp2b(628 bp)序列比对.结果 肺炎链球菌稳定L型PCR扩增产物的核苷酸序列与肺炎链球菌R6菌株种特异性pbp2b序列具有99.1%的同源性.结论 细胞壁缺陷肺炎链球菌保留了与肺炎链球菌R6菌株高度同源的种特异性pbp2b基因片段,检测该基因片段可用于肺炎链球菌稳定L型的鉴定.     

小鼠前脂肪细胞3T3-L1培养与四联诱导分化方法的探讨

摘要： 目的 改进小鼠前脂肪细胞 3T3-L1 的培养并诱导分化为成熟脂肪细胞的方法。方法 使用含有 10％胎牛血清 （FBS） 的高糖型 DMEM 液体培养基常规培养小鼠前脂肪细胞, 2~3 d 换液 1 次。细胞按诱导分化方式的不同分为三联诱导组和四联诱导组。三联诱导组诱导分化培养基Ⅰ成分为常规培养基基础上加用人胰岛素 10 mg/L, 1- 甲基-3-异丁基黄嘌呤 （IBMX）0.5 mmol/L, 地塞米松 （DEX） 1.0 μmol/L; 四联诱导组诱导分化培养基Ⅰ的成分为在三联诱导组基础上加入吲哚美辛 0.1 mmol/L。2 组均诱导分化培养基Ⅰ培养 2 d, 连续诱导 2 次后换用诱导分化培养基Ⅱ, 成分为： 高糖型 DMEM 培养基含 10 %胎牛血清、 100 U/mL 青霉素和 100 mg/L 链霉素混合液, 人胰岛素 10 mg/ L。培养 2 d, 连续诱导 2 次。倒置显微镜和油红 O 染色观察诱导前及诱导后 2 组细胞的形态变化。结果 小鼠前脂肪细胞 3T3-L1 状态良好, 呈现铺路石状生长, 均匀布满培养瓶底, 2 d 传代 1 次。四联诱导组诱导分化结果优于三联诱导组。三联诱导剂诱导前脂肪细胞后, 细胞形态并未发生明显变化。四联诱导剂诱导前脂肪细胞后, 可达到 90％以上的成熟脂肪细胞。成熟的脂肪细胞呈圆形, 有大量脂滴聚集, 油红 O 染色显现橘红色。结论 在三联诱导基础上加入吲哚美辛的四联诱导法可以更好地促进脂肪前体细胞分化。     

结核分枝杆菌稳定L型利福平耐药性基因的研究

目的探讨细胞壁缺陷结核分枝杆菌形成利福平耐药性的分子机制。方法将结核分枝杆菌分别接种于含利福平与不含利福平的非高渗透压液体培养基内培养,逐日在倒置显微镜下观察L型的形成情况。L型形成和生长后,滤过培养物分离L型,在不含诱导剂的非高渗液体培养基内传代培养获得L型纯培养物。用结核分枝杆菌利福平耐药性相关基因(rpoB基因)引物分别对自发形成的稳定L型及诱导形成的稳定L型的染色体DNA进行PCR扩增,扩增产物分别以琼脂糖凝胶电泳及PCR-DS方法进行检测和分析。结果结核分枝杆菌既可在非高渗透压培养基内自发形成细胞壁缺陷细菌并成为稳定L型,也可在最低抑菌浓度的利福平作用下发生细胞壁缺陷并成为稳定L型。PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳可见自发形成和诱导形成的稳定L型均形成与其亲代细菌型一致的DNA条带,序列分析显示具有与其亲代细菌型相同的碱基序列。结论结核分枝杆菌在非高渗透压培养基内既可以自发地形成L型,也可以被利福平诱导形成L型。结核分枝杆菌稳定L型具有明显的利福平耐药性,但其相关rpoB基因并没有发生突变。提示结核分枝杆菌的利福平耐药性变异不一定同rpoB基因突变有关,细胞壁缺陷也是导致结核分枝杆菌形成利福平耐药性的一个重要机制。     

L型化脓性链球菌的产生及其抗肿瘤 作用

[Yamamoto A et al:Japan J Exp Med50(5):383,1980(英文)] 本文报导用胞壁溶素(muralysin)和青霉素联合处理,能够从3和4型化脓性链球菌中有效地诱导出L型菌株,并对其抗肿瘤作用进行比较。作者选用C512和Su等11株化脓性链球菌,用C群噬菌体协同溶素     

