E1A基因对鼻咽癌细胞放射敏感性影响的初步实验研究

目的 探讨E1A基因对鼻咽癌细胞放射增敏作用及相关机制.从而为提高鼻咽癌放射治疗疗效提供实验依据.方法 经腺病毒介导,将E1A基因导入人鼻咽癌细胞系CNE2细胞.经RT-PCR鉴定,获得含E1A的阳性克隆.将未转染的CNE2细胞、转染对照空载体Ad-B-gal的CNE2细胞和转染Ad-E1A的CNE2细胞用6 MV X线分别照射0、2、4、6、 8 Gy后进行成克隆分析并绘制细胞存活曲线,计算放射增敏比.流式细胞术和RT-PCR检测转染前后的细胞周期分布以及wtp53表达情况.结果 转染后阳性克隆细胞RT-PCR结果说明E1A已整合到细胞基因组中并且稳定表达.细胞存活曲线结果显示转染E1A的CNE2细胞放射增敏比分别为1.37(D_0值比)、1.95(D_q值比)、1.46(SF_2值比).未转染及空载体转染后的CNE2细胞照射后细胞存活曲线分析结果显示无差异,D0D_qSF2值分别为1.57 Gy及1.53 Gy、1.82 Gy及1.78 Gy、0.89及0.82.流式细胞术显示细胞周期出现G_2+M期阻滞,RT-PCR结果显示E1A基因能提高wtp53的表达.结论 E1A基因能显著提高人鼻咽癌细胞的放射敏感性,其作用机制可能与E1A基因提高叭p53基因的表达和引起G2+M期阻滞有关.     

E1A基因对裸鼠移植瘤生长抑制及其初步作用机制的实验研究

目的：探讨E1A基因对人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用及其相关作用机制。方法：通过裸鼠移植瘤实验,观察E1A基因对人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤生长的的抑制作用。采用免疫组织化学染色检测E1A基因对肿瘤细胞凋亡及Survivin基因和Caspase-3基因表达的影响。结果：裸鼠移植瘤实验结果显示：Hela-E1A细胞形成的肿瘤较Hela和Hela-vect的出瘤时间晚,生长慢,瘤重小,抑瘤率分别为83.42%和84.74%。免疫组织化学染色显示：E1A基因组细胞凋亡数量较Hela和Hela-vect组明显增多,Caspase-3基因（凋亡促进因子）呈高表达,Survivin基因（调亡抑制因子）的表达明显降低。结论：E1A基因能够明显抑制人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤的生长,该作用可能与E1A基因激活Caspase-3基因和降低Survivin基因的表达有关。     

重组溶瘤腺病毒rAd-CMV-E1A的构建及其对人鼻咽癌细胞放射增敏的研究

目的:构建腺病毒rAd-CMV-E1A,将其作用于人鼻咽癌CNE-1细胞,验证目的基因E1A是否具有放射增敏作用及其作用机制.方法:使用"两步转化法",完成质粒pAd-pShuttle-CMV-E1A的构建,将其包装成腺病毒rAd-CMV-E1A;以相同的方法构建腺病毒rAd-CMV.使用噬菌斑法测定滴度.将病毒作用于CNE-1细胞,使用RT-PCR、实时荧光定量PCR检测E1A、p53、p21基因表达情况;联合X射线照射细胞,采用MTT比色法、细胞克隆形成实验、Annexin V-FITC/PI双染检测目的基因功能.结果:成功构建腺病毒rAd-CMV-E1A及腺病毒rAd-CMV,测得病毒滴度分别为1×1010pfu/ml.被转染目的基因E1A的CNE-1细胞能稳定转录E1A基因,会使p53基因转录增加,抑制p21基因转录.在2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy剂量下细胞生长抑制率rAd-CMV-E1A组高于rAd-CMV组(P<0.05);0 Gy下rAd-CMV-E1A组高于rAd-CMV组(P>0.05).射线+rAd-CMV-E1A组凋亡率最高(P<0.05).相同放射剂量下rAd-CMV-E1A组细胞存活分数低于rAd-CMV组、PBS组(P<0.05);放射增敏比:rAd-CMV-E1A组高于rAd-CMV组.结论:成功构建腺病毒rAd-CMV-E1A及腺病毒rAd-CMV,目的基因E1A在CNE-1细胞中能稳定转录,并增加靶细胞对X射线的敏感性,其机制可能是通过诱导下游p53基因高转录、抑制p21基因转录.     

