恶性疟原虫FCC-1/HN株裂殖子表面抗原2(MSA-2)基因在卡介苗BCG中的表达

目的 :裂殖子表面抗原 2基因 (Merozoitesurfaceantigen 2 ,MSA2 )是恶性疟原虫的一种保护性抗原 ,为研究其重组BCG疫苗的保护作用 ,首先探讨携带有恶性疟原虫FCC 1 HN株MSA2基因的重组分枝杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pBCG MSA2在卡介苗 (BacillusCalmetteGuerin ,BCG)中的表达情况。方法 :采用电穿孔转化法将重组质粒pBCG MSA2导入BCG中 ,通过卡那霉素抗性筛选并经PCR鉴定的重组BCG培养于Middlebrook 7H9Broth (M7H9)培养基 ,并添加 10 %M7H9EnrichmentADC和 0 0 5 %Tween80 ,4周后于 4 5℃进行诱导表达 ,表达产物进行十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis,SDS PAGE)及免疫印迹 (Western blot)分析。结果 :SDS PAGE及Western blot分析结果均显示在约 31kDa的位置上可见明显的蛋白条带 ,并与MSA2基因编码序列推断的分子量相符。结论 :恶性疟原虫裂殖子表面抗原 2可在BCG中表达 ,这些结果将为恶性疟原虫多价BCG疫苗的研制提供科学依据     

在大肠杆菌中表达恶性疟原虫裂殖子表面抗原及一些异常现象的探讨

将我国恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＡ１第二区基因（ＭＳＡ１Ｒ２）和ＭＳＡ２全基因克隆入ｐＷＲ４５０－Ｉ表达载体中，在大肠杆菌中表达了ＭＳＡ１Ｒ２和ＭＳＡ２与β－半乳糖苷酶的融合蛋白，分子量分别为７２ｋＤ和９４ｋＤ，约占菌体蛋白总量的２５—３０％和５—８％。用兔抗恶性疟原虫血清进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，诱导的ｐＷＲ－ＭＳＡ１Ｒ２和ｐＷＲ－ＭＳＡ２工程菌分别在７２ｋＤ和９４ｋＤ处出现与抗恶性疟抗体反应的特异染色区带，而未经诱导的工程菌和ｐＷＲ４５０Ｉ转化菌则无反应。对ＭＳＡ２－ｐＷＲ工程菌在诱导后出现的工程菌生长缓慢、表达量低、表达产物分子量偏大等异常现象进行了分析。     

在大肠杆菌中表达恶性疟原虫裂殖子表面抗原及一些异常现 …

将我国恶性疟原虫ＰＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＡ１第二区基因（ＭＳＡ１Ｒ２）和ＭＳＡ２全基因克隆入ｐＷＲ４５０－１表达载体中，在大肠杆菌中表达了ＭＳＡ１Ｒ２和ＭＳＡ２与β－半乳糖苷酶的融合蛋白，分子量分别为７２ｋＤ和９４ｋＤ，约占菌体蛋白总量的２５￣３０％和５￣８％。用兔抗恶性疟原虫血清进行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析，诱导的ｐＷＲ－ＭＳＡ１Ｒ２和ｐＷＲ－ＭＳＡ２工程菌分别在７２ｋＤ和９４ｋＤ处出现与抗恶     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1羧基端编码基因真核表达重组克隆的构建

目的构建以恶性疟原虫红内期重要的疫苗候选抗原——裂殖子表面蛋白１（ＭＳＰ１）羧基端编码分子量４２０００蛋白的基因片段为外源基因的可用作候选核酸疫苗的真核表达载体。方法目前对疟疾核酸疫苗的研究仅见于鼠疟，将恶性疟原虫ＦＵＰ株裂殖子表面蛋白１羧基端编码４２０００蛋白的基因片段用常规分子克隆方法，分别克隆入非分泌性真核表达载体ＶＲ１０１２和改建后的分泌型载体ＶＲ１０１２／ＴＰＡ中，通过ＰＣＲ和酶切鉴定出重组克隆。结果成功地构建了真核表达载体ＶＲ１０１２／ＭＳＰ１－４２和ＶＲ１０１２／ＴＰＡ／ＭＳＰ１－４２。结论目前对疟疾核酸疫苗的研究仅见于鼠疟红外期，该研究对研制有效的恶性疟原虫红内期核酸疫苗是一个有益的尝试。其免疫保护作用待进一步研究。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1羧基端编码基因真核表？…

