小鼠骨髓树突状细胞体外扩增方法的探索

背景：树突状细胞(Dendritic cells，DC)是抗原提呈功能最强的细胞，但因数量极微限制了它的应用。目的：建立小鼠骨髓DC体外大量扩增方法。设计：完全随机对照研究。地点和对象：实验地点：基础医学部中心实验室；C57BL／6(H-2k^b)小鼠，BALB／c(H-2k^d)小鼠各6只。干预：用粒一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与白细胞介素4(IL-4)体外培养小鼠骨髓细胞。主要观察指标：用相差显微镜观察形态学变化，3H-TdR掺入法检测细胞增殖能力，FACS检测细胞表面分子，ELISA检测细胞因子。结果：扩增的DC形态学特征典型，具有强烈的激活T细胞增殖能力，表达IaKb，CD11c，CD80，CD86，ICAM-1分子以及分泌IL-12，IL-6，TNF-α和IL-1β水平增强。结论：该法在体外扩增的大量的DC细胞，具很强的免疫学活性。     

人树突状细胞体外诱导分化扩增方法

树突状细胞（ＤＣ）是目前已发现的抗原递呈功能最强的抗原递呈细胞。来源于人外周血单核细胞和骨髓／脐血ＣＤ３４＾＋造血干细胞在体外经不同培养体系诱导后,能得到具有一定数量的功能性ＤＣ,表现为典型的形态、表型和功能特征,为今后的临床应用提供基础。,     

人树突状细胞体外诱导分化扩增方法

树突状细胞(DC)是目前已发现的抗原递呈功能最强的抗原递呈细胞。来源于人外周血单核细胞和骨髓/脐血CD34~ 造血干细胞在体外经不同培养体系诱导后,能得到具有一定数量的功能性DC,表现为典型的形态、表型和功能特征,为今后的临床应用提供基础。     

卡巴胆碱对脓毒症小鼠脾脏树突状细胞变化的影响

目的从调节脾脏树突状细胞（DC）活性的角度探讨卡巴胆碱在防治脓毒症中的作用机制。方法将雄性C57BL／6小鼠30只按随机数字表法均分为正常对照组、脓毒症组和卡巴胆碱组。腹腔注射脂多糖（LPS）制备小鼠脓毒症模型，用流式细胞仪检测DC表面分子CD11c、CD86和主要组织相容性抗原复合物Ⅱ（MHC-Ⅱ）的表达；采用免疫组化标记技术检测白细胞介素-1β（IL-1β）与IL-12p70的阳性细胞率。结果注射LPS后，脾脏DC数量增加，但与正常对照组比较差异无显著性；DC表面分子MHC-Ⅱ和cD86表达以及IL-1β和IL-12p70阳性细胞率均较正常对照组增高，差异均有显著性（P均〈0．05）；与脓毒症组比较，卡巴胆碱组脾脏DC的数量没有明显变化，但表面分子MHC-Ⅱ和CD86表达及IL-1β和IL-12p70阳性细胞率均明显降低，差异具有显著性（P均〈0．05）。结论卡巴胆碱能降低DC活性，有助于减轻脓毒症早期过度的免疫反应和炎症反应。     

小鼠骨髓及脾脏来源的树突状细胞培养及鉴定

目的建立体外培养和扩增树突状细胞(dendritic cell-DC)的方法,为免疫耐受研究提供实验材料和奠定基础。方法在无菌条件下提取ICR小鼠脾脏淋巴细胞和骨髓细胞,以小鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL-4)协同诱导下培养,光镜下观察DC的形态,流式细胞仪检测CD80、CD86表达水平。结果骨髓细胞体外诱导培养3天后,光镜下显示细胞表面不规则,呈树突状突起,可见典型的树突状细胞形态,低表达共刺激分子(CD80,CD86)。结论与脾脏细胞相比,骨髓细胞中不仅富含大量的DC的前体细胞而且诱导成DC时间短。     

