p53基因诱导白血病细胞凋亡的机制研究

目的：探讨p53基因诱导白血病细胞凋亡过程中内源性TGF-β1、TNF-α、端粒酶活性、Bcl-2表达的改变及其意义。方法：利用脂质体将温敏型p53基因[pN53cG(Val135)]导入p53基因缺失的白血病细胞系HL-60、K562细胞，经G418筛选，获得稳定表达p53蛋白的抗性克隆细胞HL-60pN53cG，K562-pN53cG细胞。采用缺口末端标记法、片段化DNA分析、RT-PCR、定量PCR、ELISA、PCR-ELISA、流式细胞术等方法检测外源性p53基因诱导白血病细胞凋亡过程中TGF-β1、TNF-α、bcl-2、端粒酶反转录酶(hTERT)mRNA表达变化、细胞上清TGF-β1水平和端粒酶活性及。TGF-β1、TNF-α反义PS-ODNS对白血病细胞凋亡和Bcl-2蛋白表达的影响。结果:①外源性野生型p53基因诱导细胞凋亡过程中内源性。TGF-β1和TNF-α mRNA表达上调，bcl-2及hTERT mRNA表达下调，细胞培养上清TGF-β1蛋白水平明显升高，端粒酶活性水平下降；②TGF-β1、TNF-α反义PS-ODNS能够明显抑制野生型p53基因诱导细胞凋亡的发生，并使细胞bcl-2 mRNA及蛋白表达恢复到处理前的水平。结论：p53基因诱导白血病细胞凋亡可通过上调内源性TGF-β1和TNF-α水平，下调hTERT mRNA表达及端粒酶活性，抑制bcl-2基因表达而发挥作用。     

外源笥野生型p53基因对K562细胞的作用

为了研究外源性野生型p53基因（wt-p53）对K562细胞的作用。探索p53基因治疗白血病的可能性,两种p53基因pC53-SN3(wtp53cDNA)和pN53cG(Val135)(32.5℃表现wtp53功能）通过脂质体介导的DNA转染法导入无P53蛋白表达的K562细胞,获得细胞克隆K-SN3及K-pN53cG。通过生长曲线、克隆形成率、细胞周期分析,片段化DNA及TUNEL检测,联苯胺染色等指标观察外源性wtp53基因对K562细胞的影响,结果显示;（1）RT-PCR检测K-SN3及K-pN53cG均获表达p53基因,但前表达明显低于后;（2）K-SN3,K-pN53cG(32.5℃）细胞生长减慢,克隆形成明显受抑,且G0/G1期增加,S期减少,以上现象均以K-pN53cG细胞（32.5℃）更明显;（3）K-pN53cG932.5℃）可检测到明显凋亡改变,而K-SN3则向红系分化,说明wtp53基因表达使K562细胞生长受到明显抑制,并提示p53低表达可能促使K562细胞向红系分化,而p53高表达诱导K562细胞出现凋亡,wtp53对于白血病基因治疗有潜在的应用价值。     

转导野生型p53基因提高K562细胞对紫外线诱导的细胞凋亡的敏感性

目的：观察野生型ｐ５３基因转染的Ｋ５６２细胞对紫外线诱导其细胞凋亡的影响。方法：应用基因转染技术将重组野生型ｐ５３的逆转录病毒载体转导ｐ５３蛋白缺失的Ｋ５６２细胞，用紫外线照射Ｋ５６２ｐ５３细胞不同时间后再培养不同时间，用ＤＮＡ片段化和细胞ＤＮＡ原位末端标记技术检测细胞凋亡情况。结果：紫外线照射Ｋ５６２ｎｅｏ和Ｋ５６２ｐ５３细胞８分钟后再培养７～１２小时，Ｋ５６２ｎｅｏ和Ｋ５６２ｐ５３两组细胞的凋亡差异显著。结论：野生型Ｐ５３蛋白在Ｋ５６２细胞表达后，能加速紫外线诱导的Ｋ５６２细胞凋亡，为临床应用ｐ５３进行基因治疗提供了有意义的实验基础     