构建以恶性疟原虫红内期重要的疫苗候选抗原－裂殖子表面蛋白羧基端编码分子量４２０００蛋白的基因片段为外源基因的可用作候选核酸疫苗的真核表达载体。方法目前对疟疾核酸疫苗的研究仅见于鼠疟，将恶性疟原虫ＦＵＰ株裂殖子表面蛋白１羧基端编码４２０００蛋白的基因片段用常规分子克隆方法，分别克隆入非分泌性真核表达载体ＶＲ１０１２和改建后的分泌型载体ＶＲ１０１２／ＴＡ中，通过ＰＣＲ和酶切鉴定出重组克隆。     

恶性疟原虫裂殖子表面主要蛋白对裂殖子入侵人红细胞的…

恶性疟原虫裂殖了表面主要蛋白－１（ＭＳＡ１），又称Ｐ１９５，与人红细胞具有结合作用，这种结合是裂殖子主只别红细胞的基础，为了确定Ｐ１９５蛋白与识别的位点，本研究在大肠杆菌中分８段达了ＭＡＤ２０株恶性疟原虫的Ｐ１９５蛋白。各段蛋白用镍亲和层析柱分离，然后复性，在体外培养疟原虫至成熟裂殖体期，将各种段蛋白分别加入到培养基上清中，继续培养２４小时，检查红细胞感染率，通过感染率了解各段蛋白对裂殖入子侵红细     

恶性疟原虫海南株裂殖子表面蛋白1基因第1至第4区的多态性分析

本对5株恶性疟原虫海南株MSP1基因5'端（第1～第4区）进行体外扩增，其中2株的目的基因扩增产物直接用末端标记循环测序法测定其DNA序列，另3株虫株的目的基因片段用pGEM-T载体克隆化后再测序，结果获得了6个MSP1分子第1～第4区的序列片段，与已报告的MSP1分子比较，证明属MAD20等位基因型。同时发现，6个序列片段中，除了HN3和HN5株的序列彼此完全一致，其余株序列的保守区（第1和第3区）也一致外，可变区的第2区和第4区的氨基酸序列存在一定的差异，与MAD20的序列也略有不同，序列分析也证明海南株的MSP1也存在基因内重组现象，此外，3株经克隆化处理的虫株中，发现1株含2种不同的MSP1等位基因，本研究初步提供了我国恶性疟原虫海南株MSP1存在多态性的依据。     

我国恶性疟原虫裂殖子表面蛋白MSP-2的抗原表位分析

根据我国恶性疟原虫株MSP-2基因序列,检索我国虫株MSP-2是否具有国外已鉴定的MSP-2抗原表位。结果显示,我国虫株MSP-2具有已鉴定的FC-27等位基因型可变区抗原表位STNS和DTPTATE。同时应用计算机辅助抗原表位分析技术对MSP-2进行抗原表位分析预测,并以合成肽技术鉴定了预测表位的免疫原性。抗原指数分析表明,MSP-2分子亲水性指数和侧链易曲性指数最高的区域分别位于aa153～166和aa65～72,而aa53～60可能是我国虫株特异的抗原表位。用4个合成肽进行免疫学鉴定,证实预测的表位可以诱导抗肽抗体反应,免疫血清可识别重组MSP-2和恶性疟原虫全抗原中MSP-2抗原区带,且合成肽可与我国流行区高度免疫人群免疫血清反应。由于这些表位存在于我国海南、云南、安徽株MSP-2序列中,可以作为研制我国恶性疟重组多价表位疫苗的候选抗原表位。     

恶性疟原虫FCC-1／HN株EBA-175基因特异序列的克隆及其鉴定

根据恶性疟原虫红细胞结合抗原EBA-175基因编码序列设计并合成一对引物，通过聚合群链反应(PCR)技术对恶性疟原虫FCC-1／HN株的EBA-175基因进行扩增，用HindⅢ和BarnHⅠ同时消化扩增产物，定向克隆PCDN3载体，转化至感受态大肠杆菌TG1，经抗性筛选和质粒大小快速凝胶电泳鉴定初步获得重组克隆，再经PCR鉴定和HindⅢ／BarnHⅠ酶切鉴定，证实所得的重组克隆含有编码恶性疟原虫FCC-1／HN株EBA-175基因部分序列。     