急性肺损伤小鼠脾脏树突状细胞动态变化研究

目的 研究脂多糖(LPS)诱导急性肺损伤(ALI)小鼠脾脏树突状细胞(DC)数量改变和成熟状态,探讨ALI小鼠脾DC变化规律.方法 C57BL/6小鼠36只,随机(随机数字法)分为2组.①对照组(Con):小鼠气管内注射PBS 30 μL;②ALI组(ALI):气管内注射脂多糖(LPS)2 mg/kg复制ALI模型.后又按注射LPS或PBS后6、12、24 h三个时间点各分成三组,每组6只小鼠.光镜观察肺组织病理改变,测定肺损伤评分,计算肺湿质量/体质量比(LW/BW),酶联免疫吸附法(ELISA)检测肺组织匀浆中白细胞介素-6(IL-6)的含量,以反映肺组织炎症损伤程度.流式细胞仪(FCM)检测脾单细胞悬液中DC比例及表达CD80、MHCⅡ水平.结果 ALI组小鼠6、12、24h时点的肺LW/BW均明显高于对照组(P＜0.05).病理检测示ALI组小鼠肺泡间隔增宽、充血、出血及大量炎性细胞浸润等急性肺损伤病理改变.ALI组肺损伤评分及肺组织IL-6水平均显著高于对照组(P＜0.05).FCM检测显示,与对照组相比,ALI组小鼠脾脏DC呈一过性升高,ALI组12 h时点脾脏DC升高至(1.92±0.25)％,显著高于对照组(P＜0.01),24h时点降至基线水平(0.96±0.21)％.与对照组相比,ALI组脾脏DC表达CD80显著增加(P＜0.01);与ALI组6h相比,ALI组12h和24 h脾脏DC表达CD80显著升高(P＜0.05).ALI组与对照组及ALI组各时间点脾脏DC表达MHCⅡ的差异无统计学意义(P＞0.05).结论 ALI早期脾脏DC存在一过性升高,伴功能呈成熟状态,脾脏DC可能参与ALI炎症损伤的发生发展.     

自体树突状细胞体外诱导扩增方法的安全性改进

目的 :改进从外周血获得自体树突状细胞的方法的临床安全性。方法 :密度梯度离心法分离鼻咽癌患儿外周血单个核细胞 (PBMC) ,贴壁法获得单核细胞 ,以IL 4、GM CSF、TNF α和人血浆进行诱导扩增树突细胞(DC)并进行表面分子鉴定 ,同时检测其对自体外周血T细胞的刺激作用。结果 :成功培养并扩增出成熟度较高的DC ,平均从每 1mL外周血扩增出的DC数量达到 ( 3 2± 1 1)× 10 5,这些DC具备很强的刺激T细胞增殖的能力。结论 :本法可从外周血扩增大量自体树突状细胞 ,有很强的刺激自体T细胞增殖的活性 ,并增加临床应用的安全性。     

树突状细胞对自体自然杀伤细胞体外扩增及功能的影响

本研究探讨树突状细胞（DC）对自体自然杀伤（NK）细胞体外扩增和功能的影响及其机制。用干细胞培养液（SCGM）在37℃、5％CO2、饱和湿度培养条件下以rhIL-2体外扩增NK细胞10天后，将自体DC与NK细胞以5：1（5：1组）和1：1（1：1组）的比例混合继续培养。14、21天时计算5：1组、1：1组和对照组的NK细胞扩增倍数，流式细胞术测定细胞表面CD3、CD56／16的表达，MTT法检测NK细胞的功能，ELISA法检测各培养组上清液中TNF-α和IL-12p70的含量。结果表明：14天时5：1、1：1组和对照组的扩增倍数分别为29．25±4．01、21．23±2．91和16．26±1．58，3组间比较差别有统计学意义（P〈0．05）。同组不同时间比较，14天时扩增倍数最高（P〈0．05）。14天时3组CD3^-、CD56／16^＋表达率分别为（64.6±7.8）％、（50．6±8.7）％和（34．8±5．1）％，5：1组表达率最高（P〈0．05）。14天时3组对K562细胞的杀伤率分别为（87.4±6．8）％、（75.4±6．3）％和（63．7±3.8）％，5：1组杀伤活性明显高于其它2组（P〈0．05）。5：1组上清液中TNF—α和IL-12p70的含量均分别高于其它各组（P均〈0．05）。结论：DC与NK细胞混合培养，能以比例依赖的方式增加NK细胞的扩增倍数，增强NK细胞的功能。DC增加NK细胞的扩增倍数与DC分泌的IL-12有关，NK细胞功能增强与NK细胞分泌的TNF—α增高有关。     