E1A基因通过抑制NF-κB信号通路增加鼻咽癌细胞放射敏感性实验研究

目的 探讨E1A基因对人鼻咽癌细胞放射敏感性的影响及其可能机制。方法 通过腺病毒载体介导,将E1A基因转染至鼻咽癌CNE-2R细胞,采用RT-PCR鉴定E1A基因的表达;分别给予未转染组(PBS组)、转染空载体Ad-β-gal组(Ad-β-gal组)和转染E1A组(Ad-E1A组)的CNE-2R细胞0、2、4、6、8 Gy照射,应用克隆形成实验检测各组CNE-2R细胞放射敏感性的变化;流式细胞术检测各组细胞的凋亡;蛋白印迹法检测各组细胞NF-κB、CK2α、Bcl-2及Cleaved caspase-3蛋白的表达。结果 RT-PCR确认E1A基因已整合到CNE-2R细胞中且稳定表达;Ad-E1A组CNE-2R细胞克隆形成率明显少于PBS和Ad-β-gal组的克隆形成率,Ad-E1A组CNE-2R细胞SF2为0.217小于 PBS组和Ad-β-gal组的0.602和0.585(P<0.05),Ad-E1A组α/β值为24.68大于PBS组和Ad-β-gal组的5.268和5.132(P<0.05);流式细胞术显示单独放射可促进CNE-2R细胞的凋亡,当与E1A基因联合使用时,细胞凋亡率明显增加(P<0.05);蛋白印迹法显示E1A基因可下调NF-κB/P65、CK2α、Bcl-2和上调Cleaved caspase-3的表达。结论 E1A基因可以通过抑制CK2的表达阻断NF-κB信号通路以及促进细胞凋亡,来提高鼻咽癌细胞对放射的敏感性。     

自噬基因Beclin1对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长的影响

目的:探讨自噬基因Beclin1在裸鼠体内对人肺腺癌A549细胞成瘤性的影响。方法:将重组质粒pRNAT-U6.2/Lenti-si423和pLenex-Beclin1通过脂质体介导的方法分别转染到A549细胞中。采用实时荧光定量PCR(real-time fluorogenic quantitative-PCR,RFQ-PCR)和蛋白质印迹法分别检测转染细胞中Beclin1mRNA和蛋白的表达;MTT法检测转染细胞在体外的增殖能力。将过表达或沉默Beclin1基因的A549细胞株分别接种于裸鼠右侧腋部皮下,观察瘤体的生长速度和大小,并采用RFQ-PCR和免疫组织化学法检测瘤体组织中Beclin1mRNA和蛋白的表达。结果:转染重组质粒pLenex-Beclin1的A549细胞中Beclin1mRNA和蛋白表达量显著增加,而体外增殖能力被明显降低;转染重组质粒pRNAT-U6.2/Lenti-si423的A549细胞中Beclin1mRNA和蛋白表达量显著减少。过表达Beclin1组的裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,肿瘤体积明显缩小、质量明显减轻,移植瘤组织中Beclin1mRNA以及蛋白的相对表达量增加;而Beclin1基因沉默组的移植瘤组织中Beclin1mRNA及其蛋白的相对表达量降低。结论:自噬基因Beclin1的过表达可以抑制A549细胞在裸鼠体内的生长,有望成为肿瘤治疗的一个新靶点。     

