IGFBP2、IGFBP6在TGF-β1活化的肝星状细胞中表达

目的： 观察胰岛素样生长因子结合蛋白2、6（IGFBP2、IGFBP6）在转化生长因子β₁（TGF-β₁）诱导活化后的肝星状细胞中的表达变化。方法：大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）体外培养，分别设立空白对照组（加入等量PBS）、不同浓度的TGF-β₁ 处理组，处理因素作用24 h，采用免疫细胞化学染色、Western blotting检测IGFBP2、IGFBP6在HSC-T6中的表达。结果：免疫细胞化学染色及Western blotting结果发现，TGF-β₁各处理组IGFBP2、IGFBP6的表达均较空白对照组显著增强。结论：IGFBP2、IGFBP6在TGF-β₁诱导活化后的HSC-T6中表达明显增强，IGFBP2、IGFBP 6可能参与了肝纤维化的形成。     

IGFBP-rP1对肝星状细胞活化及核因子-KB活性的影响

目的:明确胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBP-rP1)是否具有活化肝星状细胞(HSC)、增加细胞外基质(ECM)合成的作用;并探讨可能的信号转导途径.方法:大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)体外培养,分别设立空白对照组(加入等量PBS)和不同浓度的IGFBP-rPl处理组,干预因素处理24 h后收集细胞爬片或制备单细胞悬液,采用免疫细胞化学染色观察HSC-T6中Ot-平滑肌肌动蛋白(、I型胶原(colla-gen I)、纤维连接蛋白(FN)的表达变化;流式细胞仪检测HSC-T6中核因子-KB v65(NF-KB p65)的DNA结合活性.结果:免疫细胞化学染色结果发现,IGFBP-rPl各处理组、collagen I、FN的表达均较空白对照组显著增强,且在一定范围内呈剂量依赖关系;流式细胞仪检测结果显示,IGFBP-rPl各处理组NF-KB p65阳性细胞百分数均较空白对照组明显增高.结论:IGFBP-rPl可以激活HSC,且在一定剂量范围内随着IGFBP-rPl剂量的增加HSC活化的程度逐渐增强;IGFBP-rPl可使ECM的重要组成成分collagen l和FN的合成增加;IGFBP-rPl可增强HSC中NF-KB p65的DNA结合活性.     

CCl4促进大鼠肝星状细胞增殖及TGF-β1基因表达

目的进一步阐明四氯化碳(CCl4)引起肝纤维化的分子机制。方法用RT-PCR方法检测转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA在肝星状细胞(HSC)的表达,用Western blot检测TGF-β1蛋白表达。用MTT法和流式细胞术检测细胞增殖和周期分布。结果CCl4作用于HSC后,细胞的增殖能力增加,细胞周期分布显示G0/G1期细胞减少而G2/M期细胞增多。同时,TGF-β1蛋白及mRNA的表达量明显增加。结论一定浓度的CCl4能够促进HSC增殖,上调TGF-β1蛋白及mRNA的表达,这可能是CCl4导致肝纤维化的分子机制之一。     