小鼠髓系树突状细胞的体外扩增和超微结构

背景:树突状细胞可激发初始型T细胞,是目前所知机体功能最强的专职抗原递呈细胞,但对其超微结构的研究鲜见报道.目的:观察小鼠髓系树突状细胞不同发育阶段以及CD40配基化和肿瘤坏死因子α刺激后树突状细胞的超微结构特征.方法:无菌取小鼠骨髓前体细胞,采用粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4联合方案体外诱导获得未成熟树突状细胞,负载早期凋亡的肿瘤细胞后采用小鼠CD40L转基因CHO细胞和肿瘤坏死因子α刺激48 h,按常规方法制备超薄切片,透射电镜观察树突状细胞的超微结构特征.结果与结论:前体细胞及未成熟树突状细胞内有清晰可见的吞饮泡,未成熟树突状细胞的胞质内可见"C"形和环形溶酶体;凋亡肿瘤细胞负载的树突状细胞可见凋亡小体被吞噬或包裹的现象,小鼠CD40L转基因CHO细胞和肿瘤坏死因子α均可促进树突状细胞成熟,但肿瘤坏死因子α作用后,部分树突状细胞有自噬和凋亡改变.结果提示,小鼠骨髓来源树突状细胞在不同分化发育阶段有其特殊的超微结构表现,肿瘤坏死因子α可介导树突状细胞发生自噬和凋亡.     

小鼠骨髓树突状细胞的培养扩增及生物学特性分析

背景:树突状细胞是目前已知功能最强的专职性抗原递呈细胞,但树突状细胞在体内分布广泛且数量较少,获得大量的树突状细胞是研究树突状细胞特性和功能的前提。目的:建立小鼠骨髓源树突状细胞体外培养和扩增方法,观察其形态和相关特征。设计、时间及地点:树突状细胞形态学观察实验,于2006-08/2007-05在中山大学中山眼科中心实验室完成。材料:健康雌性C57BL/6小鼠。方法:在无菌条件下提取C57BL/6鼠骨髓细胞,分离单个核细胞,以小鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4协同诱导下培养,加用磷酸脂多糖刺激,分成磷酸酯多糖-树突状细胞和单纯树突状细胞组,前者在培养加入磷酸酯多糖,后者不加。主要观察指标:应用光镜和电镜下观察树突状细胞的形态,流色细胞仪检测鉴定其生物学特征。结果:体外培养2周后具有典型的树突状细胞形态,光镜下显示细胞表面不规则,呈树突状突起,电镜下可见培养的细胞具有典型树突状细胞的形态特征,流式细胞鉴定为髓系树突状细胞,高表达MHCII类分子及共刺激分子(MHCII,CD80,CD83,CD11c)。单纯树突状细胞组的细胞中度表达MHCⅡ类分子,低水平表达共刺激分子,刺激T细胞增殖的能力较弱;...     

