恶性疟原虫Fcc-1/HN株MSP1_(19)基因的体外扩增及鉴定

本文根据恶性疟原虫ＭＳＰ１１９已知序列，自行设计一对用于特异扩增ＭＳＰ１Ｃ端１９肽基因的引物Ｐ１、Ｐ２，在Ｐ１引物中引入ＳａｌⅠ酶切位点及ＡＴＧ起始密码子，在Ｐ２引物中引入ＸｂａⅠ酶切位点及终止密码子，经ＰＣＲ扩增获得３６３ｂｐ大小片段，与预期大小相符。采用“压碎与浸泡法”纯化回收ＰＣＲ产物，ＰＣＲ产物经套式ＰＣＲ及酶切鉴定证实与预期大小相符，说明所获确为ＭＳＰ１１９基因。为进一步将该基因与ＰｆＣＭＲ基因进行重组表达复合抗原和免疫接种奠定基础。     

恶性疟原虫FCC1／HN株exp—1基因的克隆及序列分析

分泌蛋白1(exported protem l,exp-1)又称环子孢子相关抗原[1].QF116抗原[2]或抗原5.1[3],是23 kDa的恶性疟原虫红内期抗原.在肝期的晚期也有表达[4].exp-1由疟原虫表面分泌.定位到纳虫空泡和感染的红细胞内的膜结构上[5]本文克隆、测定、分析了恶性疟原虫海南株(FCCl/HN)exp-l基因序列,并对FCCl/HN与国外的3D7[5]、Kl6、FC27[1]、FCR3(GenBank Accession No.AF061080)株exp-l基因编码的氨基酸残基序列进行同源性比较.     

恶性疟原虫海南FCC1／HN株有性期特异抗原Pfs25基因的 …

利用ＰＣＲ扩增技术从恶性疟原虫海南ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组中特异扩增编码Ｐｆｓ２５抗原全基因序列，扩增产物经纯化回收后，用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法进行ＤＮＡ序列测定，结果显示ＦＣＣ１／ＨＮ株Ｐｆｓ２５基因序列与ＮＦ５４株者基本一致，仅在第３９２位碱基存在置换（Ｇ→Ｃ）和该密码子编码的氨基酸的变化（１３１ａａ：Ｇｌｙ→Ａｌａ），进一步的酶切位点分析显示该位点碱基置换产生新的ＰｓｔⅠ酶切位点（３９３）     

恶性疟原虫FCC1／NH株裂殖子表面蛋白MSP1第2—5区基因的PCR扩增及克隆

构建恶性疟原虫FCC1／HN株MSP1基因2～5编码区真核表达质粒pcDNA3／MSP1，为FCC1／HN株MSP1的体外表达及其基因工程疫苗的研制奠定基础。方法采用PCR技术对恶性疟原虫海南分离株（FCC1／HN）基因组DNAMSP1第2～5区基因片段进行扩增．扩增产物经纯化后用Xhol和Aaal双酶切然后定向克隆入pcDNA3质粒，转化大肠杆菌TG1．再用相同内切酶酶切和PCR扩增对重组子进行鉴定。结果筛选出编码FCC1／HN株MSP1第2～5区基因片段的真核表达质粒pcDNA3／MSP1。结论编码FCC1／HN株MSPI第2～5区基因片段的真核表达质粒pcDNA3／MSP1的构建，为恶性疟原虫FCC1／HN株MSP1的体外表达及其基因工程疫苗的研制奠定基础。     

恶性疟原虫FCC1／HN株Pf12基因体外扩增、克隆及序列分析

目的：构建恶性疟原虫FCC1／HN株Pf12基因原核表达质粒pET28α-Pf12,测定Pf12基因序列,并为FCC1／HN株Pf12的体外表达奠定基础。方法：采用PCR技术从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中扩增出Pf12基因,扩增产物经纯化,用BamHI XhoI双酶切,定向克隆入pET28α质粒,转化大肠杆菌DH5α,再用BamHI XhoI酶切及PCR扩增对重组子进行鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定,并应用PCGENE软件进行同源性比较及预测抗原表位。结果：筛选出编码FCC1／HN株Pf12基因的原核表达质粒pET28α－Pf12重组质粒的构建,为恶性疟原虫FCC1／HN株Pf12基因的体外表达奠定基础。     

