肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的克隆,表达及重新折叠

目的：人的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（ＴＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ,ＴＲＡＩＬ）基因经扩增后,克隆在大肠杆菌中表达并重新折叠并获得有活性的ＴＲＡＩＬ蛋白。方法：用ＰＣＲ的方法从人胎盘ｃＤＮＡ库中扩增ＴＲＡＩＬ基因,经序列分析鉴定,再克隆到原核表达载体ｐＥＴ１１ａ,经Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）表达,电泳鉴定后,柱层析纯化,重新折叠,流式细胞术等     

人骨形成蛋白-3成熟肽cDNA的克隆、测序及表达

目的：扩增、克隆人骨形成蛋白－３（ｈＢＭＰ－３）成熟肽ｃＤＮＡ基因，利用大肠杆菌表达ｈＢＭＰ－３成熟肽．方法：ＰＣＲ方法扩增ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，双脱氧终止法测序正确后，克隆入大肠杆菌表达载体ｐＤＨ，受控于ＰＲＰＬ启动子，重组质粒ｐＤＨＢ－３ｍ以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌在４２℃进行温度诱导．结果：扩增出ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，序列测定完全正确；含重组质粒ｐＤＨ－Ｂ３ｍ的工程菌诱导后在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新生蛋白带，分子质量为１４．５ｋｕ，与预期ｈＢＭＰ－３成熟肽分子量大小一致，约占菌体总蛋白的２８％．结论：成功扩增、克隆ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，并可在大肠杆菌中得到高效表达     

人单核细胞趋化蛋白受体5的基因克隆及该基因超家族成员氨基酸结构

目的：获取有重要生物功能的人单核细胞趋化蛋白受体５（ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５,ｈｕＣＣＲ５）。方法：从人ＰＢＭＣ中提取总ＲＮＡ和ｐｏｌｙ（Ａ）＾＋ＲＮＡ,而后经反转录合成ｃＤＮＡ第一链,再以ＰＣＲ扩增出ｈｕＣＣＲ５ ｃＤＮＡ并插入融合表达载体ｐｃＤＮＡ３．０的ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ位点,转化大肠杆菌ＴＧ－１,挑取克隆,酶切鉴定,序列分析。结果：克隆出长度为１０５６ｂｐ,编码３５２个氨基酸的ｈｕＣＣＲ５ ｃＤＮＡ。并分析证明与该基因超家族氨基酸有８０％同源性,与国外发表资料比较有３个碱基突变。结论：克隆出人单核细胞趋化蛋白５受体,为今后基础研究提供了较有用的材料。     

Tropic 1808基因在大肠杆菌中的表达

目的;在大肠杆菌宿主系统中表达Ｔｒｏｐｉｃ１８０８基因编码的蛋白。方法：用ＰＣＲ方法从质粒中扩增出Ｔｒｏｐｉｃ１８０８ｃＤＮＡ开放阅读框架片段,并重组人表达载体ｐＥＴ－２１ａ中,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,用ＩＰＴＧ诱导Ｔｒｏｐｉｃ１８０８融合蛋白的表达,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,表达蛋白条带转至ＰＶＤＦ膜进行氨基酸序列分析,结果：构建了ｐＥＴ－２１ａ－１８０８重组质粒,外源性Ｔｒｏｐｉｃ１８０８基     

大鼠肝再生增强因子编码区的cDNA克隆和原核表达

目的：克隆大鼠肝再生增强因子（ＡＬＲ）编码区ｃＤＮＡ并进行原核表达。方法：提取新生大鼠肝脏总ＲＮＡ为模板，以寡聚ｄＴ为引物逆转录合成第一链ｃＤＮＡ，再以我们设计的ＰＣＲ引物进行ＰＣＲ扩增获取大鼠肝再生增强因子编码区双链ｃＤＮＡ；以基因重组技术构建大鼠ＡＬＲ的原核表达质粒，然后将重组表达质粒转化至大肠杆菌内以ＩＰＴＧ诱导表达。结果：成功克隆出大鼠肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ，其序列与以前报道的完全一致；构建的大鼠ＡＬＲ原核表达重组质粒在大肠杆菌内高效表达ｒＡＬＲ融合蛋白，其表达量占菌体蛋白３０％。结论：大鼠肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ的克隆及其在大肠杆菌的高效表达为ＡＬＲ的深入研究奠定了基础。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ在大肠杆菌中的高效表达及纯化

