高密度脂蛋白对氧化型低密度脂蛋白抑制的血管平滑肌细胞一氧化氮释放的影响

为观察高密度脂蛋白是否能拮抗氧化型低密度脂蛋白对血管平滑肌细胞释放一氧化氮的抑制作用，培养了人脐动脉平滑肌细胞并用脂多糖和γ-干扰素诱导一氧化氮的释放。应用GRIESS试剂测定细胞培养基中亚硝酸盐的含量．以免疫组织化学染色和逆转录--聚合酶链反应分析诱导型一氧化氮合酶基因的表达。结果发现，氧化型低密度脂蛋白可使脂多糖和γ-干扰素诱导的平滑肌细胞一氧化氮合酶及其mRNA水平下降、抑制一氧化氮释放。而高密度脂蛋白能拮抗氧化型低密度脂蛋白对平滑队细胞释放一氧化氮的抑制作用。0．25g／L高密度脂蛋白即能显著增加一氧化氮的释放（P＜0．05），高密度脂蛋白浓度达到1．5g／L可使得一氧化氮的释放增加4．5倍。结果表明，高密度脂蛋白能提高一氧化氮合酶基因表达水平，促进一氧化氮的释放。高密度脂蛋白的作用具有浓度效应。     

Akt/eNOS信号途径调节内皮祖细胞存活和功能的实验研究

目的研究Akt/eNOS信号途径是否调节内皮祖细胞（EPC）的存活和功能。方法分离、培养EPC,然后与不同浓度氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）、硝基精氨酸甲酯（L—NAME）或triciribine孵育48h,一部分EPC与左旋精氨酸预处理后,再与oxLDL孵育。然后,检测EPC凋亡率及迁移、黏附和管状结构形成能力,同时检测磷酸化Akt的蛋白表达、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的蛋白及mRNA表达、一氧化氮的产生。结果oxLDL剂量依赖性地诱导EPC凋亡,抑制EPC迁移、黏附及管状结构形成能力,L—NAME和triciribine具有与oxLDL相似的作用。oxLDL的作用能被左旋精氨酸抑制。oxLDL降低磷酸化Akt及eNOS蛋白表达,oxLDL剂量为50μg／ml时下降率分别为（664±4）％和（684±9）％。而且,oxLDL降低EPCeNOSmRNA的表达及一氧化氮的产生,oxLDL剂量为50μg／ml时eNOSmRNA表达的下降率为（594±14）％。结论oxLDL通过调节Akt／eNOS信号途径调节EPC的存活和功能。     

高密度脂蛋白对氧化型低密度脂蛋白抑制的血管平滑肌细胞一氧化氮释放的影响

为观察高密度脂蛋白是否能损坏抗氧化型低密度脂蛋白对血管平滑肌细胞释放一氧化氮的抑制作用，培养了人脐动脉平滑肌细胞并用脂多和γ－博古纱诱导一氧化氮的释放。应用ＧＲＩＥＳＳ试剂测定细胞培养基中亚硝酸盐的含量，以免疫组织化学染色和逆转录－聚合酶链反应分析导型一氧化氮合酶基因的表达。结果发现，氧化型低密度脂蛋白可使脂多糖和γ－干扰素诱导的平滑肌细胞一氧化氮合酶及其ｍＲＮＡ水平下降，抑制一氧化氮释放。而高密     

一氧化氮对血管平滑肌细胞中Bcl-2、Bax、P53和Fas蛋白表达的影响

一氧化氨能抑制血管平滑肌细胞增殖和诱导其调亡。为深入了解一氧化氨对血管平滑肌细胞的生物学效应及其作用机制。本实验应用ＡＣＡＳ５７０共聚焦激光扫描显微镜系统，通过荧光免疫细胞化学方法，对一氧化氮作用下血管平滑肌细胞中调亡相关蛋白Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、Ｐ５３及Ｆａｓ的表达进行了定量检测。结果发现，一氧化氮能使血管平滑肌细胞中Ｂｃｌ－２表达降低，而使Ｂａｘ、Ｐ５３和Ｆａｓ表达升高。这些结果进一步证明了一氧化氮能诱导血管平滑肌细胞凋亡。同时，也说明Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、Ｐ５３和Ｆａｓ可能参与一氧化氨诱导的血管平滑肌细胞增殖抑制及调亡发生。     