E1A基因对人肺腺癌细胞化疗敏感性的影响 *

目的：探讨Ｅ１Ａ基因对人肺腺癌细胞的化疗增敏作用。方法：通过脂质体介导将Ｅ１Ａ基因导入人肺腺癌细胞系Ａ－ｎｉｐ９７３,经Ｇ４１８筛选获得稳定表达Ｅ１Ａ的转染细胞（Ａｎｉｐ９７３－Ｅ１Ａ）。用不同浓度顺铂、泰素及ＶＰ１６等化疗药物处理细胞,观察Ｅ１Ａ基因对人肺腺癌细胞的化疗增敏作用。结果：Ａｎｉｐ９７３－Ｅ１Ａ细胞对顺铂、泰素的敏感性显著增加,顺铂的ＩＣ５０值减少了７倍,并且敏感性随时间的延长而增加。但对ＶＰ１６,Ｅ１Ａ基因的稳定表达在该细胞系未显示增敏作用。免疫细胞化学染色显示,Ｅ１Ａ基因抑制了ＨＥＲ－２／ｎｅｕ的表达。结论：Ｅ１Ａ基因能增加人肺腺癌细胞对顺铂、泰素等化疗药物的敏感性。该作用可能与Ｅ１Ａ基因抑制ＨＥＲ－２／ｎｅｕ的表达有关。为在恶性肿瘤治疗上化疗和基因治疗联合应用的可能性提供了实验依据。     

透明质酸对鼻咽癌细胞增殖及裸鼠移植瘤生长特性的影响

研究透明质酸对鼻咽癌细胞体内外增殖特性的影响。方法以鼻咽吕ＣＮＥ－２Ｚ细胞为对象,采用增殖实验,裸鼠内成瘤实验,图像分析及免疫组化等方法,观察ＨＡ对癌细胞体内外增殖力的影响。结论ＨＡ对鼻咽癌细胞体外增殖及裸移植瘤的生长有明显促进作用,有助于进一步研究鼻咽癌的侵袭和转移机理。     

细胞色素P4502E1基因与鼻咽癌易感性分析

目的：为了探讨鼻咽癌的病因发病机理,进一步揭示鼻咽癌的易感因素,本文进行了细胞色素Ｐ４５０２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１） 基因多态性与鼻咽癌易感性关系的研究。方法：采用病例－ 对照分子流行病学方法分析１０５ 例鼻咽癌患者和９３ 例正常人体细胞ＣＹＰ２Ｅ１ 基因型。结果： 发现ＲｓａＩ和ＰｓｔＩ识别的ＣＹＰ２Ｅ１ 基因纯合子突变型（Ｃ２／Ｃ２） 在鼻咽癌人群为５－７ ％ ,显著高于正常人群（１－１％ ） 分布（χ２ ＝ ４－８６ ,Ｐ＜ ０－０５） ;携带Ｃ２／Ｃ２ 基因型个体发生鼻咽癌的危险性比携带其它基因型个体高５ 倍左右。结论：ＣＹＰ２Ｅ１ 基因的多态性可能是鼻咽癌易感的因素之一。     