丹参素对肝星状细胞TGF-β信号转导的影响

目的： 观察丹参素对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导活化的大鼠肝星状细胞(HSCs)Smad信号转导通路的影响。方法：体外分离、培养大鼠肝HSCs,用不同浓度丹参素作用于HSCs,检测丹参素对HSCs增殖和TGF-β1刺激后HSCs增殖的影响;观察丹参素对TGF-β1刺激HSCs表达α-SMA的影响;观察HSCs转化生长因子受体(TβRⅠ、Ⅱ)的表达;观察丹参素和TGF-β1作用HSCs后,其Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表达的变化。结果：(1)丹参素在0.0625 mmol/L-1 mmol/L时,对HSCs的生长增殖具有抑制作用 (P<0.05);丹参素对TGF-β1诱导的HSCs增殖也具有明显的抑制作用 (P<0.05)。(2)丹参素0.25 mmol/ L作用HSCs能下调α-SMA的表达(P<0.05),也能下调TGF-β1诱导的HSCs的α-SMA表达(P<0.05)。（3）HSCs中TβRⅠ、Ⅱ的表达定位于细胞膜上,丹参素能下调活化HSCs中TβRⅠ、Ⅱ的表达（P<0.05或P<0.01）。 (4) TGF-β1促进HSCs中Smad2、Smad3、Smad7 mRNA的表达（P<0.01）;丹参素能下调TGF-β1诱导的HSCs内Smad2、Smad3 mRNA的表达(P<0.05),并能上调Smad7 mRNA表达(P<0.05)。 结论：体外细胞实验表明,丹参素能通过下调活化HSCs细胞膜上TβRⅠ、Ⅱ蛋白的表达来抑制HSCs的活化增殖。丹参素能上调HSCs内Smad7 mRNA表达,并下调Smad2、Smad3 mRNA表达,抑制HSCs活化,并抑制TGF-β1诱导的HSCs活化。     

IGFBP-rP1对肝星状细胞活化及核因子-κB活性的影响

目的：明确胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1（IGFBP-rP1）是否具有活化肝星状细胞（HSC）、增加细胞外基质（ECM）合成的作用；并探讨可能的信号转导途径。方法：大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）体外培养，分别设立空白对照组（加入等量PBS）和不同浓度的 IGFBP-rP1 处理组，干预因素处理24 h后收集细胞爬片或制备单细胞悬液，采用免疫细胞化学染色观察HSC-T6中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMΑ）、I型胶原（collagen I）、纤维连接蛋白（FN）的表达变化；流式细胞仪检测HSC-T6中核因子-κB p65（NF-κB p65）的DNΑ结合活性。结果：免疫细胞化学染色结果发现，IGFBP-rP1各处理组α-SMΑ、collagen I、FN的表达均较空白对照组显著增强，且在一定范围内呈剂量依赖关系；流式细胞仪检测结果显示，IGFBP-rP1各处理组NF-κB p65阳性细胞百分数均较空白对照组明显增高。结论：IGFBP-rP1可以激活HSC，且在一定剂量范围内随着IGFBP-rP1剂量的增加HSC活化的程度逐渐增强；IGFBP-rP1可使ECM的重要组成成分collagen I和FN的合成增加；IGFBP-rP1可增强HSC中NF-κB p65的DNΑ结合活性。     

新城疫病毒感染活化的人肝星状细胞系LX-2

目的探讨新城疫病毒(NDV)在活化肝星状细胞(HSC)中的复制情况。方法用转化生长因子β1(TGF-β1)刺激人肝星状细胞LX-2,MTT法检测细胞的增殖率,RT-PCR检测活化相关基因的mRNA表达。用NDFLtag-EGFP感染不同传代的LX-2细胞和原代分离培养以及TGF-β1刺激活化的HSC,荧光显微镜观察NDV在细胞中的复制。用流式细胞术(FACS)检测NDFLtag-EGFP和NDV-Italien在LX-2细胞中的复制。结果 TGF-β1能够刺激LX-2细胞的活化。NDV随着LX-2细胞的连续传代活化以及TGF-β1刺激活化,其在细胞中的复制率也逐渐增加,分别从(15.65±0.92)%增加到(23.05±1.5)%、从(12.8±1.4)%增加到(22.7±1.7)%(P<0.05)。原代分离培养的小鼠HSC,随着细胞的传代次数增加和TGF-β1的刺激,NDV也表现出较高的复制效率。结论 NDV能在活化的HSC中高效复制,LX-2的活化易化了NDV在其中的复制。     

