临床标本中粘质沙雷氏菌的鉴定及药敏分析

粘质沙雷氏菌广泛分布于自然界,近年来渐成为临床上常见的条件致病菌。本文报道了46株从临床标本中分离得到的粘质沙雷氏菌的生化特性。本菌属于肠杆菌科,IMViC试验42株为--++模式(91.3%),4株为-+++模式(8.7%)。主要生化试验氧化酶阴性,葡萄糖发酵,硝酸盐还原阳性,葡萄酸盐阳性,苯丙氨酸阴性,动力阳性,山梨醇阳性,DNA酶阳性。与同属中其他种的主要区别是阿拉伯糖、棉子糖、木糖均为阴性。对46株粘质沙雷氏菌进行14种抗生素的药物敏感试验,结果表明粘质沙雷氏菌对多种抗生素均表现出较高的耐药率。     

兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶的功能性表达、纯化及活性鉴定

目的:用原核蛋白表达系统对兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR)进行功能性表达,并对其活性进行鉴定。方法:从兔肝中克隆出NRDR全长序列,运用Gateway表达系统将其编码区序列构建到表达载体(pDEST 17)上,再转化到大肠杆菌(E.coli)(BL21-AI)中表达出兔NRDR蛋白并鉴定其表达形式;取工程菌裂解上清通过金属离子亲和层析纯化出目的蛋白,再运用反相高效液相色谱法(HPLC)测定该酶的Km值和Vmax值。结果:构建出含兔NRDR编码区(768 bp)的表达克隆,转化到BL21-AI中表达出氨基端含6×His标签的重组兔NRDR蛋白,诱导表达4 h后目的蛋白可占总蛋白量的41.4%;经一步亲和层析得到的兔NRDR纯度为97.2%,比活性提高了64倍;经HPLC测定,该酶对视黄醛的Km值为(4.55±0.33)μmol/L,Vmax为(0.307±0.065)μmol/(min.mg)。结论:应用pDEST 17可在BL21-AI中对兔肝NRDR进行高效的功能性表达。     

人硫氧还蛋白还原酶cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：克隆人硫氧还蛋白还原酶(TR)基因并构建原核表达载体，获得TR蛋白。方法：采用反转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术，从人胚脑组织中扩增出TRcDNA片段，克隆至pGEM—T载体并转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒pGEM—TR；经序列分析证实后，提取pGEM—TR重组体，由双酶切得到目的片段，并插入pET9c原核表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组质粒pET—rhTR。异丙基硫代—β—D—半乳糖苷(IPTG)诱导pET—rhTR在BL21中表达，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及免疫蛋白印迹(Western blot)分析重组蛋白。结果：克隆的TRcDNA与人胎盘组织TRcDNA同源性为99％；pET—rhTR在大肠杆菌中高效表达，目的蛋白占菌体总蛋白量的36％，其分子质量为55ku。TRcDNA序列被GenBank收录，登录号为AF208018。结论：成功克隆了人脑组织来源的TR基因，该基因在大肠杆菌中得到高表达，为进一步研究其功能奠定基础。     

100例沙雷氏菌感染及药敏分析

目的:对2001年至2004年间本细菌室分离出的100例沙雷氏菌进行菌株、来源的统计,并对药敏进行分析。结果:沙雷氏菌感染以黏质沙雷氏菌和液化沙雷氏菌为主,对常用抗生素有较高的耐药性,对第三代头孢菌素,以及喹诺酮类较敏感,对青霉素类耐药率较高。其中,从痰标本中分离率仍是最高。沙雷菌作为院感的重要病原菌,应引起临床高度重视。控制院内感染和合理用药是控制此菌感染的可靠手段。     