脉冲电场联合野生型p53基因诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡

背景:在前期研究基础上,设想将基因电转染作为脉冲电场治疗恶性肿瘤的辅助方法。目的:探讨脉冲电场联合抑癌基因野生型p53基因诱导人宫颈癌hela细胞发生凋亡及相互作用。方法:采用空质粒及含有野生型p53的质粒转染Hela细胞得到Hela-vector、Hela-p53细胞,将Hela细胞、Hela-vector和Hela-p53细胞分别施加固定脉宽100μs、频率1Hz、脉冲数8个、电场强度为1500V/cm的脉冲电场处理。结果与结论:相同参数脉冲电场作用于各组细胞12h后,MTT结果显示Hela-p53组细胞吸光度明显低于Hela组(P<0.05);流式细胞仪及RT-PCR检测结果显示Hela-p53组的早期凋亡率和p53mRNA表达较Hela组明显增加;Westernbolt及激光共聚焦显微镜结果显示与Hela组比较,Hela-p53组细胞Bax蛋白表达明显上升,而Bcl-2蛋白则明显下降,Casepase-3相对荧光强度明显增强。表明野生型p53基因对宫颈癌Hela细胞生长有明显的抑制作用,野生型p53基因可以提高脉冲电场诱导宫颈癌Hela细胞凋亡的作用。     

转导野生型p53的K562细胞出现生长抑制和凋亡

把重组有编码野生型p53的逆转录病毒载体转导到p53蛋白缺失的K562细胞,以观察野生型p53蛋白在K562细胞表达后对K562细胞增殖和凋亡的影响。应用RT-PCR和Western印迹杂交方法检测K562细胞p53表达,应用流式细胞仪计数检测细胞的增殖,采用梯形DNA和细胞形态学方法检测细胞凋亡变化。研究结果表明:感染pLXSN-p53病毒24小时后,K562细胞p53表达阳性,K562-p53细胞的生长受到抑制,少数细胞进入凋亡状态。结论提示,野生型p53可促进p53表达阴性的K562细胞生长抑制与凋亡。     

氧化低密度脂蛋白对血管平滑肌细胞早期凋亡的影响

目的：观察低密度脂蛋白(ox—LDL)对培养血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的影响，探讨ox—LDL致VSMC调亡的相关机制。方法：体外培养Wistar大鼠VSMC并确认细胞指数生长期，用苔盼蓝拒染计数方法观察ox—LDL刺激VSMC对增殖的影响，流式细胞分析检测ox—LDL刺激VSMC凋亡以及COx—2抑制剂NS—398对凋亡的影响。结果：体外培养的VSMC正常生长后，用35mg儿和50mg／Lox—LDL可使培养VSMC的生长期提前到12—24h，表现出明显细胞增殖；NS—398干预ox—LDL组VSMC增殖受到减弱。流式细胞分析ox—LDL组VSMC早期凋亡率较对照组明显增加，而NS—398、ox—LDL刺激VSMC凋亡阳性率亦较对照组明显增加。结论：ox—LDL刺激可使培养VSMC表现明显细胞增殖，虽NS—398可减弱VSMC的增殖，但却协同ox—LDL导致凋亡作用的增强。     

超声诱导培养大鼠血管平滑肌细胞凋亡的研究

目的　研究不同剂量超声对培养大鼠血管平滑肌细胞 (VSMC)凋亡的影响 ,为超声治疗的临床应用提供实验依据。方法　不同剂量、频率为 650 k Hz的超声波辐照体外培养的大鼠血管平滑肌细胞。照射后 2 4h,用原位末端脱氧核苷酸转移标记 (TUNEL )技术检测凋亡细胞 ,用免疫组织化学方法检测 B细胞淋巴瘤 -2伴 Bax蛋白表达。结果　 1.0 W/ cm2及 0 .5W/ cm2超声辐照细胞 5min,2 4h后细胞凋亡率明显及 Bax蛋白表达率分别显著高于对照组 (P<0 .0 5)。结论　声强为 0 .5W/ cm2 及 1.0 W/ cm2 超声辐照大鼠血管平滑肌细胞 5min,能诱导其凋亡的发生及 Bax蛋白表达率的提高     