恶性疟原虫FCC—1/HN株EBA—175和HRP─Ⅱ基因片段的体外扩增与克隆

目的构建恶性疟原虫FCC—1／HN株红细胞结合抗原（EBA—175）和富组氨酸蛋白Ⅱ（HRP─Ⅱ）抗原的重组质粒并进行初步鉴定。方法通过聚合酶链反应（PCR）对恶性疟原虫FCC—1／HN株的EBA─175和HRP─Ⅱ基因进行体外扩增,用HindⅢ／BamHI和BamHI／EcoRI分别消化扩增产物,定向克隆pcDNA3载体,转化至感受态大肠杆菌TG1,经抗性筛选和快速凝胶电泳鉴定,再经PCR和酶切鉴定。结果从恶性疟原虫FCC—1／HN株基因组DNA中扩增出EBA—175和HRP─Ⅱ两基因片段并定向插入PCDNA3载体构建重组质粒。结论所获重组克隆含有编码恶性疟原虫FCC—1／HN株EBA—175和HRP—Ⅱ的基因片断。     

恶性疟原虫FCC1／HN株丙酮酸激酶基因的扩增、克隆和序列分析

目的 扩增恶性疟原虫海南株FCCl／HN的丙酮酸激酶(PK)的编码基因，构建其原核和真核表达重组质粒，测定其序列，并了解它及它推导的蛋白质与恶性疟原虫3D7和人PK基因之间的差异。方法 根据3D7的PK基因设计合成一对引物，用PCR从FCCl／HN株基因组中扩增PK基因；将它分别定向克隆到原核表达质粒PGEX-4T-1和真核表达质粒pcDNA3，分别转化大肠杆菌JM109感受态细菌；经酶切、PCR扩增鉴定筛选到阳性重组克隆，用双脱氧链末端终止法测定其序列，用生物信息学软件分析PK序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCCl／HN株PK基因，大小为2235bp，编码744个氨基酸。其氨基酸序列与3D7的同源性高达99．9％，与约氏疟原虫的同源性为70．2％，但与弓形虫和人的PK的同源性分别只有20．9％和21．6％～25．4％。结论 从FCCl／HN株基因组中获取了PK基因，成功构建了其原核和真核表达质粒，并测定了其序列；它与3D7的PK高度同源，但与人的PK基因同源性很低，可能是一个药物靶标。     

恶性疟原虫FCC—1／HN株不同期基因重组质粒混合接种小鼠 …

寻找有效的抗恶性疟原虫混合基因疫苗,探讨其在宿主体内的免疫反应。将恶性疟原虫重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ＥＢＡ１７５／ＨＲＰⅡ经骨肌途径单独注射或与有性期阶段的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆｓ２５混合注射免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠。对小鼠的骨骼骨肌进行预处理,即于注射前７ｄ在左右肢肌四头肌注射０．５％盐酸布比卡因５０μｌ,注射深度为２ｍｍ。观察免疫后不同时间点小鼠血清ＩｇＧ抗体滴度、脾淋巴细胞增殖反应、ＣＤ＾＋／     