目的:获得高纯度的人心肌肌钙重组蛋白,为临床上检测心肌损伤及预后提供新的诊断方法.方法:利用RT-PCR方法从人心肌细胞的cDNA文库中扩增编码人心肌肌钙蛋白Ⅰ的cDNA,并克隆到大肠杆菌表达载体中,表达含凝血酶识别序列的MS2-cTnI 融合蛋白,纯化后用Western-blot进行鉴定.结果:从人心肌cDNA文库中扩增出编码人cTnI的cDNA,克隆并在大肠杆菌中表达,表达量达30%以上.经离子交换柱纯化,最终产物纯度在95%以上.可与其特异性单克隆抗体反应.结论:cTnI能够在大肠杆菌中高效表达和纯化,为今后检测心血管疾病提供了一种高效快捷的方法.     

人淋巴毒素cDNA克隆及顺序分析

目的：克隆人淋巴毒素ｃＤＮＡ并测序。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从ＰＨＡ／ＰＭＡ活化的人Ｔ细胞系Ｊｕｒｋａｔ细胞总ＲＮＡ中扩增人淋巴毒素ｃＤＮＡ，并定向克隆于ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９质粒载体，Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测序。结果：ＲＴ－ＰＣＲ扩增出一个５４１ｂｐ的ＤＮＡ片段，限制性内切酶图谱分析和测序结果显示，该５４１ｂｐ片段为编码人淋巴毒素成熟肽的ｃＤＮＡ，与公布的人淋巴毒素ｃＤＮＡ序列完全一致。结论：本实验成功地克隆了人淋巴毒素ｃＤＮＡ，为在大肠杆菌表达人淋巴毒素并进一步研究其功能，以及淋巴毒素的开发与临床应用奠定了基础。     

人WAF1基因表达质粒的构建

目的：克隆人ＷＡＦ１基因,构建成ＷＡＦ１－ｐｃＤＮＡ３真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链反应从Ｈｅｌａ细胞中扩增人ＷＡＦ１基因,并克隆到ｐｃＤＮＡ３真核克隆载体中。结果：从Ｈｅｌａ细胞扩增的人ＷＡＦ１基因克隆至真核克隆表达载体ｐｃＤＮＡ３中,经ＤＮＡ直接测序,获得了ＷＡＦ１－ｐｃＤＮＡ３重组质粒。结论：成功地构建人ＷＡＦ１表达质粒ＷＡＦ１－ｐｃＤＮＡ３,为进一步研究ＷＡＦ１基因表达及生物学效应     

人及大鼠胶质细胞源性神经营养因子cDNA的克隆与表达

目的：克隆与表达人及大鼠胶质细胞源性神经营养因子ｃＤＮＡ。方法和结果：用逆转录－聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增了人及大鼠ＧＤＮＦ成熟序列的ｃＤＮＡ片段，并将人及大鼠ＧＤＮＦ ｃＤＮＡ重组到表达质粒ｐＢＰＬ中，分别在大肠杆菌中获得了较高表达。结论：人及大鼠ＧＤＮＦ ｃＤＮＡ的克隆与表达获得成功，为研究ＧＤＮＦ在神经损伤修复中的作用奠定了基础。     

人神经营养素-4的克隆及其在原核细胞的表达

目的：体外扩增人神经营养素－４（ＮＴ－４）基因,经克隆后在原核细胞中表达并鉴定人重组ＮＴ－４,为研究其生物学特性及临床应用奠定基础。方法：以人类基因组ＤＮＡ为模板,扩增ＮＴ－４成熟活性蛋白ＤＮＡ编码序列,将此ＤＮＡ片段克隆到载体ＰＢＶ２２０中,对重组质粒进行ＰＣＲ筛选和限制性酶切分析,确定后将该重组质粒转化到大肠杆菌ＤＨ５α进行诱导表达。用抗ＮＴ－４抗体进行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定重组蛋白。结果：体外成功扩增ＮＴ－４基因,转染的大肠杆菌经诱导后表达出能被抗ＮＴ－４抗体识别的重组蛋白,其表达量为１５％。结论：在原核细胞能成功表达ＮＴ－４。     