E1A基因对喉癌细胞系放射敏感性的影响及机制的初步实验研究

目的 探讨ElA基因对喉癌细胞系(Hep-2细胞)放射敏感性的影响并初步探讨其机制.方法 以腺病毒为载体将E1A基凶及其空载体转染至人Hep-2细胞,经RT-PCR法鉴定获得含ElA的阳性兜隆.设未转染组(PBS)、转染空载体组(Ad-β-gal)和转染组(Ad-E1A),分别给予6 MVx线单次照射0、1、2、4、6、8、10 Gy,成克降实验绘制细胞存活曲线并计算D0、Dq、α、β值以观察E1A基因对Hep-2细胞放射敏感件的影响.设PBS组、Ad-β-gal组、Ad-E1A组、PBS+照射组、Ad-β-gal+照射组、Ad-E1A+照射组,单次照射6 Gy,流式细胞仪检测细胞凋亡及RT-PCR检测血管内皮牛长因子(VEGF)水平并半定量VEGF以初步探讨机制.结果 转染后的阳性克隆细胞RT-PCR结果显示E1A已整合到细胞基因组中并且稳定表达.Ad-E1A组、Ad-β-gal组、PBS组细胞的D0值分别为0.86、1.96、1.98 Gy,Dq值分别为1.02、1.97、1.99 Gy,α值分别为0.536、0.112、0.104(Gy-1)和β值分别为0.521、0.137、0.125(Gy-2).PBS组、Ad-β-gal组、Ad-ElA组、PBS+照射组、Ad-β-gal+照射组、Ad-E1A+照射组的细胞凋亡率分别为1.26%、1.18%、2.16%、2.55%、2.96%、4.96%.Ad-E1A组、PBS+照射组、Ad-βgal+照射组及Ad-ElA+照射组VEGF的表达水平较PBS组及Ad-β-gal组低,且Ad-E1A+照射组表达最低.结论 成功构建了稳定表达E1A基因的喉癌细胞系.EIA基因对人喉癌细胞有放射增敏作用,其机制可能与降低VEGF表达和促进细胞凋亡有关.     

细丝蛋白A抑制荷人结肠腺癌细胞SW480裸鼠移植瘤的生长

目的:探讨细丝蛋白A(fi lamin A,FLNa)基因对人结肠腺癌SW480细胞在裸鼠体内成瘤的影响及其可能的机制。方法:将重组载体质粒pcDNA3.1/V5-His-TOPO/FLNa通过脂质体介导的方式转染到SW480细胞中,RT-PCR和蛋白质印迹法检测SW480/FLNa细胞中FLNa mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞的体外增殖能力。将SW480/FLNa、SW480/pcDNA3.1和SW480细胞接种于裸鼠皮下,观察移植瘤的生长情况,计算抑瘤率,HE染色观察移植瘤组织的形态学变化,RT-PCR和蛋白质印迹法检测移植瘤组织中基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)mRNA和蛋白的表达水平。结果:FLNa基因在SW480细胞中获得稳定表达,SW480/FLNa、SW480/pcDNA3.1和SW480细胞的体外增殖能力相似;SW480/FLNa组移植瘤的生长速度和质量低于SW480组,抑瘤率为(88.7±3.5)%(P=0.000);SW480/FLNa组移植瘤组织出现退变坏死,MMP-9mRNA和蛋白的表达水平(0.11±0.02和0.02±0.00)均低于SW480组(1.12±0.02和1.25±0.05),差异均有统计学意义(P=0.012,P=0.025)。结论:FLNa基因具有抑制人结肠腺癌SW480细胞在裸鼠体内的生长作用,其作用机制可能与下调MMP-9的表达有关。     

c-jun基因沉默对放射抗拒鼻咽癌裸鼠移植瘤生长及血管生成的影响

目的 探讨c-jun基因沉默对人鼻咽癌放射抗拒CNE-2R细胞裸鼠移植瘤生长及血管生成的影响。方法 用携带shRAN慢病毒载体感染CNE-2R细胞以沉默c-jun基因,构建c-jun-shRNA-CNE-2R细胞组（c-jun-shRNA组）以及阴性对照NC-shRNA-CNE-2R细胞组（NC组）,以CNE-2R细胞为空白对照组,采用Western blot 检测3组细胞中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）蛋白的表达水平。构建裸鼠模型,观察3组细胞裸鼠皮下种植瘤生长曲线及体积;采用免疫组化法检测移植瘤组织中VEGF、CD34的表达,并检测组织内微血管密度（microvessel density,MVD）。结果 Western blot 结果显示,c-jun-shRNA组细胞VEGF蛋白表达较NC组及空白对照组明显下调（P<0.05）。裸鼠模型实验中,c-jun-shRNA组移植瘤体积为（720.85±72.10） mm³,质量为（0.42±0.04）g,MVD为11.69±3.30;NC组移植瘤体积为（1 196.81±90.69） mm³,质量为（0.80±0.08）g,MVD为32.56±7.33;空白对照组移植瘤体积为（1 203.76±100.42） mm³,质量为（0.83±0.05）g,MVD为35.45±4.87;c-jun-shRNA组种植瘤体积、质量、MVD较NC组和空白对照组低（P<0.05）。免疫组化检测结果显示,移植瘤组织中VEGF蛋白表达c-jun-shRNA组呈弱阳性,NC组及空白对照组组均呈强阳性。结论 c- jun基因沉默可抑制放射抗拒性鼻咽癌移植瘤生长及血管生成。     