沙雷氏菌医院感染特点及对常用抗菌药物的耐药性分析

目的:了解沙雷氏菌医院感染特点及对常用抗菌药物的耐药性分析,为临床抗感染治疗提供可靠依据。方法:对本院2005年1月-2007年12月临床分离的212株沙雷氏菌的感染部位及耐药性进行分析,用表型筛选及三维实验法检测ESBLs和AmPc酶。结果:沙雷氏菌感染主要以粘质沙雷氏菌和液化沙雷氏菌为主;感染部位主要来自呼吸道,其次是手术部位和泌尿系统感染;感染病房主要以ICU和呼吸科病房为主。沙雷氏菌属对舒普深和亚胺培南的耐药率最低,对氨苄西林、头孢唑林、哌拉西林的耐药率均在80%以上。产ESBLs和产AmPc酶细菌分别占11.8%和14.6%,同时产AmPc酶及ESBLs细菌占5.2%。结论:沙雷氏菌属是引起院内感染的重要菌属,以粘质沙雷氏菌最多见,呈多重耐药性,耐药性的产生与细菌产生ESBLs和AmPc酶有关,临床应根据药敏实验结果合理选用抗菌药物。     

沙眼衣原体T细胞抗原CT143原核表达、纯化及免疫活性鉴定

目的克隆沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）T细胞抗原Ct143基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性。方法采用PCR技术从ct基因组中扩增Ct143基因,并构建pGEX-6p—Ct143原核表达质粒,转化E．coli XL1-Blue．IPTG诱导重组GST-CT143融合蛋白表达,经酶切后得到无GST标签的纯蛋白免疫Balb／c鼠,ELISA及Western-blot分析CT143蛋白免疫原性及免疫反应性。结果成功构建了pGEX-6p—CT143原核表达质粒,序列测定证实重组质粒插入片段与GenBank登陆的CtD型一致,长度为843bp;GST—CT143融合蛋白在E．coli中获得稳定高效表达;纯蛋白与佐剂混匀后肌肉免疫小鼠,ELISA检测免疫小鼠的血清效价为1：12800,Westem blot结果表明该蛋白与Ct泌尿生殖道感染病人混合血清中IgG结合,具有免疫反应性。结论成功克隆表达了CtT细胞抗原CT143,该抗原经纯化后具有良好的免疫原性及免疫反应性。     

重组蛋白F3T7的亚克隆、表达、纯化及生物学活性的初步鉴定

目的:克隆编码F3T7的DNA序列,获得融合蛋白F3T7,研究其F3T7的功能.方法:采用亚克隆技术获得原核表达载体PET32a( )-F3TwM法测定F3T7的抗血管活性.结果:F3T7具有特异结合血管内皮细胞能力,并抑制其增殖和新血管生成.结论:初步表明F3T7仍具特异结合血管内皮细胞,抑制新血管生长的能力.     

人BTC蛋白表达及生物学活性鉴定

目的获得大量具有生物活性的人成熟β细胞素(BTC)蛋白。方法以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,PCR扩增BTC基因成熟蛋白编码区的全部序列,并按读框克隆入原核细胞表达载体pET32a( )中,构建重组质粒pET32a( )-hBTC。重组质粒转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导及亲和层析法纯化获得融合蛋白,运用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。以不同浓度BTC连续5 d作用于NIH3T3细胞,MTT比色法检测细胞增殖能力。结果融合蛋白以水溶性形式分泌于大肠杆菌BL-21胞浆中,其作用于NIH3T3细胞可明显促进细胞增殖。结论人成熟BTC蛋白在pET32a( )表达系统中得到高效表达,所纯化蛋白具有促进NIH3T3细胞体外增殖的作用。     

人BTC蛋白表达及生物学活性鉴定

目的 获得大量具有生物活性的人成熟β细胞素(BTC)蛋白.方法 以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,PCR扩增BTC基因成熟蛋白编码区的全部序列,并按读框克隆入原核细胞表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)-hBTC.重组质粒转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导及亲和层析法纯化获得融合蛋白,运用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.以不同浓度BTC连续5 d作用于NIH3T3细胞,MTT比色法检测细胞增殖能力.结果 融合蛋白以水溶性形式分泌于大肠杆菌BL-21胞浆中,其作用于NIH3T3细胞可明显促进细胞增殖.结论 人成熟BTC蛋白在pET32a(+)表达系统中得到高效表达,所纯化蛋白具有促进NIH3T3细胞体外增殖的作用.     

