腺病毒介导的鸟氨酸脱羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶双反义RNA抑制肺癌A-549细胞的实验研究

目的：探讨鸟氨酸脱羧酶（ODC）和S－腺苷甲硫氨酸脱羧酶（AdoMetDC）双反义重组腺病毒（Ad-ODC-AdoMetDCas）介导的ODC和AdoMetDC反义RNA对肺癌A 549细胞增殖和侵袭的抑制作用。方法：采用FACS检测Ad-GFP感染细胞中GFP表达，以测定不同MOI的腺病毒对肺癌A-549细胞的基因转染效率；应用MTT法观察Ad-ODC-AdoMetDCas对肺癌A-549细胞生长增殖的影响；采用Western印迹和HPLC的方法分别检测腺病毒对肺癌A-549细胞中ODC和AdoMetDC蛋白表达以及胞内多胺含量的抑制作用,并应用TUNEL标记检测法观察Ad-ODC-AdoMetDCas对肺癌细胞凋亡的影响。结果：基因转染效率结果显示，以50 MOI的Ad-GFP感染肺癌细胞48h后，大约有75% 肺癌A-549细胞GFP表达阳性；Ad-ODC-AdoMetDCas对肺癌A-549细胞生长增殖有明显抑制作用。Ad-ODC-AdoMetDCas可明显抑制肺癌细胞中ODC和AdoMetDC基因表达 ，基因抑制率大于60％（P＜0.05）。HPLC结果显示，肺癌A-549细胞感染Ad-ODC-AdoMetDCas后，细胞内三种多胺含量都明显降低（P＜0.05）。TUNEL标记检测结果证实，Ad-ODC-AdoMetDCas可引起肺癌A-549细胞明显凋亡。结论：ODC和AdoMetDC双反义腺病毒具有显著抑制肺癌增殖和侵袭的作用，对于肺癌的防治研究具有一定的意义，有望成为治疗肺癌的基因药物。     

前列腺非雄激素依赖启动子介导的双反义腺病毒的制备及组织特异性检测

目的  制备前列腺非雄激素依赖启动子（PSES）介导的鸟氨酸脱羧酶(ODC)和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(AdoMetDC)双反义腺病毒。方法  构建pShuttle-Basic-PSES AdoMetDC-ODC-PolyA穿梭载体,并与载体pAdPL进行体外重组,包装成重组腺病毒。将重组腺病毒转染至前列腺癌、直肠癌等癌细胞中,噻唑兰比色（MTT）法观察其对细胞增殖的影响,Western Blot检测重组腺病毒对细胞中ODC和AdoMetDC表达的抑制作用。结果  成功构建了前列腺特异的ODC和AdoMetDC双反义RNA表达载体,并包装制备出能特异的在前列腺细胞中表达产生ODC和AdoMetDC反义RNA的重组腺病毒。该重组腺病毒具有前列腺组织特异性。结论  构建的前列腺非雄激素依赖启动子介导的ODC、AdoMetDC双反义腺病毒具有组织特异性。     

stathmin基因反义寡核苷酸对Eca109细胞系生长的抑制作用

目的:研究stathmin基因反义寡核苷酸(ASODN)对Eca109细胞增殖及stathmin基因表达的抑制作用,探讨ASODN用于食管癌基因治疗的可行性.方法:实验设ASODN转染组、SODN转染组和未转染组.分别应用stathmin ASODN、SODN转染食管癌Eca109细胞.倒置显微镜观察转染细胞的形态变化,绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞增殖能力,RT-PCR方法检测stathmin基因的表达,采用流式细胞仪分析细胞增殖周期.结果:stathmin ASODN转染Eca109细胞后,胞体凝缩,增殖能力减弱,细胞生长及目的基因表达明显受抑(P<0.05),其抑制作用具有序列特异性.细胞分裂阻滞在分裂期的中期,G2/M期细胞数由(12.2±1.0)%升至(36.5±5.8)%.结论:stathmin基因反义寡核苷酸对Eca109细胞增殖及stathmin基因表达具有明显抑制作用,有望成为食管癌基因治疗药物.     