外源性野生型p53基因在HL60—n细胞表达的意义

为研究外源性野生型ｐ５３基因在白血病细胞表达意义，采用重组逆转录病毒载体介导的人野生型ｐ５３ｃＤＮＡ转移ＨＬ６０－ｎ细胞。结果发现外源性野生型ｐ５３基因可以诱导ＨＬ６０－ｎ细胞死亡，死亡细胞呈凋亡的形态学特征。     

外源性野生型p53基因对HL-60细胞的作用

野生型ｐ5 3基因是一种肿瘤抑制基因 ,急性髓系白血病(ＡＭＬ)患者伴有 17号染色体异常 [ｉ(17ｑ) ]者ｐ5 3基因点突变的发生率可高达 40 %。大多数ＡＭＬ细胞系 ,如ＨＬ 6 0、ＣＭＫ、ＭＬ 1、Ｕ937均可检出ｐ5 3基因严重缺失或者突变[1,2 ] 。我们利用脂质体介导法将两种ｐ5 3基因ｐＣ5 3 ＳＮ3(含人野生型ｐ5 3ｃＤＮＡ)、ｐＮ5 3ｃＧ(Ｖａｌ135 ) (32 .5℃表现野生型ｐ5 3基因功能 )分别导入Ｐ5 3蛋白缺失的ＨＬ 6 0细胞中 ,观察它的表达及其对ＨＬ 6 0细胞的影响。材料和方法1　细胞系及培养体系　ＨＬ 6 0细胞由福建省医学科学研究…     

tMfn2基因诱导血管平滑肌细胞的凋亡

背景:线粒体融合素2蛋白,主要通过磷脂酰肌醇3激酶,蛋白激酶B诱导血管平滑肌细胞凋亡.去除穿膜区序列的线粒体融合素2蛋白,相对分子质量减小41%,诱导凋亡作用可能更强.目的:观察比较去除穿膜区序列的大鼠线粒体融合素基因2对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响及其相关的信号通路.设计、时间及地点:基因水平的对比观察实验.于2008-01/10在华中科技大学同济医学院附属同济医院分子心脏病中心实验室完成.材料:大鼠血管平滑肌细胞及携带半乳糖甘酶基因、携带线粒体融合素2基因和携带去除穿膜区序列线粒体融合素2基因的重组腺病毒均由陈光慧教授惠赠.方法:将大鼠血管平滑肌细胞传代培养3～10代后随机分为4组,①空白对照组:不加干预.②携带半乳糖甘酶基因的对照组:感染携带半乳糖甘酶基因的重组腺病毒.③携带线粒体融合素2基因的实验组:感染携带线粒体融合素2基因的重组腺病毒.④携带去除穿膜区序列线粒体融合素2基因的实验组:感染携带去除穿膜区序列线粒体融合素2基因的重组腺病毒.主要观察指标:①重组腺病毒感染血管平滑肌细胞24 h后观察完整的和去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因的表达情况.②感染后24,48和72 h采用流式细胞术、酶联免疫吸附法观察细胞凋亡情况.③免疫印迹分析病毒感染血管平滑肌细胞24 h后磷酸化蛋白激酶B表达变化.结果:①感染后完整的和去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因在血管平滑肌细胞中均有表达.②去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用显著增强,且呈时间依赖性(P<0.01).③两个实验组中磷酸化蛋白激酶B水平均明显降低,但去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因实验组更显著(P<0.01).结论:去除穿膜区序列的线粒体融合素基因2诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用更强,其机制与抑制蛋白激酶B磷酸化有关.     

腺病毒介导白细胞介素-10基因转染抑制血管平滑肌细胞的增殖及机制

目的：观察白细胞介素（interleukin，IL-10基因转染对血管平滑肌细胞增殖的影响，初步研究其相关机制。方法：不同感染复数（multiplicity of infection，MOI）的IL-10重组腺病毒（Ad／IL-10）转染原代培养的人脐带动脉平滑肌细胞（HUASMcs），用酶联免疫吸附试验检测培养上清中IL-10的表达，噻唑蓝法测定吸光度值（OD570值），绘制细胞生长曲线，流式细胞术分析细胞周期、细胞凋亡，实时荧光定量聚合酶链反应检测p21的表达。结果：MOI=100时培养上清中IL-10含量最高，为5．746ng／ml；转染72h、96h，MOI为100、150、200组与MOI为10、20组及空白对照组比较，显著抑制HUASMCs的增殖（P〈0．01）；与空白及空载体转染对照组比较，MOI100的Ad／IL-10转染组的Gn-1期细胞数、凋亡细胞的平均百分数均显著增加（P〈0．01），p21基因表达的拷贝数较低。结论：MOI为100的Ad／IL-10可有效抑制HUASMCs的增殖，此作用与细胞周期阻滞和凋亡有关，为ID-10基因转染治疗血管内膜增生提供了理论依据。     