蓝氏贾第鞭毛虫甲硫氨酸硫氧化物还原酶基因的克隆、表达与纯化

目的 蓝氏贾第鞭毛虫（简称为贾第虫）甲硫氨酸硫氧化物还原酶基因（GlMSR）,进行原核表达获得其重组蛋白。方法 依据GenBank中GlMSR序列设计引物,以贾第虫中国C2 克隆株基因组DNA 为模板,通过PCR扩增编码序列,将所得片段连接至质粒pET28a以构建原核表达载体pET28a-GlMSR,将pET28a-GlMSR导入大肠杆菌E.coli JM109并挑取阳性克隆进行基因测序和鉴定。用化学方法将经测序验证的重组质粒pET28a-GlMSR转化至E.coli BL21（DE3）。经异丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside, IPTG）诱导表达后,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组蛋白表达结果。收集沉淀中的重组表达产物,镍柱亲和层析纯化带组氨酸标签的重组蛋白,并通过免疫印迹鉴定纯化结果。结果 电泳结果显示在约624 bp处出现目的DNA条带,表明成功得到GlMSR编码序列;PCR 鉴定、酶切鉴定以及基因测序结果表明成功构建重组表达载体pET28a-GlMSR,经IPTG诱导后在沉淀中获得目的蛋白,目的蛋白分子量（Mr）约为25 000,与预期分子量（Mr）22 800基本相符。经Western blot分析显示该重组蛋白含有His6标签。结论 本研究克隆、表达了蓝氏贾第虫GlMSR基因,并纯化获得重组蛋白,为进一步探索该酶的功能奠定了基础。     

肺炎链球菌溶血素的体外表达及活性鉴定

目的 体外扩增肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)的溶血素(pneumolysin,ply)基因,在大肠杆菌中高效表达,并验证其生物活性.方法 分离培养D39型肺炎链球菌并提取其基因组DNA,采用PCR技术体外扩增ply基因,体外重组将ply序列克隆到原核表达载体pET28(a)内,测序鉴定后将重组子转化到E.coli Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导大量表达融合6个组氨酸标签的Ply重组蛋白,经Ni-NTA树脂纯化后,获得的重组蛋白经SDS-PAGE鉴定后检测其溶血活性和细胞毒性.结果 克隆的ply序列与GenBank中的数据相符,并实现了Ply蛋白的可溶表达.所获重组蛋白纯度达到95%.溶血实验显示 Ply对人红细胞具有极高的溶血活性,与对照组相比较差异有统计学意义(P＜0.05),并呈剂量依赖.细胞毒实验显示Ply对脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)细胞具有明显抑制作用,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),并呈剂量与时间依赖性,IC50(24h)为1.525 μg/ml.结论 经测序鉴定ply基因正确扩增,并成功表达、纯化出具有高溶血活性和细胞毒性的Ply蛋白.     

复方丹参的体外抗氧化活性研究

目的探讨复方丹参的体外抗氧化活性。方法采用DPPH自由基、超氧阴离子、羟基自由基、鳌合亚铁离子和还原力、过氧化氢的反应体系,检测了复方丹参的体外抗氧化活性,并与维生素C进行比较。结果复方丹参和维生素C消除DPPH自由基的EC50分别是41.0μg/mL和8.2μg/mL;复方丹参消除超氧阴离子自由基的EC50是1.39 m g/mL;复方丹参和维生素C抑制羟基自由基产生的EC50分别是1.73 m g/mL和0.58 m g/mL;在实验体系中,未检测到复方丹参螯合亚铁离子的能力;复方丹参和维生素C的还原能力的EC50分别是0.42 m g/mL和0.08 m g/mL。在实验最高质量浓度100μg/mL时,复方丹参和维生素C对过氧化氢的清除率分别为36%和94%。结论复方丹参具有较强还原力,能清除DPPH和超氧阴离子自由基的作用,并抑制羟基自由基的产生。复方丹参的多方面抗氧化活性可能是在治疗心血管疾病效果显著的原因之一。     