TGF-β1诱导大鼠肝星状细胞系HSC-T6活化及上皮间质转换

目的探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)在大鼠肝星状细胞系(HSC-T6)活化及上皮间质转换(EMT)中的作用。方法体外培养HSC-T6,用MTT法筛选TGF-β1对HSC-T6作用的最佳浓度;用10μg/L TGF-β1处理HSC-T6 24 h,相差倒置显微镜下观察细胞形态改变,免疫荧光染色法检测细胞骨架结构F-actin蛋白的表达,RT-q PCR法检测肌动蛋白α-SMA及代表上皮间质转换的神经黏附素(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和上皮黏附素(E-cadherin)基因表达;用不同浓度(0、5和10μg/L)的TGF-β1处理HSC-T6 24 h,Western blot检测α-SMA、N-cadherin、vimentin和E-cadherin蛋白表达。结果 10μg/L TGF-β1干预HSC-T6 24 h有最好的细胞存活率;TGF-β1刺激HSC-T6后,细胞拉伸,伪足增多呈星形,细胞间连接疏松,呈显著活化状态;F-actin聚集形成应力纤维丝,沿细胞长轴分布;实验组α-SMA mRNA及vimentin mRNA的表达量明显高于对照组(P0.05),而E-cadherin mRNA的表达量明显降低(P0.05);在不同浓度的TGF-β1呈剂量依赖性致α-SMA及N-cadherin和vimentin的蛋白表达量增多,而E-cadherin的蛋白表达量减少。结论 TGF-β1可诱导HSC-T6活化及上皮间质转换。     

肝纤维化启动期大鼠血清对肝星形细胞TGF-β1表达的影响

目的　研究大鼠血清与肝星形细胞表达 TGF- β1的关系 ,为临床的早期诊断和中医药治疗肝纤维化提供新的思路。　方法　制备正常大鼠血清、免疫性肝纤维化大鼠血清和益气活血复方药物血清 ,培养肝星形细胞(HSC) ,激光共聚焦显微镜定量分析其 TGF- β1的表达。　结果　 (1)造模 3周时大鼠血清使培养的 HSC中 TGF- β1表达显著增强 ,正常鼠血清、造模 5周和 7周 (即纤维化形成后 )血清没有此作用 ;(2 )添加益气活血药物血清可使造模 3周鼠血清刺激 HSC高水平表达的 TGF- β1作用消失。　结论　 (1)造模 3周鼠血清中含有强烈的刺激 HSC激活的物质 ;(2 )活血化淤方剂的作用靶点是血液中的活性物质 ,通过拮抗血液中 HSC活化物质达到抗纤维化的作用     

TGF-β/Smad信号通路在肝纤维化中的研究进展

转化生长因子β (Transforming Growth Factor-β,TGF-β) 信号通路在调节细胞进程中起着至关重要的作用。就肝脏而言,TGF-β信号通路贯穿肝脏疾病始终,即从最初的肝细胞损伤到炎症、纤维化、肝硬化直至癌症发生。TGF-β导致肝星状细胞活化为成纤维细胞,并促使大量肝细胞死亡,促进了肝纤维化向肝硬化发展,而过度激活的TGF-β信号与肝癌发展密切相关。在本综述中,作者将阐述TGF-β/Smad信号通路在肝纤维化进程中的作用机制,以及目前在实验和临床诊治方面通过TGF-β信号通路靶向治疗肝脏疾病取得的新进展。以期为研究肝纤维化提供新的论据。     

碧萝芷通过下调ERK磷酸化及自噬水平抑制TGF-β1诱导的肝星状细胞活化

目的:探究碧萝芷对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的肝星状细胞活化的影响。方法:5μg/L TGF-β1和不同浓度碧萝芷(0、10、25、50 mg/L)分别作用于LX-2细胞,在有或无自噬抑制剂3-MA和ERK抑制剂PD98059的情况下,用MTT法检测细胞活力的变化,Western blot实验检测α-SMA、ColⅠ、TIMP-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin1、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白水平的变化。结果:与对照组相比,5μg/L TGF-β1组的LX-2细胞活力以及α-SMA、ColⅠ、TIMP-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin 1、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白水平明显增加(P0.05)。而碧萝芷预处理能逆转上述效应,并呈现一定的剂量依赖性,50 mg/L碧萝芷的抑制效果最为显著(P0.05)。而且,与TGF-β1组相比较,50 mg/L碧萝芷、5 mmol/L 3-MA或者20μmol/L PD98059预处理下,TGF-β1诱导的LX-2细胞活力以及α-SMA和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达均明显下调(P0.05)。结论:碧萝芷通过下调ERK磷酸化及自噬水平抑制TGF-β1诱导的肝星状细胞活化。     