用生物反应器培养大肠杆菌生产来自粪产碱杆菌的重组青霉素G酰胺酶

通过大肠杆菌的重组表达生产了对于组合生物化学具应用特性的、来自粪产碱杆菌的青霉素 G酰胺酶 (PGA )。相关的基因被克隆到一个多拷贝载体上并处于鼠李糖诱导启动子的严格调控之下。菌体细胞在生物反应器 (5 L )中用合成基本培养基培养 ,反复添加作为碳源的诱导物——鼠李糖来诱导 PGA的产生。发酵得率约为 4 5 0 0 u PGA活力 /L培养基。用生物反应器培养大肠杆菌生产来自粪产碱杆菌的重组青霉素G酰胺酶@龚家玮     

树大网膜前脂肪细胞原代培养及诱导分化

目的探讨树大网膜前脂肪细胞原代培养的方法,优化其诱导分化的方法。方法采用酶消化的方法对树大网膜组织进行原代培养,待其传至第三代时,用含0.5mmoL/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10μmol/L胰岛素、0.2mmoL/L吲哚美辛、1μmoL/L地塞米松的高糖DMEM诱导配方对树大网膜前脂肪细胞进行成脂诱导,14d后见到细胞内聚集脂滴,对其进行油红O染色。结果树大网膜脂肪细胞在体外成功培养,细胞形态良好,呈梭形。诱导后的脂肪细胞第3d出现少数出现小脂滴,14d左右,大部分细胞胞质中出现圆而大的脂滴。结论树大网膜脂肪组织可在体外进行培养,稳定传代并能诱导分化为成熟的脂肪细胞。     

酸枣仁皂甙A对青霉素钠诱发大鼠海马CA1区过度兴奋的抑制作用

目的：观察中药酸枣仁皂甙A对青霉素钠诱导产生的大鼠海马脑片CA1区兴奋性放电的抑制作用。方法：细胞外记录离体大鼠海马脑片CA1区锥体细胞层群体峰电位。结果：青霉素钠500、1000和2000kU/L可剂量依赖地诱导海马脑片上CA1区神经元的兴奋。苯巴比妥钠0．02－0．05g/L和酸枣仁皂甙A0．5－0．10g/L都可以剂量依赖性地抑制这种青霉素钠诱发的兴奋反应。结论：高剂量的酸枣仁皂甙A能够抑制青霉素钠诱导的海马CA1区兴奋性电位。群峰电位（PS）的个数和第一个峰电位的幅度受到的抑制较明显,而兴奋性突触后场电位的变化不大。     

新生儿败血症62例病原学分析

目的 探讨近年来新生儿败血症的病原学变化以及细菌对抗生素的药敏情况。方法 用纸片扩散法对培养出的细菌进行药敏试验。结果 培养出细菌20种共53株,霉菌1株、L型细菌8株;金黄色葡萄球菌占37．1％,表皮葡萄球菌占12．9％,腐生葡萄球菌占6．45％。L型细菌中L型金黄色葡萄球菌3株。葡萄球菌对青霉素及氨苄青霉素的耐药率分别为79．17％和78．95％,头孢唑啉的耐药率为21．05％,丁胺卡那的耐药率仅为7．69％。结论 新生儿败血症最常见的病原菌为葡萄球菌。丁胺卡那及头孢唑啉是葡萄球菌较为有效的抗生素。L型细菌培养很有必要。     

结核分枝杆菌稳定L型耐乙胺丁醇embB基因的研究

目的探讨结核分枝杆菌L型形成乙胺丁醇耐药性的分子机制。方法采用非高渗分离培养法在不含乙胺丁醇与含乙胺丁醇的液体培养基内诱导形成结核分枝杆菌L型,过滤传代后获得稳定L型纯培养物。通过nPCR扩增、PCR-SSCP及PCR-DS技术分别对自发形成与诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型耐乙胺丁醇embB基因进行检测和分析。结果自发形成及药物诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型embB基因的nPCR及PCR-SSCP结果显示,与其亲代细菌型一致的DNA条带和带型;测序结果显示稳定L型embB基因序列与其亲代细菌相同没有发生改变,其结果与PCR-SSCP分析结果一致。结论 PCR-SSCP和PCR-DS技术可用于结核分枝杆菌L型耐乙胺丁醇基因的检测;无论是自发形成或药物诱导形成的稳定L型embB基因未发生突变,提示结核分枝杆菌L型对乙胺丁醇的耐药性同embB基因突变无关,细胞壁缺陷变异可能是导致结核分枝杆菌产生乙胺丁醇耐药性的一个重要机制。     