Src在氧化型低密度脂蛋白诱导平滑肌细胞表型转化中的作用

目的:探究Src对氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)诱导血管平滑肌细胞表型转化的调控作用。方法:体外培养小鼠原代平滑肌细胞,以不同浓度的oxLDL刺激血管原代平滑肌细胞,检测平滑肌细胞表型分子平滑肌细胞表型肌球蛋白重链11(MYH11)、巨噬细胞表型CD68的表达变化,以及Src的激活情况。通过小干扰RNA(siRNA)抑制Src蛋白表达,Src特异性抑制剂PP2抑制Src激活,观察Src对oxLDL诱导的平滑肌细胞表型转化的影响。结果:分别以0、12.5、25.0、50.0μg/mL oxLDL刺激血管平滑肌细胞后发现MYH11的mRNA及蛋白表达逐渐下降(P<0.05),CD68的mRNA及蛋白表达逐渐升高(P<0.05)。以不同浓度(12.5、25.0、50.0μg/mL)、不同时间(15、30、60 min)的oxLDL刺激平滑肌细胞后,发现Src活性逐渐升高(P<0.05)。敲减Src siRNA或以PP2抑制Src蛋白活性后,oxLDL诱导的平滑肌细胞向巨噬细胞转化的分子表型的表达水平受到抑制。结论:oxLDL可以通过提高Src活性,进而诱导平滑肌细胞表型改变。     

非对称性二甲基精氨酸促进大鼠腹腔巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶表达

目的观察非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)对培养的大鼠腹腔巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响,探讨其在脂质沉积中的作用及机制。方法分组①正常对照组以PBS缓冲液与巨噬细胞共孵育,②氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)组在巨噬细胞培养液中加oxLDL(50mg/L),③O A组在巨噬细胞培养液中加oxLDL(50mg/L)和ADMA(20μmol/L),④O A L组在培养液中加ox-LDL(50mg/L)、ADMA(20μmol/L)、L-Arg(1.2mmol/L)。以硝酸还原酶法和化学比色法分别测定培养液中一氧化氮(NO)含量与iNOS活力,以RT-PCR和Western Blotting分别检测iNOSmRNA和蛋白表达。结果①OxLDL组与O A组NO含量降低,iNOS活力升高,且以O A组明显,与正常对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.05);NO与iNOS呈负相关(r=-0.697,P<0.05)。②O A组iNOS mRNA和蛋白表达增强,与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论ADMA抑制大鼠腹腔巨噬细胞合成NO,增强iNOS基因与蛋白表达,可能是ADMA促使巨噬细胞转变为泡沫细胞、促进动脉粥样硬化发生发展的机制之一。     

核因子-κB介导非对称性二甲基精氨酸上调大鼠腹腔巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶的表达

目的:探讨非对称性二甲基精氨酸(ADMA)上调大鼠腹腔巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达是否受核因子-κB(NF-κB)调控。方法:分离培养原代Wistar大鼠腹腔巨噬细胞。分组:①正常对照组:以含10%胎牛血清(FBS)DMEM培养液与巨噬细胞共孵育;②氧化型LDL(oxLDL)组:在培养液中加oxLDL50mg/L;③A+O组:在培养液中加ADMA(15μmol/L)和oxLDL(50mg/L);④P+A+O组:在培养液中加NF-κB特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC,25μmol/L)、ADMA(15μmol/L)和oxLDL(50mg/L)。以实时荧光定量PCR和Westen blotting分别检测iNOSmRNA和蛋白表达,以电泳迁移率变动分析(EMSA)和增强化学发光法(ECL)检测NF-κB活性。结果:①与正常对照组相比,oxLDL组与A+O组iNOSmRNA和蛋白表达增强,以A+O组尤为明显,2组比较差异有统计学意义(P0.05);P+A+O组iNOSmRNA和蛋白表达降低,与A+O组比较差异有统计学意义(P0.05)。②与正常对照组相比,oxLDL组与A+O组NF-κB活性增强,以A+O组尤为明显,2组相比差异有统计学意义(P0.05);P+A+O组NF-κB活性降低,与A+O组相比差异有统计学意义(P0.05)。③相关分析:NF-κB活性与iNOSmRNA和蛋白表达量均呈正相关。结论:ADMA可能通过NF-κB途径增强iNOS表达而促进巨噬细胞转化为泡沫细胞、促进动脉粥样硬化的发生发展。     