妇科活血止痛颗粒的体外抑菌作用

目的:考察妇科活血止痛颗粒的体外抑菌作用.方法:采用双倍稀释法,以妇乐颗粒为对照药,测定妇科活血止痛颗粒对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、乙型溶血性链球菌、白色念珠菌的体外最低抑菌浓度(MIC).结果:妇科活血止痛颗粒对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、乙型溶血性链球菌、白色念珠菌的体外抑菌作用较强,对铜绿假单胞菌的体外抑菌作用稍弱.结论:妇科活血止痛颗粒对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、乙型溶血性链球菌、白色念珠菌均具有良好的体外抑菌作用,且效果优于妇乐颗粒.     

In vitro and in vivo antibacterial activity of Pogostone

Background Our pervious antibacterial studies on several traditional Chinese medicines have found that Patchouli oil from Pogostemon cablin had significant antibacterial activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA）,which has spread worldwide and infected innumerable people.In order to find the more active natural substances in Patchouli oil,one of the major components,Pogostone,was isolated and its antibacterial activity was evaluated in vitro and in vivo in this study.Methods In vitro test,Pogostone was screened for antimicrobial properties against 83 bacteria comprising 35 gram positive and 48 gram negative bacteria strains via the agar double dilution method.In vivo test,specific pathogen free （SPF） strain of both male and female white Kunming mice,weighing 18-22 g,were used to test the protective ability of Pogostone after being injected with the median lethal doses （MLDs） of the tested strains.Results In vitro test,Pogostone could inhibit both gram negative bacteria （0.098-1 600 μg/ml） and gram positive bacteria（0.098-800 μg/ml）.For Corynebacterium xerosis and some Chryseobacterium indologenes,the minimum inhibitory concentration （MIC） values of Pogostone were extremely low （＜0.098 μg/ml）.It was significant that Pogostone was also active against some drug-resistant bacteria like MRSA.Furthermore,Pogostone showed antibacterial activity in vivo against Escherichia coli （E.coli） and MRSA via intraperitoneal injection.Ninety percent of the mice infected with E.coil could be protected at the concentrations of 50 and 100 mg/kg,and 60％ of the mice at 25 mg/kg,while the rate of protection for the mice infected with MRSA was 60％ and 50％ at doses of 100 and 50 mg/kg,respectively.Conclusion Pogostone could be developed as a potential antibacterial agent for clinical therapy.     

人表皮干细胞的体外培养与鉴定

目的 探讨人表皮干细胞的体外分离培养方法 ,并对培养的表皮干细胞进行鉴定.方法 运用中性蛋白水解酶和胰蛋白酶两步法分离表皮层和真皮层,并获得表皮单细胞悬液,采用Ⅳ型胶原铺板选择性黏附分离角质形成细胞,应用表皮干细胞培养基进行培养.倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,免疫组织化学染色观察表皮干细胞β1整合素、角蛋白19(K19)、CK10的表达. 结果 组织学观察显示,培养中实验组细胞呈现克隆生长,且克隆维持时间较长;免疫组织化学染色显示,实验组的培养细胞β1整合素及K19均呈阳性表达,而CK10阴性表达.结论 应用Ⅳ型胶原黏附和运用表皮干细胞培养基可以实现人体表皮干细胞的分离和培养,为表皮干细胞体外的大量扩增奠定了基础.     