褪黑素联合顺铂对人食管癌Eca109细胞的抑制作用及其机制

目的:观察褪黑素(Mel)联合顺铂(DDP)对人食管癌Eca109细胞生长的抑制作用,并探讨相关的分子机制。方法:通过MTT实验检测Mel与DDP不同浓度分别单用或两药联合处理后食管癌Eca109细胞增殖情况;流式细胞仪检测用药后细胞凋亡情况;Western blot法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果:Mel与DDP联用对食管癌Eca109细胞增殖的抑制率均高于单用Mel与DDP时对食管癌Eca109细胞的抑制率(P<0.05);Mel单独诱导食管癌Eca109细胞凋亡作用不强,但可增强DDP诱导的食管癌细胞凋亡(P<0.01);Mel与DDP联用后食管癌Eca109细胞Bcl-2蛋白表达减弱,Bax蛋白表达增强。结论:Mel可增强DDP对人食管癌Eca109细胞增殖的抑制作用,并具有增强DDP诱导人食管癌Eca109细胞凋亡的作用,其机制可能与上调Bax表达和下调Bcl-2的表达有关。     

老年人肺癌组织中鸟氨酸脱羧酶基因表达及其临床意义

目的：从mRNA和蛋白质水平探讨ODC基因表达和老年人肺癌的关系，为肺癌基因诊断和基因治疗的研究提供理论依据。方法：分别应用RT PCR和免疫组化方法检测42例老年人肺癌组织和癌旁正常肺组织中ODC mRNA和ODC蛋白的表达，应用Western Blot检测肺癌组织中ODC表达，同时用MTT法观察不同转染组肿瘤细胞的增殖状况，探讨上述指标与肺癌临床病理学特性的关系。结果：RT PCR显示，老年人肺癌组织中ODC mRNA表达明显高于癌旁正常肺组织（P＜0.05），不同类型和分化程度肺癌组织中ODC mRNA水平差异无统计学意义（P＞0.05），Ⅲ期肺癌组织中ODC mRNA表达明显高于Ⅰ期+Ⅱ期（P＜0.05）；免疫组化显示，肺癌组织中ODC蛋白表达明显高于癌旁正常肺组织(P＜0.05);不同病理类型和分化程度肺癌组织中ODC蛋白表达未见明显差异（P＞0.05），Ⅲ期肺癌组织中ODC蛋白表达较Ⅰ期+Ⅱ期明显升高（P＜0.05）；Western Blot显示，肺癌组织中ODC蛋白表达明显高于癌旁正常肺组织；MTT法观察生长曲线检测数据表明，ODC的反义RNA表达载体转染组细胞的增殖明显比对照组细胞和空载体转染组细胞缓慢。结论：ODC表达增强与老年人肺癌发生、发展、浸润及转移有关，可作为判断肺癌生物学行为的参考指标; ODC的反义RNA表达载体对A 549肺癌细胞株的生长具有一定的抑制作用。     

冰片与顺铂联用对Eca109/DDP细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响

目的：探讨冰片与顺铂(cisplatin,DDP)联用对耐DDP的食管癌细胞Eca109(DDPr)增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法：采用递增药物质量浓度持续作用诱导法建立耐DDP的食管癌细胞Eca109(DDPr)。冰片联合DDP作用于Eca109(DDPr)细胞,MTT法检测Eca109(DDPr)细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡。结果：递增药物质量浓度持续作用诱导6个月后,细胞可以在含1μg/ml DDP的培养液中正常生长,其对DDP的耐药指数为15.886,所得细胞命名为耐DDP的食管癌细胞Eca109(DDPr)。单用冰片浓度≤1.560μg/ml时,对Eca109(DDPr)细胞无明显抑制作用(P＞0.05),但与DDP1μg/ml合用能显著促进DDP抑制Eca109(DDPr)细胞的增殖（P＜0.05）,并促进DDP诱导Eca109(DDPr)细胞周期改变、细胞凋亡增加。细胞周期表现为G1期细胞明显增多（P＜0.05）,S期细胞、G2期细胞明显减少（P＜0.05）;细胞的凋亡率明显增加（P＜0.05）。结论：冰片促进DDP抑制Eca109(DDPr)细胞增殖可能与改变Eca109(DDPr)细胞周期、增加细胞凋亡有关。     

哌立福新对裸鼠皮下移植瘤的抑制作用

目的:探讨哌立福新对裸鼠皮下瘤生长的抑制作用。方法:建立荷人食管癌Eca109细胞的裸鼠皮下瘤模型,分别观察对照组及经哌立福新、顺铂和哌立福新联合顺铂治疗后荷瘤裸鼠的肿瘤生长情况,应用TUNEL法观察肿瘤组织中细胞凋亡情况,Western-Blot法观察肿瘤组织中Akt、m TOR蛋白表达。结果:哌立福新和顺铂单独使用均使肿瘤生长速度减慢(P<0.05),二者联合对肿瘤生长抑制效果更明显(P<0.01)。TUNEL法检测发现哌立福新在体内能引起Eca109细胞凋亡(P<0.05),Western-Blot法结果表明哌立福新在体内通过抑制Akt/m TOR信号通路的活性,促进细胞凋亡,从而抑制人食管癌Eca109细胞的生长。结论:哌立福新联合顺铂可抑制裸鼠皮下食管癌移植瘤的生长,其机制可能是通过Akt/m TOR信号通路发挥作用。     

