变形链球菌毒力因子GTF多肽疫苗研究近况

变形链球菌是龋病主要的病原菌。变形链球菌定植至牙表面为产生龋齿关键的一步。这一过程由蔗糖依赖和蔗糖非依赖两种机制所介导 ,而后一机制与葡糖基转移酶(ＧＴＦ)催化蔗糖合成可溶性和不可溶性的葡聚糖有关[1] 。所以 ,ＧＴＦ被认为是变形链球菌最重要的两种毒力因子之一。它在致龋过程中起的重要作用使它成为发展防龋疫苗的研究对象[2 ] 。随着免疫学、分子生物学和基因工程技术的发展 ,对变链菌ＧＴＦ认识的逐步深入 ,利用ＧＴＦ分子中与某种特定功能有关并具有免疫原性的氨基酸序列制作的多肽疫苗 ,成为免疫防龋研究的热点。ＧＴＦ的…     

GTF—PAc融合防龋DNA疫苗研究（Ⅲ）pGLUA—P免疫定菌鼠防龋研究

目的；了解GTF－PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA-P激发机体免疫反应和抑制龋病的能力。方法：将pGLUA-P和携带pac基因A－P基因片段的DNA防龋疫苗pCIA-P以颌下腺周围区域皮下注射（TSG）和股四头肌注射途径分别免疫定菌SD大鼠，以ELISA法检测血清和唾液中的抗体水平，采用Keyes法评估大鼠磨牙患龋情况。结果：pGLUA-P和pCIA-P经TSG免疫及pGLUA-P经股四头肌注射免疫组的血清抗PAc的IgG抗体水平明显高于对照组（P＜0．05），pGLUA-P和pCI-AP经TSG免疫组的唾液抗PAc的IgA抗体水平明显高于其余组（P＜0．05）；pGLUA-P经TSG免疫组的釉质龋和牙本质浅龋记分最低（P＜0．05）；经TSG免疫pGLUA-P组和pCIA-P组的牙本质中龋记分最低（P＜0．05）。结论：GTF－PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA-P可以有效地诱导机体的免疫反应，抑制龋病的发生和发展，防龋效果优于防龋DNA疫苗pCIA-P。     

变形链球菌ComE蛋白在大肠杆菌中的高效表达与纯化

目的:构建变形链球菌comE基因原核表达载体,诱导ComE 融合蛋白高效表达,获取高质量的ComE 融合蛋白.方法:提取变形链球菌基因组,PCR 扩增得到变形链球菌comE基因片段,BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后定向克隆到pET28a(+) 表达载体中,并转化入E. Coli BL21(DE3).IPTG 诱导融合蛋白表达,Western blot 鉴定表达产物.进行蛋白表达的可溶性鉴定,并优化诱导时菌液的A600值、IPTG 浓度、诱导时间和温度4 个表达条件.然后用优化的条件大量诱导表达ComE 融合蛋白,采用镍柱和分子筛两步法进行纯化.结果:经PCR、双酶切反应以及测序鉴定,重组质粒中的插入序列为comE基因的全长片段(753 bp),无碱基的突变与读码框架的偏移.Western blot 证实表达产物确为6×His-ComE 融合蛋白,相对分子质量约为33 000.目的蛋白在上清和沉淀中均有表达,且当A600 为0.4 时,加入IPTG 至终浓度0.10 mmol/L,37 ℃诱导4 h后表达量最大.结论:成功构建pET28a(+)-comE 原核表达载体,用优化后的6×His-ComE 融合蛋白在E. Coli BL21(DE3) 中的表达条件,获得纯化的变形链球菌ComE 融合蛋白.     

变形链球菌基因在埃希氏大肠杆菌中的克隆与表达

本研究在掌握 DNA 重组克隆技术的基础上,分离变链菌目的基因 DNA 片断,在体外与大肠杆菌载体 DNA 连接,将重组的 DNA 分子引入受体细胞,从分子水平上了解变链茵的致龋机制。     

变形链球菌葡糖基转移酶缺陷突变株粘了会特征的观察

为了揭示变形链球菌葡糖基转移酶在变链菌粘附中的作用，通过扫描电镜观察了其缺陷突变株对玻片的附粘。结果显示，在蔗糖存在的条件下，变链菌ＭＴ８１４８及其ＧＴａｓｅ缺陷株表面出不贩粘附模式。     