环状RNA-42398通过调控TGF-β1/Smads信号通路抑制肝星状细胞活化

目的:探讨小鼠环状RNA-42398(mmu_circ₄2398)对肝星状细胞活化的影响及机制是否与调节TGF-β1/Smads信号通路有关。方法:小鼠肝星状细胞株JS1,分成正常对照组、空载体阴性对照组(vector组)和mmu_circ₄2398过表达组(mmu_circ₄2398组),体外构建mmu_circ₄2398过表达载体,通过脂质体瞬时转染法转入JS1细胞,48 h后RT-qPCR检测mmu_circ₄2398的表达变化,PCR产物经一代测序验证其环化位点,Western blot检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原(Col I)、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad2、Smad3、p-Smad2和p-Smad3蛋白表达。结果:与vector组相比,mmu_circ₄2398组的mmu_c...     

肝纤维化大鼠部分肝切除后肝星状细胞活化和肝细胞生长因子的表达

目的：研究肝星状细胞在肝纤维化大鼠部分肝切除后的活化情况及其对肝细胞生长因子表达和肝再生的影响。方法：成年雄性SD大鼠，随机分成3组：正常组、肝纤维化组和肝纤维化大鼠部分肝切除组。其中肝纤维化大鼠部分肝切除组根据术后取材时间又分为6小组，分别于术后12h、1、3、5、7和14d取材。计算肝指数评价肝再生情况；用免疫组化、免疫荧光和免疫印迹方法检测各组大鼠肝组织中α平滑肌肌动蛋白和肝细胞生长因子的表达情况。结果：肝纤维化大鼠部分肝切除后肝指数逐渐增加，但递增速度缓慢；肝组织中α平滑肌肌动蛋白的表达呈现出先降低后升高的规律；肝细胞生长因子表达早期下降，而后升到一最高值后开始降低。结论：（1）肝纤维化大鼠部分肝切除后残肝可以再生；（2）活化肝星状细胞术后呈现出先减少后增多的规律性变化；（3）肝星状细胞可能是术后肝细胞生长因子表达和残肝再生的重要影响因素。     

丹参素对TGF-β1诱导的肝星状细胞增殖与活化的影响

目的:观察丹参素对转化生长因子-β1(TGFβ-1)诱导的肝星状细胞(HSCs)增殖与活化的影响。方法:体外分离培养大鼠HSCs,细胞分为4组:对照组、TGFβ-1组、TGFβ-1+丹参素组及丹参素组。MTT法检测HSCs增殖情况;细胞免疫化学法分析各组HSCs表达结缔组织生长因子(CTGF)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的变化。结果:与对照组比较,TGFβ-1无明显促进HSCs增殖的作用,TGFβ-1+丹参素组及丹参素组均促进HSCs增殖(P<0.05)。与对照组比较,TGF-β1能明显促进HSCs表达CTGF和α-SMA,丹参素单独作用降低CTGF和α-SMA的表达;TGFβ-1+丹参素组CTGF和α-SMA的表达低于TGFβ-1组。结论:丹参素对HSCs的增殖有抑制作用,且部分抑制TGFβ-1诱导的HSCs活化。     