新的β-内酰胺化合物对β-内酰胺酶抑制作用的比较

本文研究了CP—45,899对β—内酰胺酶的抑制活性,并且与克拉维酸、双氯青霉素对β—内酰胺酶的抑制活性作了比较。试验分别用头孢菌素Ⅰ、头孢菌素Ⅱ以及青霉素诱导克雷伯氏菌、变形杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌等产生β—内酰胺酶。酶的活性用分光光度计在255nm时,测定其光密度的变化,或者用改良的Novick微量碘量法测定之。首先测定CP—45,899抑制革兰氏阴性菌五种不同类型的β—内酰胺酶水解氨苄青霉素的能力。试验表明,该化合物对Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型的β—内酰胺酶显示了高度的抑制活性。抑制作用与浓度相关,抑制剂的浓度增加4倍,抑制作用只增加2～3倍。如果预先培养Ⅲ型     

D-氨基酸氧化酶在巴斯德毕赤酵母中的表达研究

用分子生物学方法获得了D-氨基酸氧化酶(DAAO)的表达质粒(pPIC3.5k-DAAO),用其电转化巴斯德毕赤酵母GS115获得重组菌,经筛选获得高表达菌株PD27,并对其高密度培养和诱导条件进行了优化.PD27工程菌经250ml摇瓶发酵得到的DAAO活力达到2500～2600IU/L,在14L发酵罐中的表达水平优于其它表达系统.     

DPA对细胞壁缺陷枯草芽胞杆菌耐热性影响的研究

目的探讨吡啶二羧酸(DPA)对细胞壁缺陷枯草芽胞杆菌耐热性的影响。方法用β-内酰胺抗生素诱导枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)成为L型并传代培养获得稳定L型纯培养物,采用形态学方法、紫外分光光度法及热稳定性试验检测稳定L型的芽胞、DPA及耐热性。结果在稳定L型不能发现典型形态的芽胞,但可检测到DPA合成代谢活性以致DPA在菌细胞内大量堆积。L型细胞内虽然存在有大量的DPA,但却不能增强其对高温杀菌的抵抗力。结论枯草芽胞杆菌稳定L型丧失形成芽胞的能力,但能合成DPA。然而稳定L型繁殖体细胞内的DPA并不能增强菌细胞对热的耐受能力,DPA增强蛋白质热稳定性的反应需要在芽胞内进行和完成。     

铜绿假单胞菌L型的诱导及其产绿脓菌素能力的研究

目的采用哌拉西林诱导铜绿假单胞菌变异为L型,并研究其L型产绿脓菌素的能力。方法采用平板纸片法和液体浓度梯度法,利用哌拉西林药物纸片诱导铜绿假单胞菌标准菌株变异为L型;通过绿脓菌素试验测定铜绿假单胞菌L型的绿脓菌素产生能力。结果铜绿假单胞菌L型可被哌拉西林诱导为L型,铜绿假单胞菌L型仍具有产生绿脓菌素的能力,但产生的速度较原菌慢且量少。结论铜绿假单胞菌L型为该菌存在的重要形式,其仍能产生绿脓菌素为其致病因素之一。     

槲皮素对高糖诱导的RPE细胞凋亡的保护作用及机制

目的研究槲皮素对高糖诱导的RPE细胞凋亡的保护作用及其作用机制。方法将A-RPE19细胞系的细胞分别培养于普通培养基和高糖培养基中,其中高糖培养基内分别加入0、50、100、150 mmol/L的槲皮素,培养24 h以后用TUNEL检测各组细胞的凋亡,并根据该结果选取槲皮素的最佳作用浓度,进行caspase3的免疫荧光染色,线粒体酶复合物的活性测定。结果高糖培养的RPE细胞的凋亡指数(TUNEL阳性细胞/总细胞数)明显高于对照组,槲皮素可以明显抑制高糖诱导的RPE细胞的凋亡,其中以100 mmol/L的浓度作用效果最强,与高糖培养组相比,其差异有明显的统计学意义(P<0.05)。高糖组的caspase3的免疫荧光染色明显强于对照组和高糖+100 mmol/L槲皮素组。线粒体复合酶Ⅱ的活性各组之间并无统计学差异。高糖组的线粒体复合酶Ⅰ和Ⅳ的活性均明显低于对照组和高糖+100 mmol/L槲皮素组(P<0.05)。结论槲皮素可以抑制由高糖诱导的RPE细胞的凋亡,其作用是通过抑制caspase3的激活和线粒体保护实现的。