褪黑素联合顺铂对人食管癌Eca109细胞株的增殖抑制作用研究

目的：观察褪黑素（Mel）联合顺铂（DDP）对人食管癌Eca109细胞增殖和凋亡的影响.方法：以DDP 2.5 mg/L、不同浓度Mel及两药联合作用于食管癌Eca109细胞.通过MTT实验检测用药后对食管癌Eca109细胞增殖的影响,并计算抑制率;通过集落克隆形成实验观察用药后对细胞集落克隆形成的影响;通过流式细胞仪检测用药后细胞凋亡率的变化.结果：DDP 2.5 mg/L与不同浓度Mel联合用药组对食管癌Eca109细胞生长抑制率均明显高于单独使用DDP或Mel组（P＜0.01）;10-5 mol/L Mel诱导人食管癌Eca109细胞的24 h凋亡率为7.8%,10-5 mol/L Mel与2.5 mg/L DDP联合刺激人食管癌Eca109细胞的24 h凋亡率为32.0%,高于DDP本身诱导的24 h凋亡率9.7%（P＜0.01）.结论：Mel可增强DDP对人食管癌Eca109细胞增殖的抑制作用,并增强其诱导凋亡作用,为临床食管癌的治疗提供了一定的实验研究基础.     

DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2＇-脱氧胞苷对人食管癌细胞株Eca109的影响

目的：探讨DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2＇-脱氧胞苷（5-aza-CdR）对人食管癌细胞株Eca109增殖作用的影响.方法：应用不同浓度（10^-7、10^-6、10^-5、10^-4 mol/L）的特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-CdR,于不同作用时间（24～168 h） 处理人食管鳞癌细胞株Eca109,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定5-aza-CdR作用下Eca109细胞株的生存率,倒置显微镜观察细胞的形态学变化.结果：不同药物浓度组在同一作用时间下,细胞株生存率差异有统计学意义（P＜0.05）;同一药物浓度不同作用时间组之间（24～96 h）的细胞生存率差异也有统计学意义（P＜0.05）,且96 h时对人食管鳞癌细胞株Eca109生长抑制作用最明显.形态学观察显示：癌细胞体积缩小,核固缩,染色质凝聚成块.结论：5-aza-CdR有抑制人食管癌细胞株Eca109生长的作用,抑制作用呈时间依赖性及浓度依赖性;并且干预后癌细胞呈现典型的凋亡细胞形态改变.     

紫杉醇对人食管癌Eca109细胞株生长的影响

目的：观察不同浓度的紫杉醇对食管癌细胞Eca109的影响。方法：应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）实验,细胞形态学观察及流式细胞仪等方法对人食管癌细胞Eca109进行检测和观察。结果：MTT实验显示紫杉醇可抑制食管癌细胞增殖;光镜及电镜可发现药物作用组细胞核固缩、解聚以及凋亡小体,流式细胞仪检测显示G1峰前有明显的凋亡峰。细胞周期分析提示紫杉醇可将Eca细胞阻滞于G2－M期,且与浓度相关。结论：紫杉醇对人食管癌细胞系Eca109细胞的生长有明显的抑制作用,使细胞分裂阻滞于G2－M期,并诱导肿瘤细胞凋亡。     

白藜芦醇抑制食管癌Eca109细胞增殖的初步研究

目的观察白藜芦醇对人食管癌Eca109细胞增殖影响及凋亡诱导作用。方法噻唑蓝法测定细胞生长抑制率,倒置显微镜、透射电镜和HE染色法观察细胞的形态变化,流式细胞术用于检测白藜芦醇培养Eca109细胞前后的细胞凋亡情况。结果白藜芦醇对Eca109细胞生长有抑制作用,抑制率达76.42%,并呈剂量、时间效应关系。倒置显微镜下可见细胞生长明显被抑制,胞浆内颗粒增多增粗,部分细胞变圆悬浮在培养基中;HE染色和透射电镜观察发现白藜芦醇能诱导Eca109细胞呈现典型的细胞凋亡特征,如细胞体积变小,染色质浓缩等。流式细胞术检测结果显示,40 mg/L白藜芦醇培养Eca109细胞72 h后细胞凋亡率达19.52%,在DNA直方图上有明显的亚二倍体凋亡峰。结论白藜芦醇能明显抑制Eca109细胞增殖,并进一步诱导食管癌细胞凋亡。     