变形链球菌gbpA的葡聚糖结合区GBD肽段的纯化及葡聚糖结合功能实验

目的：纯化变形链球菌gbpA的葡聚糖结合区GBD肽段。方法：蛋白质技术：金属螯合亲和层析，葡萄糖结合实验。结果：通过蛋白质技术及金属螯合亲和层析，纯化出可融性融合蛋白GBD。此蛋白可与α－1，6键葡聚糖结合。结论：通过基因重组技术成功纯化出变形链球菌gbpA的葡聚糖结合区GBD肽段并证实此重组蛋白具有葡聚糖结合功能。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白B基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 :在大肠杆菌中表达变形链球菌葡聚糖结合蛋白B基因 (glucanbindingproteinB ,gbpB) ,并对重组蛋白进行初步纯化 ,为下一步制备多抗和进行相关的研究奠定基础。方法 :将克隆到的gbpB全长编码区基因克隆到表达载体 pPROEXTMHTb ,构建表达质粒 pPROEXTMHTb - gbpB ,以大肠杆菌E .coliBL2 1(DE3)为宿主菌进行诱导表达 ,表达产物经镍 -次氮基三乙酸 (Ni-NTA)柱进行亲和层析纯化。结果 :工程菌经IPTG诱导 3h后 ,在SDS -PAGE上出现一条新的蛋白条带 ,相对分子量 (Mr)为 4 .5～ 5 .0× 10 3 ,以可溶形式存在 ,经Ni-NTA柱纯化后获得纯度较高的重组葡聚糖结合蛋白B。结论 :获得Mr为 4 .5～ 5 .0× 10 3 的重组葡聚糖结合蛋白B     

GTF—PAc融合防龋DNA疫苗的研究（Ⅰ）携带GLU基因片的真核表达质粒pGLU的构建

目的：将变形链球菌糖基转移酶GTF－I的编码葡聚糖结合区（GLU）的序列克隆到真核载体pCI中,为构建GTF－PAc融合防龋DNA疫苗做准备。方法：用PCR的方法扩增含gtfB基因的重组质粒pYNB13的GLU区序;将载体pCl和GLU扩增片段分别酶切,外体连接,构建成真核表达质粒pGLU,酶切电泳鉴定。结果：PCR获得了glu目的的片段,质粒pGLU含有glu目的片段,结论：构建了含有gtfB基因重要抗原决定簇区的真核表达质粒pGLU。     

变形链球菌GTase高表达株免疫奶牛应用研究

目的 观察防龋疫苗免疫奶牛后,牛乳中特异性抗体的产生规律。方法：应用变链菌ＧＴａｓｅ－１高表达株免疫怀孕奶牛,收集牛乳,经间接ＥＬＩＳＡ检测牛乳中特异性抗变链球菌抗体。结果：抗变链菌特异性抗体出现于初服中,其含量于分娩后１０ｄ达到高峰,在末次免疫后,特异性抗体可在６０ｄ内维持在较高水平,巴氏消毒（６２．５℃,３０ｍｉｎ）对免疫牛乳ＩｇＧ活性无明显影响,结论：变链菌ＧＴａｓｅ高产株可诱导奶牛分泌高效     

变形链球菌表面蛋白P1的提取纯化

目的：探索高效率、条件温和的方法分离纯化有黏附活性的变形链球菌表面蛋白P1,为进一步分析表面蛋白P1生物学特性奠定实验基础。方法：硫酸铵分级沉淀法提取变形链球菌表面蛋白P1粗提物,在AKTAexDlorer100快速纯化工艺开拓系统中采用SepharoseXL填料（强阴离子交换剂）分离纯化变形链球菌表面蛋13P1。通过黏附抑制实验检测蛋白的黏附活性。结果：蛋白乡电化后SDS—PAGE电泳可见分子量约185kD的单一蛋13条带。该蛋白可明显抑制变形链球菌在唾液包被羟基磷灰石表面的黏附（P〈0．05）。结论：运用硫酸铵分级盐析沉淀粗提变形链球菌表面蛋白,在AKTAexplorer100快速纯化工艺开拓系统中采用强阴离子交换层析可获得较高得率的、保持黏附活性的纯化P1蛋白。     

变形链球菌gbpA的葡聚糖结合区GBD的分子克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：克隆变形链gbpA的葡聚糖结合区GBD的基因片段，并使其在大肠杆菌中获得表达。方法：PCR技术克隆GBD片段及蛋白重组融合表达技术获得其在大肠杆菌中的表达。结果：成功克隆变形链球菌gbpA的葡聚糖结合区GBD的基因片段，并在大肠杆菌中得到表达。结论：利用分子生物学技术能够成功克隆目的基因并获得融合蛋白的表达。     