腺病毒载体介导肝细胞生长因子基因对血管平滑肌细胞的作用

目的：研究腺病毒载体介导肝细胞生长因子（HGF）基因感染血管平滑肌细胞后在缺氧和正常供氧时的细胞凋亡和迁移情况。方法：以肝细胞中抽提的总RNA为模板，反转录cDNA，采用逆转录-聚合酶链反应技术（RT-PCR）获得HGF基因，并引入酶切位点，转染大肠杆菌，筛选阳性菌落，经酶切及测序，转染腺病毒，经三轮扩增，制备高效表达HGF基因腺病毒载体（Ad-HGF），再感染人血管平滑肌细胞（VSMC）为观察组（Ad-HGF组）；未感染为阴性对照组（DMEM组）；以含人工合成HGF为阳性对照组（HGF组），分别在正常供氧和缺氧情况下观察细胞的凋亡和迁移情况。结果：与DMEM组及HGF组比较，Ad-HGF组在缺氧和正常供氧时VSMC的迁移率及凋亡细胞数差异均无显著性意义。结论：HGF基因感染VSMC后，在缺氧情况下并不促进VSMC的迁移。亦不抑制其凋亡。     

洛伐他汀对血管内皮细胞与平滑肌细胞增殖调节作用的对比实验研究

目的探讨洛伐他汀对人血管内皮细胞与平滑肌细胞的调节作用及其调节差异性。方法配制含不同浓度洛伐他汀的培养基f0、0．001、O．01、0,1、1、10μmol／L）,分别于96孔板中进行人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与血管平滑肌细胞（VSMCs）培养,在培养24、72、120h后以MTT法对两种细胞进行细胞活性及增殖情况评估。结果培养24h,0．1μmol／L的洛伐他汀对HUVECs存在明显的促进增殖作用;培养72h,1斗mol／L的洛伐他汀对HUVECs存在明显的促进增殖作用;培养120h后,O．001、0．01、0．1、1μmol／L的洛伐他汀与对照组相比HUVECs增殖活性无明显差异,10μmol／L的洛伐他汀表现出明显的增殖抑制作用。培养24h和120h,各浓度组洛伐他汀对VSMCs的增殖无显著调节作用;培养72h,0．001、0．01、1、10μmol／L的洛伐他汀对VSMCs的增殖存在部分抑制作用,未发现剂量相关规律性。结论洛伐他汀对人血管内皮细胞增殖存在双向调节作用,与浓度相关。体外浓度0.1、1μmol／L时可以表现出明显的促进增殖作用,浓度达10μmol／L时则表现出抑制作用。相同浓度下,洛伐他汀无促进VSMCs增殖的作用,并且存在部分抑制VSMCs增殖的作用。     

Gax基因过表达对低氧性大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及周期的作用

目的:探讨生长终止特异性同源盒(growth arrest-specific homeobox,Gax)基因转染在低氧性大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)中过表达及其对细胞增殖和周期的作用。方法:腺病毒介导Gax基因(adenovirus expressing Gax cDNA,Ad-Gax)转染体外培养的PASMCs。在常氧(21%O2)和低氧(2·5%O2)2、6、12、24和48h条件下,利用RT-PCR和免疫细胞化学法分别测定转染前后PASMCs中Gax mRNA和蛋白表达;用四唑盐(MTT)比色法和流式细胞术检测各组PASMCs增殖和周期。结果:RT-PCR和免疫细胞化学法证实Ad-Gax转染后PASMCs中Gax能稳定过表达;MTT比色试验结果显示,未转染组常氧和低氧2、6、12、24和48h时PASMCs吸光度值分别为0·38±0·02、0·44±0·11、0·48±0·05、0·59±0·07、0·67±0·03和0·75±0·18,低氧组比常氧组明显增加(P<0·05);而转染组各时相吸光度值分别为0·17±0·04、0·15±0·02、0·24±0·11、0·33±0·13、0·31±0·03和0·37±0·09,低氧组比未转染组同时相点组明显降低(P<0·05、0·01)。流式细胞仪检测结果表明,Ad-Gax转染对常氧条件下PASMCs的周期没有显著影响,但可使低氧处理后PASMCs的G0/G1比例较未转染组显著增高、S G2/M比例显著降低(P<0·01);结论:Gax基因过表达能够抑制低氧性PASMCs的增殖。     