丙丁酚对氧化型低密度脂蛋白和氧自由基促血管平滑肌细胞增殖的影响

本文用细胞计数和ＭＴＴ快速比色计量法观察到体外培养的半主动脉平滑肌细胞分别与氧化型低密度脂蛋白和黄嘌呤－黄嘌呤氧化酶共厕培养后，前者明显增殖（Ｐ＜０．０１）。抗氧化剂丙丁酚（１００μｍｏｌ·Ｌ－１）能抑制氧化型低密度脂蛋白和黄嘌呤－黄嘌呤氧化酶促平滑肌细胞增殖作用；一氧化氮合成酶抑制剂ＮＧ－硝基－Ｌ－精氨酸对两者促平滑肌细胞增殖的作用无影响，同时也不能阻断丙丁酚的抑制两者促细胞增殖作用．这一结果提示，丙丁酚能抑制氧化型低密度脂蛋白和外源性氧自由基促平滑肌细胞增殖，这一作用可能与血管平滑肌细胞中一氧化氮的合成及释放无关。     

一氧化氮/环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶对血管平滑肌细胞三磷酸肌醇受体Ⅰ型表达及细胞内游离钙的调节

目的证明一氧化氮，环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶对血管平滑肌细胞三磷酸肌醇受体Ⅰ型的表达以及细胞内游离钙水平的调节。方法比色法测定血管平滑肌细胞增殖，激光共聚焦显微镜测定细胞内游离钙离子浓度，逆转录聚合酶链反应以及免疫印迹法测定三磷酸肌醇受体Ⅰ型的表达水平。结果一氧化氮供体S-亚硝基-N-乙酰青霉胺和环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶选择性环磷酸鸟苷类似物Sp8-pCPT-cGMP抑制血管平滑肌细胞增殖，但环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶拮抗剂Rp-8-pCPT-cGMP促进血管平滑肌细胞增殖。且S-亚硝基-N-乙酰青霉胺和Sp-8-pCPT-cGMPS可以进一步抑制经维拉帕米预处理后的血管平滑肌细胞增殖。维拉帕米抑制苯肾上腺素刺激的细胞内游离钙离子浓度升高，这一抑制作用能够被S-亚硝基-N-乙酰青霉胺和Sp-8-pCPT-cGMP进一步加强，但可被Rp-8-pCPT-cGMP减轻。三磷酸肌醇受体Ⅰ型mRNA转录与蛋白质表达被S-亚硝基-N-乙酰青霉胺和Sp-8-pCPT-cGMP降低，但被Rp-8-pCPT-cGMP增加。结论一氧化氮，环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶在转录水平和翻译水平抑制血管平滑肌细胞三磷酸肌醇受体Ⅰ型的表达，进而参与对细胞内游离钙离子浓度的调节。     

胰岛素对牛主动脉内皮细胞一氧化氮合酶(NOS)活性及诱生型NOS mRNA表达的影响

目的　观察胰岛素对牛主动脉内皮细胞一氧化氮合酶 (NOS)活性及诱生型NOS(iNOS)基因表达的影响。方法　原代培养牛降主动脉内皮细胞 ,在不同浓度胰岛素条件下孵育 2 4h ,用比色法检测NOS活性 ,用半定量RT PCR检测内皮细胞iNOSmRNA表达。结果　药理浓度胰岛素 (10 -7mol/L)比生理浓度胰岛素 (10 -10 mol/L)条件下NOS活性及iNOSmRNA表达均显著增高 (均P <0 .0 5 )。结论　高胰岛素浓度状态下大血管病变可能与内皮细胞iNOS过度表达及合成一氧化氮功能异常有关。     

丙丁酚对氧化型低密度脂蛋白和氧自由基促血管平滑肌细胞增殖的影响

本文用细胞计数和MTT快速比色计量法观察到体外培养的半主动脉平滑肌细胞分别与氧化型低密度脂蛋白和黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶共厕培养后,前者明显增殖(p<0.01)。抗氧化剂丙丁酚(100μmol·L-1)能抑制氧化型低密度脂蛋白和黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶促平滑肌细胞增殖作用;一氧化氮合成酶抑制剂NG-硝基-L-精氨酸对两者促平滑肌细胞增殖的作用无影响,同时也不能阻断丙丁酚的抑制两者促细胞增殖作用.这一结果提示,丙丁酚能抑制氧化型低密度脂蛋白和外源性氧自由基促平滑肌细胞增殖,这一作用可能与血管平滑肌细胞中一氧化氮的合成及释放无关。     