In vitro activity of some newer quinolone compounds

The quinolones are a group of antimicrobial agents that act by inhibiting bacterial DNA gyrases, enzymes essential in DNA replication. Several newer quinolone agents have been introduced recently. These are broad spectrum agents which may be administered orally. In-vitro susceptibility testing of five quinolone agents namely norfloxacin, pefloxacin, enoxacin, ofloxacin and ciprofloxacin against recent clinical bacterial isolates at the General Hospital Kuala Lumpur was performed. The results confirm the broad spectrum and high activity of these agents against these isolates which included Pseudomonas aeruginosa and methicillin-resistant Staphylococcus aureus. The quinolones would provide valuable alternatives in the treatment of infections caused by organisms resistant to the more commonly used antibiotics.     

芙蓉菊多糖体外抗氧化活性研究

目的 研究芙蓉菊多糖的体外抗氧化活性。方法 采用1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基、还原力、超氧阴离子、羟自由基4种体外抗氧化模型研究芙蓉菊多糖的抗氧化活性,用维生素C作对照。结果 芙蓉菊粗多糖对DPPH自由基、还原力、超氧阴离子、羟自由基均有明显的清除能力,其中DPPH、超氧阴离子、羟自由基的EC50值分别为0.273、0.669、0.594 mg/mL,对羟自由基清除能力强于维生素C。芙蓉菊多糖对自由基清除率与其质量浓度存在着明显的量效关系。结论 芙蓉菊多糖具有良好的体外抗氧化活性,作为天然抗氧化剂和自由基清除剂有进一步研究的价值。     

II. In vitro studies of antibacterial activity

One hundred and forty isolates of beta-hemolytic streptococcus cultured from patients with clinical pharyngitis were studied by disc diffusion for antibiotic sensitivity to lincomycin, erythromycin, cephalexin and penicillin and by agar dilution to cephalexin and penicillin. All isolates were sensitive to ≤ 0.1 μg./ml. penicillin and ≤ 1.56 μg./ml. cephalexin. The disc-diffusion test was reliable in predicting the sensitivities in vitro. One strain of group A betahemolytic streptococcus was resistant to erythromycin by disc diffusion. When compared to Lancefield grouping 18% of strains were incorrectly identified as group A by the bacitracin-disc test. Cephalexin was uniformly effective in vitro in inhibiting beta-hemolytic streptococci and the 30 μg. cephalexin disc was reliable in predicting these sensitivities.     

牙源性角化囊性瘤上皮细胞的体外培养及鉴定

目的:建立牙源性角化囊性瘤上皮细胞体外培养体系并进行初步鉴定.方法:采用组织块及酶消化法原代培养牙源性角化囊性瘤上皮细胞,以无血清的角化上皮细胞培养基进行体外连续培养,并行细胞形态学观察及免疫组织化学鉴定.结果:体外培养的牙源性角化囊性瘤上皮细胞为多角形,胞浆均匀,轮廓清晰,表现上皮细胞特有的铺路石样外观,体外可传2～4代,生长周期约30～50 d.经波形丝蛋白、广谱角蛋白及角蛋白10、角蛋白14免疫组化染色证实,分离培养的细胞为上皮来源,无间充质细胞混杂.结论:采用无血清的角化细胞培养基可在体外进行牙源性角化囊性瘤上皮细胞的连续培养.     

米替福新对常见皮肤癣菌体外抑菌活性的研究

目的 了解米替福新对常见皮肤癣菌的体外抑菌活性.方法 参照美国临床和实验室标准化研究所(CLSI)制定的M 38-A方案测定77株常见皮肤癣菌(含三属即毛癣菌属、小孢子菌属和表皮癣菌属)的最低抑菌浓度(MIC).结果 米替福新对常见皮肤癣菌均有较好的抑菌作用,MIC90为1.0 μg/ml,MIC几何均数为0.617 μg/ml,MIC范围0.25～2.0 μg/ml.结论 米替福新对常见皮肤癣菌各属均有较好的抑菌作用.