恶性疟原虫FCCl／HN株MSAl全基因编码区的体外扩增

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSA1)是抗疟疫苗的候选抗原之一。据已知的MSAl基因序列,自行设计合成了四对引物。应用PCR技术,分四段从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中扩增出垒基因编码区序列。扩增产物经1．2％琼脂塘凝腔电泳鉴定．表明获得了正确的MSA1基因扩增片段。     

Antibodies to a non-repeat region of Plasmodium falciparum antigen Pf155/RESA in individuals from malaria-endemic areas.

Human antibodies to the repeat regions of the Plasmodium falciparum asexual blood stage antigen Pf155/RESA interfere with parasite growth in vitro, but the significance in this respect of antibodies to non-repetitive epitopes is less clear. In this study the levels of antibodies to a non-repetitive part of Pf155/RESA (residue 199-221) in malaria-exposed individuals were analysed, as was the parasite-inhibitory capacity of such antibodies. Residue 199-221 is of particular interest since it includes a sequence homologous to a cytoadherence-related motif from band 3. Sera from donors in Liberia and Tanzania were analysed for reactivity in ELISA with synthetic peptides together overlapping this part of Pf155/RESA. High antibody reactivity was observed in most of the sera with two peptides including residues 199-211 and 202-214, respectively. Specific antibodies were affinity-purified from selected sera using these peptide sequences and were shown to react with Pf155/RESA by immunofluorescence and Western blotting. The purified antibodies were furthermore shown to inhibit parasite growth in vitro. The results suggest that both repeat and non-repeat epitopes in Pf155/RESA elicit antibodies with potential to protect against malaria infection.     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1的17区片段基因复合核酸疫苗诱导小鼠抗体免疫性的研究

目的　检测以恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 1的 17区片段基因为基础的复合核酸疫苗(分泌性的VR10 12 /TPA/HG MSP1 17和非分泌性的VR10 12 /HG MSP1 17)诱导小鼠的体液免疫反应和免疫血清对疟原虫生长的抑制能力。方法　以 2 0 0 μg/10 0 μl或 10 0 μg/10 0 μl每次每只VR10 12 /HG MSP1 17或VR10 12 /TPA/HG MSP1 17肌注免疫BALB/c或C5 7BL/6小鼠。用ELISA间接法测定小鼠血清的特异性抗体 ,用体外抑制试验检测免疫血清抑制疟原虫生长效果。结果　经 3次 10 0 μg/10 0 μl每次每只VR10 12 /HG MSP1 17免疫后 ,BALB/c小鼠和C5 7BL/6小鼠均产生了明显的HG和YMSP119抗体。但总体抗体水平不高。BALB/c小鼠经 3次 2 0 0 μg/10 0 μl每次每只的VR10 12 /HG MSP1 17免疫后 ,产生了较高的HG抗体 ,但MSP1 17的抗体无明显变化 ,经 3次 2 0 0 μg/10 0 μl每次每只VR10 12 /TPA/HG MSP1 17免疫后 ,仅产生较低的HG抗体 ,无MSP1 17抗体的产生。用 2 0 0 μg/10 0 μlVR10 12 /HG MSP1 17免疫的BALB/c小鼠血清做体外抑制试验 ,结果抑制效果明显。结论　VR10 12 /HG MSP1 17比VR10 12 /TPA/HG MSP 17具有更强的免疫原性 ,其免疫鼠血清能明显地抑制疟原虫生长     