初治鼻咽癌调强放疗与常规放疗毒副反应同期对比分析

目的通过观察初治鼻咽癌患者放疗的毒副反应,比较分析调强放疗与常规放疗放射反应的差异。方法观察2009年2月-2011年3月80例初治鼻咽癌患者放疗后出现的毒副反应,主要观察急性皮肤反应、急性口咽黏膜反应、血液毒性、张口受限及口干症状。结果调强组患者的急性皮肤反应、口干、张口受限的症状明显低于常规组,差异有统计学意义;口腔黏膜急性反应、血液毒性与常规组无明显差异。结论调强放疗与常规放疗比较,可明显降低急性放射性皮炎、口干及张口受限的发生,而口腔黏膜炎及血液毒性则无明显改善。     

3-溴丙酮酸对人胃癌细胞裸小鼠皮下种植瘤的作用机制

目的探讨3．溴丙酮酸（3-Bromopyruvicacid,3-BrPA）对人胃癌细胞株SGC-7901裸鼠皮下种植瘤的抑制作用及其机制。方法建立人胃癌裸鼠皮下种植瘤模型,将成瘤后的裸鼠随机分为实验组：3-BrPA低剂量、3-BrPA中剂量、3-BrPA高剂量组;PBS（磷酸盐缓冲液）阴性对照组1（pH7．4）,PBS阴性对照组2（pH6．8～7．8）;阳性对照5-Fu组。每天于瘤体周围皮下注射给药,连续4周,停药24h后取出瘤体并检测瘤体细胞中己糖激酶的活性,分别用免疫组化sP法和Westernblot法检测cleavedcaspase-3、bax、bcl-2和p53蛋白的表达。结果随着3-BrPA剂量的增加,瘤体细胞中己糖激酶的活性逐渐下降,并呈剂量依赖性。3-BrPA给药组的p53、bcl-2蛋白表达下降,而bax、caspase-3（P17KD）蛋白表达升高,与PBS阴性对照组相比差异均有统计学意义（尸〈0．05）。结论3-BrPA诱导人胃癌细胞株SGC-7901裸鼠皮下种植瘤细胞凋亡的机制可能是通过抑制细胞内的己糖激酶活性,上调bax蛋白的表达,下调p53、bcl-2蛋白的表达,最终活化caspase-3而引起的。     

Mebendazole inhibits growth of human adrenocortical carcinoma cell lines implanted in nude mice

Adrenocortical carcinoma is a rare tumor of the adrenal gland which requires new therapeutic approaches as its early diagnosis is difficult and prognosis poor despite therapies used. Recently, mebendazole has been proved to be effective against different cancers. The aim of our study was to evaluate whether mebendazole may result therapeutically useful in the treatment of human adrenocortical carcinoma. We analyzed the effect of mebendazole on human adrenocortical carcinoma cells in vitro and after implantation in nude mice. In order to clarify mechanisms of mebendazole action, metastases formation, apoptosis and angiogenesis were also investigated. Mebendazole significantly inhibited cancer cells growth, both in vitro and in vivo, the effects being due to the induction of apoptosis. Moreover, mebendazole inhibited invasion and migration of cancer cells in vitro, and metastases formation in vivo. Overall, these data suggest that treatment with mebendazole, also in combination with standard therapies, could provide a new protocol for the inhibition of adrenocortical carcinoma growth.     