致动脉粥样硬化不同因素对大鼠腹腔巨噬细胞和主动脉平滑肌细胞分泌表达Tenascin-C的影响

目的　观察一些致动脉粥样硬化因素对培养的大鼠腹腔巨噬细胞和主动脉平滑肌细胞分泌表达Tenascin C的影响。方法　体外分离培养大鼠腹腔巨噬细胞和主动脉平滑肌细胞 ,同步后分别加入不同刺激因子采用Westernbolt及逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)的方法检测Tenascin C蛋白和mRNA水平表达。结果　Tenascin C在两种细胞的对照组中均不表达 ,低密度脂蛋白刺激组只有少量表达 ,其余各刺激组均呈高水平表达。加入氧化修饰低密度脂蛋白 (oxLDL) 2h后即有Tenascin C的表达 ,6h时达高峰 ,可持续到 2 4h。oxLDL与Tenascin C蛋白的表达呈明显的浓度依赖性。结论　oxLDL等致动脉粥样硬化刺激因子可在转录水平上调Tenascin C基因的表达 ,从而促进血管平滑肌细胞和巨噬细胞分泌表达高水平的Tenascin C ,这可能是动脉粥样硬化中Tenascin C沉积的主要原因     

氧化型低密度脂蛋白对大鼠血管平滑肌细胞表达基质细胞衍生因子1α的影响

目的为探讨氧化型低密度脂蛋白对大鼠血管平滑肌细胞上基质细胞衍生因子1α表达的影响。方法原代培养的大鼠血管平滑肌细胞,与氧化型低密度脂蛋白共同孵育,用逆转录聚合酶链反应检测基质细胞衍生因子1αmRNA,免疫印迹检测其蛋白表达变化,观察氧化型低密度脂蛋白对大鼠血管平滑肌细胞表达基质细胞衍生因子1α的剂量—时间效应。结果原代培养的大鼠血管平滑肌细胞有基础水平的基质细胞衍生因子1α表达,且在0～50mg/L范围内,基质细胞衍生因子1α表达量随氧化型低密度脂蛋白浓度增加而增加,50mg/L可使基质细胞衍生因子1α上调约5倍;经50mg/L氧化型低密度脂蛋白刺激0～48h,其峰值在12h,随后逐渐下降,但仍维持在基础水平的3倍左右。结论氧化型低密度脂蛋白上调大鼠血管平滑肌细胞的基质细胞衍生因子1α的表达。     

r-干扰素对血管平滑肌细胞一氧化氮合酶mRNA表达的影响

探讨r-干扰素 (INF -r)对培养血管平滑肌细胞 (SMC)诱生型一氧化氮合酶 (iNOS)mRNA表达的影响。 0 5%血清培养 4 8h后的大鼠主动脉SMC ,加入 150 μ/ml的INF -r入培养基中 ,于 0、1、3、6和 12h获取细胞标本 ,提取总RNA ,采用Northern杂交检测iNOSmRNA在SMC中的表达水平。结果经INF -r刺激后 ,SMC中iNOSmRNA的表达水平明显增高 ,3h达高峰为对照水平的 8倍 ,12h后渐降。INF -r可刺激血管SMCiNOSmRNA表达水平上调 ,其作用可能与感染性休克的发生及SMC增殖受抑制等有关     

血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1介导氧化型低密度脂蛋白促进血管平滑肌细胞表达白细胞介素6

观察氧化型低密度脂蛋白对血管平滑肌细胞白细胞介素 6表达的影响及血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体 1在其中的作用。人脐带动脉平滑肌细胞体外原代培养 ,传至 4～ 5代。氧化型低密度脂蛋白干预 ,观察不同时间点白细胞介素 6mRNA表达 ,及不同浓度氧化型低密度脂蛋白对白细胞介素 6和血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体 1mRNA表达的影响。并观察血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体 1抑制剂多聚肌酐酸对白细胞介素 6mRNA表达的影响。结果发现 ,(1)氧化型低密度脂蛋白作用后 ,白细胞介素 6mRNA表达显著升高 ,作用 6h出现峰值。随着氧化型低密度脂蛋白浓度升高 ,白细胞介素 6mRNA和血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体 1mRNA表达均明显升高 ,后两者呈正相关 (r=0 .94 3,P <0 .0 1)。 (2 )多聚肌酐酸抑制血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体 1后 ,白细胞介素 6mRNA表达明显下降。以上表明氧化型低密度脂蛋白明显促进血管平滑肌细胞白细胞介素 6的表达 ,血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体 1在此过程中起重要介导作用。     