BCG/恶性疟MSP-2、CSP多价疫苗免疫小鼠应答类型研究

目的：探讨恶性疟原虫FCC－1／HN株裂殖子表面蛋白－2（MSP－2）和环子孢子蛋白（CSP）与BCG多价疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法：将重组pBCG／MSP－2和pBCG／CSP多价疫苗经皮下注射BALB／c小鼠，小鼠经多价疫苗免疫8周后，用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化，并体外培养脾脏细胞，用夹心ELISA法测定IFN－γ和IL－2的产生；用血清学方法测定免疫鼠IgG抗体的动态变化，在体外测定抗体介导的抑制实验。结果：与对照组相比，疫苗组CD4^ 和CD8^ T淋巴细胞有显著性的增高，体外培养的脾脏细胞IFN－γ有高浓度的分泌。同时，免疫鼠血清对疟原虫抗原都表现了较高水平的IgG类抗体反应，抗体对原虫的增殖明显抑制。结论：恶性疟原虫FCC－1／HNpBCG/MSP-2和pBCG/CSP多价疫苗诱导了以TH1为主的免疫应答类型。     

Monoclonal antibodies that inhibit Plasmodium falciparum invasion in vitro recognise the first growth factor-like domain of merozoite surface protein-1

A major protein found on the surface of the invasive stage of the malaria parasite Plasmodium falciparum, merozoite surface protein-1 (MSP1), has been proposed as a vaccine candidate. Antibodies which recognise a single fragment of this molecule (MSP1₁₉), composed of 2 regions related to epidermal growth factor (EGF), also inhibit parasite growth in vitro. It is shown by direct expression of the individual EGF-like domains in Escherichia coli, that the first domain is the target of growth-inhibitory antibodies. A single amino acid difference influences the binding of some antibodies to this domain.     

恶性疟复合多价抗原基因在小鼠中免疫应答的初步研究

目的探索恶性疟复合多价ＤＮＡ疫苗的可行性。方法把带有ＡＴＧ的接头与人工合成的恶性疟原虫复合多价抗原基因ＡＢ相连后，构建分别带有ＳＶ４０或ＲＳＶ启动子的真核表达载体ｐＳＶ２／ＡＢ及ｐＲＥＰ９／ＡＢ，重组表达质粒经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后，检测其诱发特异性体液和细胞免疫应答水平及毒副作用。结果ｐＳＶ２／ＡＢ及ｐＲＥＰ９／ＡＢ免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后均诱发了一定水平的细胞及体液免疫应答，带ＲＳＶ启动子的ｐＲＥＰ９／ＡＢ免疫原性略强于带ＳＶ４０启动子的ｐＳＶ２／ＡＢ，ＤＮＡ免疫后未见明显的毒副作用。结论恶性疟复合多价ＤＮＡ疫苗可诱发特异的免疫应答，为疟疾ＤＮＡ疫苗的研究提供了一定的理论及实验依据     

The Plasmodium vivax homologues of merozoite surface proteins 4 and 5 from Plasmodium falciparum are expressed at different locations in the merozoite

Merozoite surface proteins of Plasmodium falciparum are one major group of antigens currently being investigated and tested as malaria vaccine candidates. Two recently described P. falciparum merozoite surface antigens, MSP4 and MSP5, are GPI-anchored proteins that each contain a single EGF-like domain and appear to have arisen by an ancient gene duplication event. The genes are found in tandem on chromosome 2 of P. falciparum and the syntenic region of the genome was identified in the rodent malarias P. chabaudi, P. yoelii and P. berghei. In these species, there is only a single gene, designated MSP4/5 encoding a single EGF-like domain similar to the EGF-like domain in both PfMSP4 and PfMSP5. Immunization of mice with PyMSP4/5 provides mice with high levels of protection against lethal challenge with blood stage P. yoelii. In this study, we show that in P. vivax, which is quite phylogenetically distant from P. falciparum, both MSP4 and MSP5 homologues can be found with their relative arrangements with respect to the surrounding genes mostly preserved. However, the gene for MSP2, found between MSP5 and adenylosuccinate lyase (ASL) in P. falciparum, is absent from P. vivax. The PvMSP4 and PvMSP5 genes have a two-exon structure and encode proteins with potential signal and GPI anchor sequences and a single EGF-like domain near the carboxyl-terminus. Rabbit antisera raised against purified recombinant proteins show that each of the antisera react with distinct proteins of 62 kDa for PvMSP4 and 86 kDa for PvMSP5 in parasite lysates. Indirect immunofluorescence assays (IFA) localized PvMSP4 over the entire surface of P. vivax merozoites, as expected, whereas, the MSP5 homologue was found to be associated with an apical organellar location consistent with micronemes or over the polar prominence.