食管癌Eca109细胞中Nucleostemin基因表达的实验研究

目的：研究Nucleostemin（NS）基因在食管癌Eca109细胞中的表达及凋亡作用。方法：提取各组食管癌细胞总RNA,用半定量RT-PCR方法检测NS基因的表达情况;用CCK-8法检测3组细胞增殖抑制率;TUNEL试剂盒法检测细胞凋亡情况。结果：与对照组比较,实验组细胞NS基因表达量下降,细胞增殖抑制率〉65%,细胞凋亡增加（凋亡指数为39.47%）差别具有统计学意义。结论：NS基因特异性RNA干扰使食管癌Eca109细胞中NS基因表达量下降,出现细胞增殖抑制,细胞凋亡增加。     

2-(3-羧基-1-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖对人食管癌细胞的抗增殖研究

目的探讨2-(3-羧基-1-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖(COPADG)对人食管癌细胞Eca-109和TE-1的增殖及其细胞周期的影响.方法采用体外细胞培养,通过MTT比色分析法观察不同浓度COPADG对Eca-109及TE-1细胞生长的抑制作用;流式细胞仪检测药物对细胞周期的影响;透射电镜下观察细胞的形态学变化.结果COPADG能有效的抑制人食管癌细胞Eca-109及TE-1的增殖,且存在时间及剂量依赖性(P＜0.01);不同浓度的COPADG作用48 h之后,流式细胞仪检测均显示G0/G1期细胞比例增加(P＜0.01),而S期细胞比例减少(P＜0.01),在Eca-109细胞中出现了典型的凋亡峰;电镜下可观察到凋亡的典型形态学变化.结论COPADG能有效抑制人食管癌细胞Eca-109及TE-1的增殖,改变其细胞周期分布,导致明显的G0/G1期阻滞,并在一定浓度下诱导肿瘤细胞凋亡.     

硒酸酯多糖对人食管鳞癌Eca109细胞增殖及凋亡的影响

目的研究硒酸酯多糖(KSC)对人食管鳞癌Eca109细胞增殖及凋亡的影响,并初步探讨其作用机制。方法甲基噻唑基四唑(MTT)法检测不同浓度KSC对Eca109细胞增殖的影响;流式细胞术观察KSC对Eca109细胞凋亡的影响;Westernblot技术检测KSC对Eca109细胞核转录因子-κB(NF-κB)蛋白表达水平的影响。结果 KSC可明显抑制Eca109的增殖(P<0.05),并呈时间及浓度依赖性;经KSC作用后,Eca109细胞的凋亡率随KSC作用时间的延长(24、48、72h)及KSC浓度的增加(30、60、120μg/mL)而明显升高(P<0.01);KSC(60、120μg/mL)显著下调Eca109细胞核中NF-κB蛋白水平(P<0.01)。结论 KSC对Eca109细胞具有抑制增殖、诱导凋亡作用,其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路有关。     

丁酸钠对食管癌Eca-109细胞增殖和凋亡的作用

目的: 观察丁酸钠对食管癌Eca-109细胞增殖和凋亡的作用。方法: 以1、2.5、5mmol/L丁酸钠处理Eca-109细胞,倒置显微镜观察细胞形态变化,透射电镜观察细胞凋亡的形态,四甲基噻唑氮蓝法检测抑制细胞增殖率,TUNEL法检测细胞凋亡率。结果: Eca-109细胞经丁酸钠处理后:光镜下观察细胞变小、变圆,部分从培养瓶壁上脱落下来;电镜下细胞核体积缩小,染色质浓缩聚集于核膜处;细胞增殖受到明显抑制,1、2.5、5mmol/L丁酸钠处理24h、48h和72h后,细胞生长抑制率分别是13.38%、34.15%、39.02%,14.04%、33.33%、46.49%和31.11%、40.74%、48.15%,与低浓度组比较差异有统计学意义(P<0.05~P<0.01);2.5mmon/L丁酸钠处理24h组与阴性对照组细胞凋亡率分别是5.5%和1.6%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论: 丁酸钠可抑制食管癌Eca-109细胞增殖、促进凋亡,且呈浓度和时间依赖性。     