人bFGF基因克隆表达及表达产物的纯化和生物学活性分析

目的：通过融合蛋白表达方式将编码人碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）ｃＤＮＡ在大肠杆菌ＤＨ５α中的表达,为ｂＦＧＦ进一步研究提供材料来源。方法：用多聚酶链反应（ＰＣＲ）及ＤＮＡ重组技术将ＰＣＲ产物克隆到ｐＧＥＭ－５Ｚ载体并测序,然后克隆到表达载体ｐＸＨ上。结果：转化重组质粒ｐＬＸ１的大肠杆菌经４２℃温控诱导４５ｈ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示融合蛋白的分子量约３５０００,薄层扫描分析表明该蛋白占菌体总蛋白量的９９％。经ＦａｃｔｏｒＸａ酶切后得到分子量约为１７０００的ｂＦＧＦ,其生物学活性ＥＤ５０为２２９ｎｇ／ｍｌ。结论：经ＰＣＲ方法扩增的ｂＦＧＦ可在大肠杆菌中高效表达,为其进一步结构与功能研究打下基础     

人白细胞介素－9cDNA的PCR扩增及其在大肠杆菌的表达

利用ＰＣＲ技术从人外周血Ｔ细胞ｃＤＮＡ文库中扩增出人ＩＬ－９的ｃＤＮＡ，将其连入大肠杆菌表达载体后，可在大肠杆菌高效表达出人重组ＩＬ－９融合蛋白，表达量占菌体蛋白的２５％左右，有明显的刺激正常人骨髓细胞集落形成的活性。     

血小板生成素基因的克隆及在原核细胞的表达

目的 克隆人血小板生成素（ｈＴＰＯ）基因,并使其在原核细胞中获得表达。方法 先从人胚胎肝脏中提取总ＲＮＡ,进行ＲＴ－ＰＣＲ获得编码氨基端１９５个氨基酸残基的ｈＴＰＯ１９５ｃＤＮＡ。将该片段亚克隆至ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ克隆质粒中,以双脱氧链末端终止法对克隆质粒直接测序。接着将ｈＴＰＯ１９５ｃＤＮＡ插入到原表达质粒ｐＥＴ２８－ａ中,转化大肠杆菌ＢＬＲ２１（ＤＥ３）,进行诱导表达,以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ方法及免疫印迹法进行检测。结果 得到的ｈＴＰＯ１９５ｃＤＮＡ与文献报道的序列完全一致。经诱导后ｈＴＰＯ基因在大肠杆菌中获得表达,目的蛋白占总菌体蛋白的１０％,以免疫印迹法证实表达产物正确。结论 得到ｈＴＰＯ１９５ｃＤＮＡ,并在原核细胞中获得表达,得到截短形式的ｒｈＴＰＯ１９５。     

BPI23—Fcγ1重组蛋白核表达载体的构建、表达和生物学活性的测定

目的：构建ｐＢＶ－ＢＰＩ６００－Ｆｃγ１７００重组表达载体,转化大肠杆菌ＤＨ５α,诱导表达ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１抗菌重组蛋白。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从ＨＬ－６０细胞和正常人白细胞ｍＲＮＡ中扩增编码ＢＰＩ２３和ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｆｃγ１）的基因;通过连接反应构建重组克隆载体和重组表达载体;转化感受态大肠杆菌ＤＨ５α,通过温控诱导表达ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１重组蛋白;测定ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１重组蛋白的抗菌及免疫学活性。结果：⑴ＲＴ－ＰＣＲ获得预期的扩增产物－ＢＰＩ６００ｂｐ和Ｆｃγ１７００ｂｐ基因片段;⑵成功构建ｐＵＣ１８－ＢＰＩ１８０、ｐＵＣ１８－ＢＰＩ４２０和ｐＵＣ１８－Ｆｃγ１７００重组克隆载体,ＤＮＡ测序结果与文献报道一致;⑶成功构建ｐＢＶ－ＢＰＩ６００－Ｆｃγ１７００重组表达载体,酶切图谱分析与预期结果相符;     

人CTLA-4胞外区cDNA的克隆及Ig融合蛋白表达载体的构建

目的 克隆人ＣＬＴＡ－４胞外区ｃＤＮＡ－４胞外区与人免疫球蛋白ＩｇＧ Ｆｅ融合蛋白表达载体,为研究ＣＴＬＡ－４／Ｉｇ融合蛋白及其临床应用奠定基础。方法 从抗人ＣＤ３单克隆抗体和ＰＭＡ活化的健康人中国外周血淋巴细胞总ＲＮＡ中,扩增人ＣＴＬＡ－４基因胞外区ｃＤＮＡ片段,经ＨｉｎｄⅢ＋ＢｃｌⅠ双酶切后定向插入Ｉｇ融合蛋白表达载体。结果 从活化人Ｔ细胞中扩增出人ＣＴＬＡ－４胞外区ｃＤＮＡ片段,并将其正确插     