PI3K/PKB信号通路在TGF-β_1诱导人肝星状细胞表达骨桥蛋白中的作用

目的:研究磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB)信号通路在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肝星状细胞表达骨桥蛋白(OPN)的调控作用。方法:体外培养LX-2人肝星状细胞株,予TGF-β1(终浓度2.5、5、10、20μg/L)刺激24 h或予TGF-β1(终浓度10μg/L)刺激12 h、24 h、48 h;先经PI3K/PKB信号通路特异性抑制剂wortmannin(0.1μmol/L)预处理1 h,再予10μg/L TGF-β1刺激24 h,收集细胞,采用real-time PCR及Western blotting法检测OPN表达情况。结果:TGF-β1能够促进LX-2细胞表达OPN,在一定浓度和时间范围内,其表达量随着TGF-β1浓度和时间的增加而增加,呈剂量和时间依赖性关系;经wortmannin预处理再予TGF-β1刺激的LX-2细胞,与对照组相比,OPN表达受到明显抑制(P0.01)。结论:TGF-β1对LX-2人肝星状细胞OPN表达具有诱导作用,此作用可能受PI3K/PKB信号通路的调控。     

胰岛素样生长因子结合蛋白2、4在实验性肝细胞损伤中的表达及意义

目的：通过观察肿瘤坏死因子α (TNF -α)和转化生长因子β1（TGF-β1）两种细胞因子所致体外培养的肝细胞损伤时胰岛素样生长因子结合蛋白2、4(IGFBP2、IGFBP4)的表达变化,探讨IGFBP2和IGFBP4在肝损伤中的作用机制。方法：对人肝细胞株HL-7702分别给予不同浓度的TNF-α、TGF-β1两种处理因素作用24 h,采用免疫细胞化学染色法观察其IGFBP2和IGFBP4的表达变化,再在相同处理培养条件下用MTT比色法检测两种细胞因子对肝细胞抑制率的影响。根据MTT及预实验结果选择TNF-α 20 μg/L作用于人肝细胞株48h,采用Annexin-Ⅴ/PI双染色流式细胞分析法和TUNEL法检测肝细胞凋亡发生率。结果：与对照组相比,各处理组IGFBP2、IGFBP4的表达均显著增加(P<0.05),其中在TNF-α 20 μg/L组和TGF-β1 4 μg/L组表达最强,且与肝细胞抑制率呈正相关关系(P<0.05 or P<0.01)。TNF-α 20 μg/L处理48 h后肝细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。结论：IGFBP2、IGFBP4参与了肝细胞的损伤过程,在TNF-α、TGF-β1介导的肝细胞损伤中具有重要作用。     

RNA干扰抑制肝星状细胞CTGF表达对细胞外基质分泌的影响

目的：利用pEGFP质粒载体构建介导结缔组织生长因子(CTGF)短发夹RNA表达的质粒，筛选有效的抑制序列后，研究其对HSC-T6中TGF-β₁、CTGF及细胞外基质表达的影响。方法:1.分别设计3对针对CTGF的有小发夹结构的两条DNA序列及1对非特异对照序列，构建重组体成功后转染HSC-T6，24 h后通过RT-PCR及Western blotting分析HSC-T6 CTGFmRNA及蛋白表达水平，筛选出有效抑制CTGF表达的序列。2.将已构建并筛选出有最高抑制效率的pEGFP-CTGFshRNA转染HSC-T6 ，培养24、48 h后用RT-PCR和/或Western blotting检测各组细胞中TGF-β₁、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因的表达;放免法分析细胞上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量。结果:将构建成功的3组pEGFP-CTGFshRNA转染肝星状细胞后，筛选出两组能高效抑制CTGF表达的序列; pEGFP-CTGFshRNA能明显抑制HSC-T6 CTGF、Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA及蛋白的表达，降低上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量(P<0.01或P<0.05)，而对TGF-β₁的基因表达则无影响。结论:pEGFP-CTGFshRNA能高效抑制肝星状细胞中CTGF及细胞外基质的表达;CTGFshRNA介导的RNA干扰有望对慢性肝病所致肝纤维化具有治疗潜力。     

肝纤维化形成过程中肝星状细胞的活化机制

肝纤维化的形成是一个多因素、多细胞参与的复杂过程,肝星状细胞(HSC)的活化可能是其中的核心环节;活化后的HSC在形态和功能上都发生了显著变化.枯否细胞、pit细胞、炎症细胞和炎症反应的旁分泌作用,HSC活化后的自分泌作用,以及基因改变、活化HSC凋亡等均参与了HSC活化过程的调节.     