恶性疟原虫FCC1／HN株己糖激酶基因的扩增、克隆和序列分析

目的扩增恶性疟原虫FCC1／HN株的己糖激酶(HK)编码基因，构建其原核和真核表达重组质粒．测定其序列，比较它及它推导的蛋白质与恶性疟原虫其他株和人之间的差异。方法用PCR方法从FCC1／HN株基因组中扩增HK基因；将它分别定向克隆到原核表达质粒pET-30a( )和真核表达质粒pCDNA3，分别转化大肠埃希菌BL21／DE3和JM109感受态细菌；经酶切、PCR扩增鉴定筛选到阳性重组克隆，用双脱氧链末端终止法测定其序列，用生物信息学软件分析HK序列及进行同源性比较。结果PCR扩增得到特异的FCC1／HN株HK基因，大小为1482bp，编码493个氨基酸。其氨基酸序列与3D7株完全相同．与K1株的同源性高达99．8％，但与人的4型HK的同源性只有23．2％～26．6％。结论获得恶性疟原虫FCC1／HN株的HK基因，成功构建了其原核和真核表达质粒，并测定了其序列；恶性疟原虫的HK在不同的分离株间高度保守，但与人的同源性很低．可能是一个潜在的药物靶标。     

克隆有恶性疟原虫MSP1基因片断的pQE质粒在减毒鼠伤寒杆菌X4064株中的表达

为探讨克隆有恶性疟原虫ＭＳＰ１基因片断的重组ｐＱＥＭ１质粒在减毒鼠伤寒杆菌中的表达。使用转化和转导的方法构建减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＲＥＰ４／ｐＱＥＭ１）；通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＱＥＭ１）和减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＲＥＰ４／ｐＱＥＭ１）的表达。实验结果成功地构建了减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＱＥＭ１），Ｘ４０６４（ｐＲＥＰ４／ｐＱＥＭ１）的诱导型表达量高于Ｘ４０６４（ｐＱＥＭ１）的组成型表达量。结果指出不受调控的表达将降低重组ｐＱＥＭ１质粒在减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４中的表达量     

恶性疟原虫疫苗研究X.MSP1中类表皮生长因子1与PfCMR基因？…

目的 克隆并表达恶性疟原虫重组复合抗原，为疟疾疫苗研究奠定基础。方法 将恶性疟原虫ＭＳＰ１中类表皮生长因子１（ＥＧＦ－１）基因与人工化学合成的抗原复合基因ＰｆＣＭＲ串接，插入高效非融合型蛋白表达载体ｐＢＶ２２０，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，转化菌经４２℃热诱导表达，表达产物用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ分析。结果 构建成功重组质粒ｐＢＶ２２０／ＰｆＣＭＲ－ＥＧＦ－１，经热诱导后表达出含外     

恶性疟原虫FCC—1／HN株EBA—175和HRP—Ⅱ基因片段的体外扩？…

目的 构建恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株红细胞结合抗原（ＥＢＡ－１７５）和富组氨酸蛋白Ⅱ（ＨＲＰ－Ⅱ）抗原的重组质粒并进行初步鉴定。方法 通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）对恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株的ＥＢＡ－１７５和ＨＲＰ－Ⅱ基因进行体外扩增，用ＨｉｎｄⅢ／ＢａｍＨＩ和ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ分别消化扩增产物，定向克隆ｐｃＤＮＡ３载体，转化至感受态大肠杆菌ＴＧ１，经抗性筛选和快速凝胶电泳鉴定，再经ＰＣＲ和     