变形链球菌的葡萄糖基转移酶的分离和纯化

选用AHT(a)、MTA6R(C)、LM7(e)3种菌株作实验,对其所产生的葡萄糖基转移酶的分离和纯化方法进行探讨。细菌培养物上使用硫酸铵盐析,得葡萄糖基转移酶的粗酶;再用40％和55％乙醇沉淀,分别得水溶性和非水溶性葡萄糖基转移酶粗酶,再将MT6R菌的55％乙醇沉淀提取的酶进行羟基磷灰石层析,得两个蛋白吸收峰,第一、二两峰分别是纯化的非水溶性和水溶性葡萄糖基转移酶,经圆盘电泳鉴定,前者为均一的,后者为非均一的。     

变形链球菌表面蛋白真核表达质粒pcDNA3／pacA和pcDNA3／pacP在哺乳动物细胞中

目的：研究变形链球菌表面蛋白真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ及ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ在哺乳动物细胞中的转录及表达情况。方法：利用脂质体介导的转染技术,将真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ及ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ分别转染ＣＯＳ－７细胞,１ｍｇ．ｍｌ＾－１ Ｇ４１８加压筛选获取稳定转染的ＣＯＳ－７细胞之后,采用ＲＴ－ＰＣＲ法、ＬＳＡＢ法、流式细胞术及Ｗｅｓｔｅｍ印迹法,对真核表达质粒中插入基因ｐａｃ－Ａ和ｐａｃ－Ｐ的转录及表达产物进行检测。结果：真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ及ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ的插入基因在导入哺乳动物细胞后具有转录和翻译活性,表达的蛋白质产物可位于胞内、胞膜及胞外。结论：构建的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ和ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ能在哺乳动物细胞中表达插入基因所编码的蛋白质,为进一步     

釉成熟蛋白amelotin在大肠杆菌中的表达和纯化

目的:观察釉成熟蛋白(amelotin)基因聚合酶链反应产物在大肠杆菌中的表达,并获得纯化的釉成熟蛋白.方法:利用His融合蛋白表达载体pET32a(+)转化大肠杆菌BL21,通过异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,并改变诱导时间、温度、IPTG浓度来优化表达条件,然后在优化的条件下进行大量表达并收菌;His镍柱纯化表达的蛋白.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白表达、纯化情况.结果:电泳结果分析表明:amelotinPCR扩增产物在大肠杆菌中获得高效表达,大小约4×104,纯化得到的amelotin纯度较高.结论:成功得到纯化的amelotin,为进一步制备抗体奠定基础.     

变形链球菌传播和感染的研究进展

变形链球菌群细菌 (ｍｕｔａｎｓｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ,简称ＭＳ) ,特别是变形链球菌 (Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ,简称变链菌 )和远缘链球菌 (Ｓ .ｓｏｂｒｉｎｕｓ)是人类最主要的致龋菌。预防ＭＳ的感染 ,干扰ＭＳ的传播途径 ,可有效减少这种微生物对人体的危害 ,因此 ,确定ＭＳ感染源以及探索其传播到易感者的方式 ,将有助于阻断或延迟ＭＳ的传播。近年来 ,随着以ＤＮＡ为基础的分子生物学方法的发展 ,ＭＳ在人类传播的研究进展方面迅速 ,本文就这方面的研究内容作一综述。1 ＭＳ的分子流行病学研究方法准确鉴定同种细…     

变形链球菌和远缘链球菌致龋性的研究近况

变形链球菌和远缘链球菌是人类牙齿的主要致龋菌。近年研究表明两种细菌的生物学特性存在一定差异，远缘链球菌与龋病的活跃性密切相关，本文对两种细菌的流行病学、粘附机理、多的合成产酸酸耐酸进行了综述，为今后龋病病因学研究，抗龋疫的制备提供参考。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段在大肠杆菌中的表达

目的原核表达变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因(glucan-bindingproteinCgene,gbpC)特异片段。方法将克隆获得的约0.45kb的gbpC基因特异片段经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切后,定向插入pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1/gbpCE原核融合表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,酶切及PCR鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropy1-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白GST-GbpCE,SDS-PAGE检测表达产物。结果在SDS-PAGE凝胶上出现一条新生蛋白质条带,其相对分子质量约为43000,与预计大小相符合。结论成功表达gbpC特异片段,获得了融合蛋白GST-GbpCE,可用于制备GbpC抗体。