肿瘤特异性Caspase-8表达载体对食管癌细胞Eca109体外增殖和凋亡作用的研究

目的研究肿瘤特异性Caspase-8表达载体对食管癌细胞Eca109体外增殖和凋亡作用。方法用脂质体法将人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子调控的肿瘤特异性表达载体hTERT-Caspase-8,瞬时转染端粒酶阳性的食管癌细胞株Eca109及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5。结果转染hTERT-Caspase-8对细胞Eca109的生长具有显著抑制作用,细胞凋亡水平显著升高;转染hTERT-Caspase-8对MRC-5的生长和凋亡均无明显影响。结论上述发现提示hTERT启动子可以调控Caspase-8基因在食管癌细胞中靶向性表达,选择性抑制肿瘤细胞生长,促进肿瘤细胞凋亡,可能是肿瘤靶向性基因治疗中比较理想的转录调控元件。     

8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞周期及凋亡的影响

目的观察8-Br-cAMP和槲皮素(quercetin)对Eca-109细胞周期及凋亡的影响.方法将贴壁培养的Eca-109细胞随机分成3组,Br组加8-Br-cAMP至终浓度为2×105 mol/L;Q组加槲皮素至终浓度为43 μmol/L;C组不加任何药物,只加入新培养液培养.3组在同等条件下继续培养48 h.采用流式细胞仪检测细胞的周期,采用TUNEL法检测细胞凋亡百分率,采用DNA琼脂糖凝胶电泳法观察细胞DNA降解情况.结果2实验组细胞中G2-M期细胞比例较对照组显著上升(P<0.01).细胞凋亡百分率2实验组显著高于对照组(P<0.01);Br组和Q组相比,差异无统计学意义(P>0.05).DNA琼脂糖凝胶电泳中Br组和Q组皆呈DNA"梯样型"带,对照组未呈现DNA降解.结论8-Br-cAMP和槲皮素皆可阻滞Eca-109细胞于G2-M期,并进一步诱导Eca-109细胞凋亡.     

抗阿霉素人食管癌Eca-109细胞生物学特性研究

目的： 建立并研究抗阿霉素人食管癌细胞株（Ｅｃａ １０９／Ａｄｒ） 的生物学特性。方法： 采用递加培养液中药物浓度建立Ｅｃａ １０９／Ａｄｒ 细胞株,测试该细胞株对多种抗肿瘤药物的敏感性,采用光镜及扫描电镜观察其形态变化,采用聚合酶链反应（ＰＣＲ） 分析法检测ｍｄｒ １ 表达,采用荧光分光光度法检测细胞内ＧＳＨ 水平。结果： 建立了低程度的抗阿霉素Ｅｃａ １０９／Ａｄｒ 细胞株,该细胞株细胞大小不均匀,边界不如Ｅｃａ １０９ 细胞整齐,有明显皱褶,未见微毛,集落形成率明显下降,对长春新碱、放线菌素Ｄ、三尖杉酯碱、丝裂霉素Ｃ、鬼臼乙叉甙及顺铂呈不同抗性,对氟尿嘧啶仍敏感,ｍｄｒ １ 基因呈低表达,细胞内ＧＳＨ 水平升高,结论：Ｅｃａ １０９／Ａｄｒ 细胞为多药抗药性细胞株。     

三羟基异黄酮诱导食管癌EC-109细胞凋亡的研究

目的探讨三羟基异黄酮诱导食管癌EC-109细胞发生凋亡的可能性,揭示该凋亡发生与bcl-2和bax之间的关系。方法采用MTT比色法测定三羟基异黄酮对EC-109细胞的生长抑制率;以透射电镜和TUNEL染色法研究三羟基异黄酮与EC-109细胞凋亡的关系;通过免疫组织化学法和RT-PCR法检测bcl-2和bax的表达。结果三羟基异黄酮对EC-109细胞有明显抑制作用,随浓度增加和培养时间的延长而增强;三羟基异黄酮诱导EC-109细胞出现凋亡细胞形态;TUNEL染色法可见,经三羟基异黄酮处理24、48、72、96h后,EC-109细胞凋亡数随时间明显增加。免疫组织化学发现经处理24、48、72、96h后,EC-109细胞的bcl-2蛋白阳性率减少,bax蛋白阳性率增加。RT-PCR也发现经处理24、48、72、96h后,EC-109细胞的bcl-2mRNA条带密度降低,bax mRNA条带密度加强。结论三羟基异黄酮可能通过下调bcl-2的表达和上调bax的表达而诱导食管癌EC-109细胞发生凋亡。