恶性疟原虫MSP1_(19)与PfCMR基因的体外重组与克隆鉴定

目的：构建编码恶性疟原虫复合多价保护性抗原的基因的重组质粒,为进行基因免疫提供条件。方法：设计一对特异引物Ｐ１与Ｐ２,采用ＰＣＲ法扩增获取ＭＳＰ１中Ｃ端１９肽基因,纯化后用ＳａｌⅠ＋ＸｂａⅠ双酶切,把含复合基因ＰｆＣＭＲ的重组质粒ｐＷＲ４５０－１／ＰｆＣＭＲ用ＥｃｏＲⅠ＋ＳａｌⅠ双酶切,回收复合基因ＰｆＣＭＲ,将ＭＳＰ１１９基因与ＰｆＣＭＲ基因串联后与经ＥｃｏＲⅠ＋ＸｂａⅠ双酶切的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３进行重组,转化大肠杆菌ＪＭ１０９,经电泳初筛、双酶切鉴定及ＰＣＲ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增获得３６３ｂｐ的ＭＳＰ１１９基因,重组克隆经双酶切鉴定及ＰＣＲ鉴定后获得正确重组克隆子ｐｃＤＮＡ３－ＰｆＣＭＲ－ＭＳＰ１１９（命名为ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８）,Ｐｆ８基因长度为６１８ｂｐ。结论：成功构建编码恶性疟原虫多价保护性抗原的基因的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８。     

恶性疟原虫FCC1／HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸脱氢酶（GDH)基因并测定其序列,比较FCC1／HN株与国外分离株GDH基因序列的差异。方法 根据GDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增GDH基因,并将其克隆入pMD18-T载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNAstar软件比较不同分离株GDH基因序列的同源性。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株GDH基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-GDH重组质粒。测序表明,恶性疟原虫FCC1／HN株GDH基因全长1329bp,编码442个氨基酸。序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的FCQ27、K1株GDH基因编码的氨基酸序列有少量的差异。结论 克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株GDH基因;序列测定及同源性分析表明,FCC1／HN株与其它分离株的GDH基因序列有较高的同源性。     

恶性疟原虫FCC1／HN株特异基因片段的克隆及部分序列分析

本研究通过分离、培养恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ分离株，提取、纯化其基因组ＤＮＡ，用ＢａｍＨ１部分酶切，并克隆ｐＵＣ１８载体，转化受体菌株大肠杆菌ＪＭ１０３，用基因组ＤＮＡ探针筛选转化子，对杂交信号最强的克隆片段ｐＨＦ１作部分序列分析，在国内首次明确恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ特异ＤＮＡ部分序列。ｐＨＦ１克隆片段约１．２ｋｂ，两端分别测定了３２８和２７１个碱基。Ｇ＋Ｃ含量为２６．８％，并有较多的酶切位点，便于作亚克隆，该序列还可用作ＤＮＡ探针或ＰＣＲ扩增模板有较大实用价值。     

恶性疟原虫FCC1／HN株Pf332基因的克隆和测序

目的 构建恶性疟原虫海南（FCC1/HN）株红细胞膜相关巨大蛋白（Pf332）部分基因的真核表达载体;并测定Pf332基因序列,了解FCC1/HN株与3D7、Palo Alto株Pf332基因序列的差异。方法 根据已知Pf332基因序列设计合成一对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增Pf332基因片段;将Pf332部分基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞;阳性克隆的重组质粒DNA经酶切、PCR扩增鉴定,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用分子生物学软件辅助分析Pf332序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1/HN株Pf332基因片段;经双酶切及PCR鉴定表明获得正确的pcDNA3-Pf332重组质粒。测序表明,获得的FCC1/HN株Pf332基因片段大小为1260bp,编码420个氨基酸残基。恶性疟原虫FCC1/HN株与3D7、Palo Alto株间Pf332基因片段编码的氨基酸残基中分别有1个、15个位点不同。结论 从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中获取Pf332基因片段,成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-Pf332;FCC1/HN与3D7株间比FCC1/HN与Palo Alto株间的Pf332基因序列的同源性高。     

恶性疟原虫FCC1/HN株exp-1基因的克隆及序列分析

分泌蛋白 1(ｅｘｐｏｒｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ 1,ｅｘｐ 1)又称环子孢子相关抗原[1] ,ＱＦ116抗原[2 ] 或抗原 5 .1[3 ] ,是 2 3ｋＤａ的恶性疟原虫红内期抗原 ,在肝期的晚期也有表达[4] 。ｅｘｐ 1由疟原虫表面分泌 ,定位到纳虫空泡和感染的红细胞内的膜结构上[5] 。本文克隆、测定、分析了恶性疟原虫海南株 (ＦＣＣ1/ＨＮ)ｅｘｐ 1基因序列 ,并对ＦＣＣ1/ＨＮ与国外的 3Ｄ7[5] 、Ｋ1[6] 、ＦＣ2 7[1] 、ＦＣＲ3(ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ .ＡＦ0 6 10 80 )株ｅｘｐ 1基因编码的氨基酸残基序列进行同源性比较。1　材料与方法根…     