p53基因转导诱发慢性髓性白血病患者骨髓细胞凋亡

研究及应用细胞凋亡相关基因参与肿瘤治疗是基因治疗的一个重要领域。细胞凋亡相关基因中研究得最深入的是p53基因。已经有报道转移野生型p53基因抑制肿瘤细胞的体外实验,或转p53基因抑制动物体内成瘤性的实验。为进一步接近人体内基因治疗,我们采用逆转录病毒载体将p53基因转导至CML细胞,初步的实验结果提示,转导的p53基因能引起白血病细胞生长抑制和凋亡。     

雷公藤甲素诱导人冠状动脉平滑肌细胞凋亡的实验研究

目的:研究雷公藤甲素对人冠状动脉平滑肌细胞凋亡的影响。方法:采用MTT实验检测雷公藤甲素对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞增殖的影响,运用流式细胞术、基因组DNA电泳观察凋亡特征性"梯状"条带检测细胞凋亡,采用Western-blot检测P53蛋白表达变化。结果:雷公藤甲素对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞具有明显的抑制作用。流式细胞仪检测显示雷公藤甲素可以显著诱导人冠状动脉平滑肌细胞凋亡,DNA电泳显示雷公藤甲素作用于人冠状动脉平滑肌细胞后出现凋亡细胞特有的DNA阶梯状条带。P53蛋白表达水平呈浓度依赖性表达上调。结论:雷公藤甲素可能通过激活P53基因表达抑制人冠状动脉平滑肌细胞的生长并诱导其凋亡。     

整合素受体信号在血管平滑肌细胞增殖及迁移中作用机制研究进展

肺血管重构是肺动脉高压的病理学特征,血管重构中肺血管平滑肌细胞增殖、迁移是当今心血管领域的研究热点。近年来,发现整合素与细胞外基质的相互特异性作用导致许多细胞内结构性和调节性因子的聚集和传递细胞信号,参与调节细胞骨架的组装和解聚,调节肌动蛋白纤维丝的稳定和更新,在细胞表型的转换中也起着重要作用。因此,探讨整合素受体信号在血管平滑肌细胞增殖和迁移中的作用机制对于寻找干预肺血管重构的新途径具有重要意义。     

支架涂层材料对血管平滑肌的影响

[目的]探讨支架涂层材料对血管平滑肌的影响.[方法]以SD大鼠主动脉血管平滑肌细胞为载体,采用MTT试验检测苯乙烯丁烯共聚物及多聚乳酸涂层材料对血管平滑肌细胞的增殖能力的影响,流式细胞仪检测细胞周期.[结果]随着培养天数增加,苯乙烯丁烯共聚物组和多聚乳酸组平滑肌细胞数量都呈递增趋势;相同时间内苯乙烯丁烯共聚物组和多聚乳酸组细胞数量显著低于对照组(P<0.05),但苯乙烯丁烯共聚物组与多聚乳酸组差异无显著性(P>0.05);与对照组相比,苯乙烯丁烯共聚物及多聚乳酸组细胞周期均有不同程度变化,主要表现为G0/G1期细胞数显著高于对照组,S期、G2/M期细胞数显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),苯乙烯丁烯共聚物组与多聚乳酸组比较差异无统计学意义(P>0.05).[结论]苯乙烯丁烯共聚物及多聚乳酸可能通过抑制细胞周期中的第1个调控点(G1→S限制点)抑制主动脉血管平滑肌细胞增殖,两种涂层材料之间无明显差异.