Genistein对内皮细胞内皮型一氧化氮合酶和核因子κB表达的影响

目的探讨植物雌激素Genistein对氧化型低密度脂蛋白干预的内皮细胞内皮型一氧化氮合酶和核因子κB表达的影响。方法体外培养人脐静脉内皮细胞,在氧化型低密度脂蛋白(100mg/L)干预内皮细胞的基础上,不同浓度的Genistein(10、50和100nmol/L)孵育,MTT法观察Genistein对细胞活力的影响,实时定量逆转录聚合酶链反应检测内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达,Western blotting检测内皮型一氧化氮合酶和核因子κB蛋白的表达。结果与空白对照组相比,氧化型低密度脂蛋白(100mg/L)明显抑制细胞活力,下调内皮型一氧化氮合酶mRNA和蛋白表达,上调核因子κB蛋白表达(P0.05);Genistein明显增高细胞活力,上调内皮型一氧化氮合酶mRNA和蛋白表达,抑制核因子κB蛋白表达(P0.05),且呈浓度依赖性(P0.05)。结论 Genistein能够促进内皮型一氧化氮合酶的表达,抑制核因子κB的表达。     

内皮型一氧化氮合酶基因体内转染对大鼠颈总动脉损伤后血管狭窄程度的影响

目的 将内皮型一氧化氮合酶基因转染至球囊损伤后的大鼠颈总动脉中，观察其对血管狭窄程度的影响。方法 将大鼠分为正常对照组、空白对照组、pcDNA3．1（-）组和内皮型一氧化氮合酶组。除正常对照组外均行颈总动脉内膜球囊损伤术，术中采用脂质体栽体FuGENE6分别介导真核表达栽体pcDNA3．1-内皮型一氧化氮合酶和pcDNA3，1（-）转染至损伤后的内皮型一氧化氮合酶组和pcDNA3．1（-）组大鼠血管中。于术后2用处死大鼠，以逆转录-聚合酶链反应法检测转染后体外培养的血管平滑肌细胞中内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达。并于术后1月和2月处死大鼠，检测颈总动脉血管狭窄的程度。结果 2周后转染pcDNA3．1-内皮型一氧化氮合酶基因的血管平滑肌细胞中可以检测出内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达，1月和2月后转染pcDNA3．1-内皮型一氧化氮合酶基因的颈总动脉狭窄程度明显小于空白对照组和pcDNA3．1（-）组（P〈0．01）。结论 内皮型一氧化氮合酶基因体内转染可以在血管平滑肌细胞中成功表达，且可以明显改善球囊损伤后颈总动脉狭窄的程度。     

HGF 介导 Ox-LDL 诱导的血管平滑肌细胞钙化

目的研究肝细胞生成因子（hepatocyte growth factor,HGF）在氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,Ox-LDL）诱导的血管平滑肌细胞钙化中的作用。方法本研究采用细胞钙化体外模型,检测HGF的浓度和细胞钙化程度。结果Ox-LDL能促进血管平滑肌细胞钙化,同时上调HGF的表达水平。抑制HGF能减轻Ox-LDL诱导的细胞钙化。结论HGF参与了Ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞钙化。     

内皮型一氧化氮合成酶活性调节的研究进展

一氧化氮合成酶（NOS）目前已克隆提纯了三种亚型：神经型一氧化氮合成酶（nNOS）、诱生型一氧化氮合成酶（iNOS）、内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）。其中eNOS在NO的生成中具有重要的作用,它不仅表达在血管内皮细胞,心肌细胞、血小板、平滑肌细胞、骨骼细胞和神经元细胞上也有表达,深入开展eNOS的研究,有助于进一步探索心血管治疗的新方法。eNOS的调节包括转录水平及翻译后水平的调节。     

毒死蜱下调内皮型一氧化氮合酶的表达降低了脑基底动脉内皮依赖性舒张功能

目的探讨毒死蜱对血管舒张功能的影响及其可能的机制。方法采用离体血管环灌流方法,观察不同浓度的毒死蜱预处理对新西兰兔脑基底动脉环对乙酰胆碱和硝普钠介导的舒张反应以及血管组织中一氧化氮含量的影响。同时,观察不同浓度的毒死蜱预处理对培养的人脐静脉内皮细胞培养液中一氧化氮含量和内皮型一氧化氮合酶表达的影响。结果毒死蜱(0.001~0.1 mmol/L)预处理30 min,浓度依赖性地抑制乙酰胆碱诱导的内皮依赖性舒张反应和降低了血管组中一氧化氮的含量,而对硝普钠引起的非内皮依赖性舒张反应没有影响。阿托品预处理则不影响毒死蜱的作用。毒死蜱(0.001~0.1 mmol/L)预处理30 min,浓度依赖性降低了培养液中一氧化氮的含量和内皮型一氧化氮合酶的表达。结论毒死蜱能降低血管内皮依赖性舒张反应,其机制可能与毒死蜱下调内皮型一氧化氮合酶的表达,减少一氧化氮的生成,损伤内皮细胞的功能有关。