恶性疟原虫海南分离株裂殖子表面蛋白2真核表达重组质粒的构建

目的 构建恶性疟原虫海南分离株（FCC1／HN）裂殖子表面蛋白2（MSP2）融合HBsAg基因片断真核表达质粒pVXORF1-PfMSP2-HBS及重组真核表达质粒pVXORF1-PfMSP2，为疟疾核酸疫苗及蛋白疫苗的研制奠定基础。方法 （1）采用PCR技术对恶性疟原虫FCC1／HN株MSP2原核表达质粒PET28α-MSP2的MSP2基因进行扩增，扩增产物经纯化后用Bam H I酶切；质粒pVXORF1-PvMSP1.19-HBS用相同的酶酶切，经纯化后用T4DNA连接酶将其与酶切后纯化的MSP2基因连接；（2）分别用BamHI Xho双酶切PET28α-MSP2质粒DNA和pVXORF1质粒DNA，纯化后2将目的基因片段用T4DNA连接酶连接；将（1），（2）连接产物分别转化大肠杆菌DH5α。于氨苄青霉素阳性LB培养平板上筛选阳性克隆，酶切电泳鉴定。结果 筛选出的重组子为编码FCC1／HN MSP2基因片段的重组质粒pVXORF1-PfMSP2-HBS及pVXORF1-PfMSP2。结论 编码FCC1／HN MSP2基因片断真核表达质粒pVXORF1-PfMSP2-HBS和pVXORF1-PfMSP2的构建为疟疾核酸疫苗及蛋白疫苗的研制奠定了基础。     

恶性疟原虫海南FCC1/HN株环子孢子蛋白(CSP)基因的克隆与表达

目的　为疟疾疫苗的研制提供靶抗原。方法　根据恶性疟原虫ＩＭＴＭ２２ 株７Ｇ８ 克隆环子孢子蛋白基因编码区序列, 设计一对引物, 采用ＰＣＲ技术从恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增ＣＳＰ基因的Ⅰ区、中央重复区和Ⅱ区片段, 全长１－０８ｋｂ; 纯化扩增产物用ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨ Ⅰ双酶切后, 定向克隆入ｐｃＤＮＡ３ 载体, 转化大肠杆菌ＴＧ１ 株, 重组克隆经筛选后, 用ＰＣＲ 扩增和ＨｉｎｄⅢ＋ ＢａｍＨ Ⅰ双酶切进行鉴定： 用磷酸钙贴壁细胞转化法将重组质粒ｐｃＤＮＡ—ＣＳＰ导入ＨｅＬａ细胞, 用Ｇ４１８ 筛选出稳定分泌ＣＳＰ抗原的阳性细胞克隆; 将阳性细胞克隆系扩大培养并用Ｇ４１８ 加压, 以表达重组ＣＳＰ, 分离细胞培养上清和培养细胞, 进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析。结果　（１） 从ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增出ＣＳＰ基因Ⅰ区, 中央重复区和Ⅱ区编码序列;（２） 将扩增的目的片段正向插入ｐｃＤＮＡ３ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ位点; （３） 在人宫颈癌细胞系ＨｅＬａ 细胞中表达重组ＣＳＰ抗原, 其分子量为３８－３ｋＤａ, 蛋白扫描分析表达量占细胞培养上清液中蛋白总含量的１５－７７％ 。结论　成功构建真核表达系统ｐｃＤＮＡ３