小鼠骨髓来源的树突状细胞体外诱导分化的实验研究

目的　研究小鼠骨髓树突状细胞体外诱导分化、成熟及对T细胞增殖的影响 ,为进一步研究树突状细胞的功能及临床肿瘤治疗的应用提供技术方法。方法　应用IL 4、GM CSF培养小鼠骨髓细胞 5～ 7d ,镜下观察细胞形态学变化 ;培养至第 5～ 6d ,加入黑色素瘤 (B16 )冻融抗原继续培养 1～ 2d ,流式细胞仪检测细胞表面分子CD83、CD86 ,并与同种异体T细胞混合培养 72h ,终止培养前 16h加入 3H TdR(0 .5 μCi 孔 ) ,γ 液体闪烁仪测定cpm值。 结果　IL 4、GM CSF培养 3d可见细胞形态发生改变 ,细胞形状不规则 ,培养 5～ 6d时 ,有刺状突起、拉长 ,为典型树突状细胞形态学特征 ;抗原装载后流式细胞仪检测CD83、CD86表达 ,IL 4 +GM CSF +TNF α组 (6 1.6 8% ,71.2 5 % )及IL - 4 +GM -CSF +冻融抗原组 (6 3.11% ,76 .88% )明显高于对照组 (2 .4 1% ,3.88% )及单纯IL - 4 +GM -CSF培养组 (2 1.86 % ,2 8.6 9% ) (P <0 .0 0 1) ,IL - 4 +GM -CSF +TNF -α组与IL - 4 +GM -CSF +冻融抗原组比较CD83、CD86表达没有显著性差异 ;液闪仪检测结果显示 ,IL - 4 +GM -CSF +冻融抗原组刺激T细胞增殖的能力明显强于其他组 ,且有显著性差异(P <0 .0 0 1,P <0 .0 5 )。结论　小鼠骨髓细胞体外培养可以成功诱导扩增出足够量树突状细胞     

小鼠髓源性树突状细胞的体外扩增及生物学特性的鉴定

目的以小鼠骨髓细胞为前体,建立一种高效、简便的体外扩增、分离培养树突状细胞(DC)的方法。方法实验分为GM/4组和GM/4-α组,以重组鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组鼠白介素-4(rmIL-4)对小鼠骨髓细胞联合诱导培养,GM/4-α组在第5天添加rmTNF-α继续培养48 h,GM/4组不加并于第5天时终止培养;分别收集第5天、第7天的悬浮及疏松贴壁细胞,扫描电镜观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞表面分子,同种异体混合淋巴细胞反应(MLR),检测2组细胞刺激同种异体T细胞增殖的能力。结果所收集的2组细胞均具有典型DC形态,细胞表面高表达小鼠髓源性DC相对特异性标志CD11c,表达率达75%以上;GM/4组DC细胞表面CD40、CD86、MHC-Ⅱ的表达率分别为30.5%、34.2%、45.1%,GM/4-α组则分别为78.7%、88.3%、96.7%;MIR中GM/4组DC刺激同种异体T细胞活化增殖的能力不如GM/4-α组强。结论此种方法能于体外定向诱导和扩增出大量髓源性DC,这为后续研究DC在器官移植后诱导机体免疫耐受的机制奠定了基础。     

Tuftsin stimulates IL-1 production by human mononuclear cells, human spleen cells and mouse spleen cells in vitro

Human peripheral adherent cells from splenectomized subjects, human spleen cells and mouse spleen cells were tested for IL-1 production in vitro in presence or absence of synthetic tuftsin (Thr-Lys-Pro-Arg). Application of synthetic tuftsin to peripheral blood adherent cells from normal donors as well as from splenectomized subjects induces IL-1 production. In splenectomized subjects the extent of induction was more evident than in controls. In human splenic cells tuftsin stimulates IL-1 production without KLH or LPS. In mouse spleen cells tuftsin alone did not stimulate the IL-1 secretion. However, addition of tuftsin to mouse spleen cells incubated with KLH augmented significantly the IL-1 secretion. As removal of the spleen leads to tuftsin deficiency, our present findings may perhaps explain the fulminant nature of the postplenectomy sepsis and some immune disturbances described in the postplenectomy state.     

体外纯化培养外周血来源的树突状细胞的研究

目的建立来源于外周血的树突状细胞(DCs)的纯化培养方法并观察DCs的形态及功能。方法以Fi-coll密度梯度离心法从正常人外周血中分离出外周血单个核细胞(PBMNC)后,用体外培养的手段,采用培养黏附法或经免疫磁珠筛选法,获得单核细胞;分别加入不同浓度的细胞因子(重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子重组人白介素4重组人肿瘤坏死因子α)诱导培养,培养12 d诱导出DCs;用光镜和电镜观察培养的DCs,用流式细胞仪检测DCs表面的细胞表型(CD80、CD83、CD86、CD1α、HLA-DR),MTT法检测DC对T细胞的刺激增殖效应。结果在体外诱导出外周血来源的成熟DCs,电镜和光镜分析表明具有DCs的典型形态,所培养的细胞表面高表达CD80、CD83、CD86、CD1α、HLA-DR,并具有刺激异基因淋巴细胞增殖的能力。结论应用外周血来源的单个核细胞,采用培养黏附法或免疫磁珠分选法分选出的单核细胞,细胞因子培养12 d可得到成熟正常的DCs。     

脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞的定向诱导

背景:骨髓间充质干细胞存在取材困难、供体有限,可能病毒污染等缺陷,限制了其临床应用,而目前已证实间充质干细胞不仅存在于骨髓,还存在于外周血,尤其是脐血.目的:探讨人脐血间充质干细胞的体外分离、扩增纯化方法及其神经分化潜能.设计、时间及地点:应用研究,体外细胞学观察,于2005-10/2007-10在南方医科大学神经生物学教研室完成.材料:新鲜脐血来自南方医科大学南方医院足月剖宫产新生儿脐带,取脐血前征得新生儿监护人的知情同意.方法:无菌条件下收集脐血,去除红细胞,采用低糖DMEM/F12进行培养:取扩增第3或4代的人脐血间危质干细胞,培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和全反式维甲酸.主要观察指标:用流式细胞仪检测贴壁细胞的表面标志;用免疫组化法检测诱导后细胞神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白表达.结果:人脐血间充质干细胞强表达CD13、CD29、CD44和CD105,弱表达CD106,不表达CD34、CD11a、CD14、CD33和CD45.培养基添加神经营养因了诱导后的细胞呈现典型的神经元样表型,诱导后高表达巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白.结论:人脐血富含间充质干细胞,分离培养后于培养基添加神经营养因子能够分化为神经元样细胞.     

小鼠胚胎心脏心外膜细胞体外培养模型的建立

背景：胚胎心脏心外膜细胞是最近被发现的具有分化为心肌细胞和血管平滑肌细胞潜能的心脏干细胞,可分化为心脏三系细胞,为心脏损伤的再生提供了新的细胞来源,但其定向分化机制及调控因素仍不清楚。目的：体外建立小鼠胚胎心脏心外膜细胞培养模型。方法：解剖显微镜下分离11.5-12.5 d小鼠胚胎心脏,剪除肺静脉血管、心房组织及左心室,移至6孔板(或35 mm培养皿)培养,24 h后移走胚胎心脏组织继续培养。相差显微镜观察胚胎心外膜细胞生长特点;使用免疫荧光技术对细胞进行胚胎心外膜细胞特异性抗体Wt-1、Tbx18染色。结果与结论：胚胎心外膜单层细胞从组织块边缘长出,呈鹅卵石样,并围绕组织块向外延伸。移去胚胎心脏后细胞继续生长,且增殖迅速,三四天后长至融合。所有细胞均强阳性表达胚胎心脏心外膜细胞特异性抗体Wt-1及Tbx18。结果表明,胚胎心脏心外膜细胞生长迅速、形态单一,均表达心外膜细胞特异因子,细胞纯度高,成功构建了体外胚胎心脏心外膜细胞培养模型,为研究其定向分化的分子机制提供了新的思路。     

健康人外周血树突状细胞体外培养及表型鉴定

目的 分离人外周血单个核细胞,经体外诱导培养获取成熟树突状细胞(DC),并对树突状细胞表型表达鉴定,为进一步研究DC功能提供基础.方法 取健康成人新鲜外周血,经密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞,2 h贴壁后加入粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-4,第6天加入肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激DC成熟,倒置显微镜观察每日细胞形态;分别于第1天、第6天、第8天用流式细胞仪对其进行表型鉴定;同种异体混合淋巴细胞反应观察对T细胞的抗原提呈能力 倒置显微镜下DC细胞形态不规则,表面有毛刺状突起,呈DC典型形态学特征;成熟DC细胞表面CD1a、CD80、CD83、人类白细胞抗原(HLA)-DR表达明显增加,混合淋巴细胞反应OD值增加.结论 用GM-CSF、IL-4和TNF-α可以诱导健康成人外周血单个核细胞,培养出成熟的DC细胞,为进一步研究DC功能提供基础.