ALDH1A1基因表达沉默对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用

目的：探讨干扰乙醛脱氢酶1A1（ALDH1A1）基因表达后对鼻咽癌5-8F和CNE2细胞生长、增殖的影响。方法：构建ALDH1A1 siRNA 表达质粒稳定转染鼻咽癌5-8F和CNE2细胞,Western blot 检测干扰ALDH1A1基因蛋白表达水平。MTT、平板克隆、裸鼠成瘤实验检测干扰ALDH1A1基因前后鼻咽癌5-8F和CNE2细胞的增殖、克隆及成瘤能力。结果：与空白组和阴性对照组相比,干扰ALDH1A1表达后5-8F和CNE2细胞增殖、克隆及肿瘤形成能力明显受到抑制。结论：干扰ALDH1A1基因表达,可抑制鼻咽癌细胞的生长、增殖、克隆及成瘤能力。     

结直肠癌中 RASSF1A 启动子甲基化与Cyclin D1和P53表达的关系

目的： 检测结直肠癌组织中Ras相关区域家族1A（ras-association domain family 1A, RASSF1A )基因启动子甲基化以及Cyclin D1和P53蛋白的表达,分析它们与结直肠癌临床病理特征的关系。 方法： 收集2008年8月至2009年8月长海医院病理科37例结直肠癌组织和14例癌旁组织(癌灶边缘5 cm以外组织）标本。甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR,MSP）检测结直肠癌组织中 RASSF1A 基因启动子的甲基化,免疫组织化学法检测结直肠癌组织中 Cyclin D1和P53蛋白的表达,分析 RASSF1A 启动子甲基化、Cyclin D1和P53表达的关联性以及三者与结直肠癌临床病理特征的相关性。 结果： 37例结直肠癌组织中 RASSF1A 启动子甲基化有23例（62.16%）,14例癌旁组织中 RASSF1A 启动子甲基化有12例（85.71%）;37例癌组织中Cyclin D1阳性14例（37.84%）、P53阳性15例（40.54%）,14例癌旁组织中Cyclin D1和p53表达均为阴性。直肠癌组织中 RASSF1A 启动子甲基化阳性率高于结肠癌（P<0.05）。结直肠癌患者年龄与Cyclin D1表达呈负相关（P<005）,淋巴结转移与P53表达呈正相关（P<0.05）。结直肠癌组织中 RASSF1A 启动子甲基化与Cyclin D1和P53的表达无相关性。 结论： RASSF1A 启动子甲基化、Cyclin D1和P53蛋白表达三者的联合检测对研究结直肠癌的发生、发展有一定意义。     

内皮抑素抑制SKOV3细胞生长及其在裸鼠皮下移植瘤中的作用机制

目的:探讨内皮抑素对卵巢癌SKOV3细胞及其荷瘤鼠卵巢癌组织的生长作用及机制。方法:MTT法观测内皮抑素对体外SKOV3细胞的抑制作用,透射电镜观察细胞凋亡、免疫细胞化学检测SKOV3;细胞中bcl-2和bax蛋白表达;将SKOV3细胞移植至裸鼠皮下,观察内皮抑素对皮下移植瘤生长的影响;TUNEL和电镜法观察肿瘤细胞的凋亡,免疫组织化学和RT-PCR法检测瘤组织中bcl-2和bax的表达。结果:内皮抑素具有体外抑制SKOV3细胞增殖的作用(P<0．01);能诱导SKOV3细胞凋亡,但对bcl-2和bax的表达无明显影响。内皮以抑素能抑制裸鼠皮下移植瘤的生长(P<0．05);其中bcl-2的表达低于对照组,而bax表达无明显改变。结论:内皮抑素具有抑制SKOV3细胞及皮下移植瘤生长的作用,其机制可能与诱发细胞凋亡和调节bcl-2／bax表达相关。