人酪氨酸酶相关蛋白-2的cDNA克隆及表达

目的 克隆酪氨酸酶相关蛋白－2（TRP－2）编码基因，表达TRP－2蛋白。方法 从培养的人黑素细胞中提取总RNA，反转录成cDNA，通过PCR方法扩增TRP－2编码基因，克隆至pUC19载体并测序，再亚克隆至谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融全表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达TRP－2／GST融合蛋白。结果 从培养的人黑素细胞中扩增出编码TRP－2的cDNA，序列测定证实与文献报道的序列一致；成功构建了GST融合表达载体pGEX-4T-1/TRP-2,表达了TRP－2／GST融合蛋白。结论 成功克隆了人TRP－2基因，构建了GST融合表达载体并表达了TRP－2／GST融合蛋白。     

人bFGF基因克隆表达及表达产物的纯化和生物学活性分析

目的：通过融合蛋白表达方式将编码人碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）ｃＤＮＡ在大肠杆菌ＤＨ５ａ中的表达,为ｂＦＧＦ进一步研究提供材料来源,方法：用多聚酶链反应（ＰＣＲ）及ＤＮＡ重组技术将ＰＣＲ产物克隆到ｐＧＥＭ－５Ｚ载体并测序,然后克隆到表达载体ｐＸＨ上。结果：转化重组质粒ｐＬＸ１的大肠杆菌经４２℃温控诱导４￣５ｈ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示融合蛋白的分子量约３５０００,薄层扫描分析表明该蛋白占菌体     

人表皮生长因子cDNA序列分析及其在大肠杆菌中的表达

应用逆转录聚合酶链反应从人脐静内皮细胞ＲＮＡ中扩增了表皮生长因子的ｃＤＮＡ，采用基因重组技术克隆到ｐＧＥＭ－３ｚｆ载体中，经全自动荧光测序仪测定了其序列。在ＰＣＲ扩增引物上分别加有起始密码子和终止密码子，以利于原核表达。经亚克隆，ＥＧＦｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＢＶ２２０的Ｅｃｏ ＲＩ，ＳｍａⅠ位点上，在大肠杆菌ＤＨ５α中进行表达。     

期刊文摘

ＯＰＧ与ＭＢＰ融合蛋白在大肠杆菌中的表达[刘继中 ,纪宗玲 ,陈苏民 ,胡蕴玉 ,李　毅 ,张晓楠 .细胞与分子免疫学杂志 ,2 0 0 2 ;18(6 ) :5 5 1 5 5 3]　　目的　克隆人骨保护素 (ＯＰＧ)成熟肽段编码区基因 ,并在大肠杆菌中表达 .方法　采用ＲＴ ＩＦＣ ,扩增人ＯＰＧ成熟肽段编码区ｃＤＮＡ ,并克隆入原核表达载体 ｐＭＡＬ ｃ2ｘ中 ,转化ＢＬ2 1(ＤＥ3)ＰｌｙｓＳ大肠杆菌感受态细胞 .经 0 .1ｍｍｏｌ·Ｌ-1ＩＰＴＧ诱导后 ,收集菌体蛋白 ,进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定 .结果　获得人ＯＰＧ成熟肽段编码区ｃＤＮＡ …     

三种方法对日本血吸早抗原cDNA克隆的筛选和鉴定

利用融源表达、平板裂解法和ＰＣＲ扩增三种不同方法分别对日本血吸虫抗原ｃＤＮＡ基因进行鉴定和分析，８个免疫筛选阳性克隆均能在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达，表达蛋白分子量为１４０－１５０ｋＤａ，抗原ｃＤＮＡ基因经限制性内切酶ＥｃｏＲＩ酶解后，琼脂糖凝胶电泳显示其大小为７００－９００ｂｐ，ＰＣＲ能扩增出特异性条带，结果表明，上述三种方法能从蛋白质和核酸水平有铲地鉴定血吸虫抗原ｃＤＮＡ基因。