缺氧在肝星状细胞激活中的作用机制

目的:探讨缺氧在肝星状细胞(HSC)激活中的作用机制.方法:缺氧培养大鼠HSC株HSC-T6,逆转录PCR检测HIF-1α、TGF-β1、Ⅰ型胶原mRNA的表达,Westren blot检测α-SMA表达.缺氧/常氧下,加TGF-β1中和抗体、HIF-1α诱导剂氯化钴(CoCl2)或抑制剂2-甲氧雌二醇(2ME2),逆转录PCR检测HSC-T6表达Ⅰ型胶原mRNA的变化.结果:缺氧能诱导HSC-T6表达HIF-1α、TGF-β1、Ⅰ型胶原mRNA及α-SMA蛋白;常氧下CoCl2能诱导HSC-T6表达Ⅰ型胶原mR-NA,TGF-β1中和抗体及2ME2能减弱缺氧诱导HSC-T6表达Ⅰ型胶原mRNA,但表达量仍高于常氧培养.结论:缺氧能激活HSC,分泌Ⅰ型胶原,增加细胞外基质沉积,其作用机制既依赖于TGF-β的胞内信号传导机制,也与HIF-α介导的信号传导有关,在肝纤维化形成中起着举足轻重的作用.     

IGFBPrP1与硫代乙酰胺对小鼠肝组织的影响及其机制

目的:通过对胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBPrP1)与硫代乙酰胺(TAA)对小鼠肝组织影响的研究,明确IGFBPrP1在肝纤维化中的作用及其机制。方法:清洁级C57BL/6野生型小鼠32只,随机分为4组:正常对照组、重组小鼠IGFBPrP1(rmIGFBPrP1)4周组、TAA2周组及TAA4周组,每组8只。取肝组织行HE、苦味酸-天狼星红及免疫组织化学染色和Westernblotting检测。结果:rmIGFBPrP14周组肝细胞广泛脂肪变性,TAA2周组出现纤维组织增生,TAA4周组病理改变较TAA2周组严重。与正常对照组相比,rmIGFBPrP14周组、TAA2周组和TAA4周组IGFBPrP1、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad3、p-Smad2/3、Ⅲ型胶原(ColⅢ)、I型胶原(ColⅠ)、纤维连接蛋白(FN)的表达增高(P0.05)。rmIGFBPrP14周组IGFBPrP1、ColⅠ和FN的表达与TAA2周组无显著差异。结论:IGFBPrP1在TAA诱导的肝纤维化形成过程中发挥重要作用,并可作为独立致病因子引起小鼠肝组织中细胞外基质生成增多,且该作用是通过TGF-β1/Smad3信号通路来实现的。     

下调肝星状细胞中SOX12的表达可抑制肝硬化

目的研究SOX12在肝星状细胞与正常肝细胞中的表达,并探讨SOX12通过介导TGF-β1(转化生长因子β1)的表达在调节肝星状细胞的活性中对肝硬化的影响。方法培养细胞LX-2(肝星状细胞)与Changliver cell(正常肝细胞),使用PCR及Western blot检测细胞中SOX12与免疫组化检查肝组织中肝硬化各项指标的表达,同时探讨SOX12与TGF-β1之间的关系;用细胞转染的方法研究抑制SOX12基因的表达后对TGF-β1的影响。结果1) SOX12蛋白在人类肝细胞和星状细胞中均有高表达; 2)抑制SOX12基因的表达可以使肝星状细胞中TGF-β1以及collagenⅠ(胶原蛋白Ⅱ)表达量减少; 3) SOX12可调控肝星状细胞的活性和TGF-β1的表达,导致细胞外基质的积累。结论下调肝星状细胞中SOX12的表达可抑制肝硬化。