血管内皮生长因子165转染骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白的表达

背景：血管内皮生长因子是一种有效的血管形成和通透性诱导因子,其中在体内以血管内皮生长因子165和血管内皮生长因子121表达为主,具有强烈的促血管新生作用。 目的：观察以血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞,继而分化为血管内皮细胞的可行性。 方法：分离提取50 g SD大鼠骨髓间充质干细胞,采用流式细胞仪鉴定,将携有血管内皮生长因子165基因的质粒pGLV-EF1a,采用慢病毒转染骨髓间充质干细胞,转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。 结果与结论：转染后12 h可见细胞内有绿色荧光蛋白表达,48 h 后表达增多,72 h后达到高峰,其后部分细胞荧光开始减退。结果证明血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞内有绿色荧光蛋白表达,提示细胞转染成功,骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性。     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染人脐带间充质干细胞

目的探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染人脐带间充质干细胞(UCMSCs)后目的基因表达情况及对UCMSCs生长增生的影响。方法 UCMSCs传代培养后,以腺病毒介导绿色荧光蛋白(GFP)基因进行体外转染,倒置荧光显微镜下观察细胞转染效果,流式细胞仪检测细胞转染效率,确定最佳的病毒感染复数(MOI)。将实验分为VEGF基因转染组和未转染组。转染组在最佳MOI值条件下以腺病毒介导VEGF基因体外转染UCMSCs;未转染组以PBS代替病毒液。通过免疫荧光染色及Western blotting检测两组UCMSCs VEGF蛋白的表达情况,RT-PCR检测VEGF基因mRNA的表达情况,ELISA检测培养液中VEGF浓度,MTT法评价转染后对UCMSCs生长增生的影响。结果腺病毒介导的GFP基因对于UCMSCs具有较高的转染效率,转染效率与MOI值具有量效关系,当MOI为100倍时,转染效率达95%。转染VEGF基因后2d,UCMSCs在mRNA和蛋白水平上均可有效表达VEGF,免疫荧光染色、RT-PCR、Western blotting显示转染组明显表达VEGF,ELISA检测结果显示7d时达到表达高峰,13d后仍可检测到VEGF的表达。介导VEGF基因转染的腺病毒对UCMSCs的生长增生没有明显影响。结论 UCMSCs是一种较理想的基因载体细胞,腺病毒介导VEGF基因可以有效转染UCMSCs,转染后VEGF基因可获得较高的表达水平。     

VEGF真核表达载体的构建及在内皮与心肌细胞内的表达

目的：探讨外源性人VEGF165基因在内皮细胞与心肌细胞内表达的可行性。方法：构建了(vaseular endothelium growth factor,VEGF)与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因其表达载体pIRES2—FGFP—VEGF165，以脂质体法转染内皮细胞和心肌细胞，采用荧光显做镜检测内皮细胞与心肌细胞中EGFP的表达，同时利用免疫组织化学方法检测VEGF的表达。结果：成功地构建了真核表达载体pIRES2—EGFP—hVEGF165，采用脂质体法转染内皮细胞与心肌细胞后，经荧光显微镜观察，可见细胞内有EGFP的表达，同时经免疫组化证实有VEGF的表达。结论：采用脂质体法可以成功地将外源性VEGF165基因转染到内皮细胞与心肌细胞中，并进行表达。本研究为今后利用VEGF基因治疗心肌缺血等疾病提供了实验基础。     

HESR1基因在血管新生中作用的初步研究

目的研究转录因子HESR1在血管新生中的作用。方法检测内皮细胞激活状态HESR1表达的影响,克隆HESR1基因,转染到HUVEC,绿色荧光和PCR观察HESR1在内皮细胞的表达,流式细胞仪检测它对血管内皮细胞增殖,boyden小室检测对细胞迁移的影响,建体外二维血管模型,观察HESR1对血管形成的影响。结果内皮细胞激活状态HESR1的表达下降,HESR1基因能抑制内皮细胞的增殖和迁移,减少血管新生。结论HESR1基因通过抑制内皮细胞的增殖和迁移,使内皮细胞从激活状态转入安静状态,减少血管的形成,维持血管的稳定状态。     

转染血管内皮细胞生长因子骨髓间充质干细胞与牛松质骨支架复合组织工程骨的血管形成

背景：小块组织工程骨植入动物体内后,早期依靠组织液的渗透可获得营养,但大块组织工程骨的营养仅靠组织液的渗透是远远不够的,必须通过血管再生来获得。 目的：观察转染血管内皮细胞生长因子表达载体骨髓间充质干细胞复合组织工程骨植入动物体内后的血管形成能力。 方法：制作日本大耳白兔双侧尺骨中段骨缺损模型,左侧尺骨缺损植入转染血管内皮细胞生长因子表达载体的自体骨髓间充质干细胞复合脱钙脱脂去蛋白的牛松质骨支架组织工程骨为实验组,右侧尺骨缺损植入自体骨髓间充质干细胞复合脱钙脱脂去蛋白的牛松质骨支架组织工程骨为对照组。术后12周行X射线摄片观察、大体标本观察、苏木精-伊红染色和Masson染色组织切片观察、MiFas图像分析系统定量分析。 结果与结论：实验组与对照组尺骨缺损处均有连续骨痂形成;组织切片经苏木精-伊红染色、Masson三色法染色及MiFas图像分析系统定量分析可见实验组和对照组均有大量的新生骨,但实验组新生血管明显多于对照组(P < 0.01),且血管较粗大,而且与新生骨接近。说明将转染血管内皮细胞生长因子表达载体的骨髓间充质干细胞复合在组织工程骨上植入动物体内可明显促进新生血管的形成。     

血管内皮生长因子基因转染的心肌细胞移植对心肌梗死大鼠心功能的影响

目的：探讨腺病毒介导血管内皮生长因子165基因（AdVEGF165）转染乳鼠心肌细胞后血管内皮生长因子（VEGF）的表达及移植于大鼠急性心肌梗死（MI）模型后对心功能的影响。方法:体外培养新生大鼠心室肌细胞、标记BrdU、共培养法转染AdVEGF165基因；收集培养液上清，ELISA法检测转染细胞VEGF的表达。结扎同种大鼠前降支建立心肌梗死模型，4周后将心肌梗死大鼠随机分为4组，分别注射移植转染心肌细胞(组Ⅰ)、单纯心肌细胞（组Ⅱ）、AdVEGF165（组Ⅲ）和DMEM培养基（组Ⅳ）。超声心动图检测移植前及移植4周后的心功能。处死大鼠，留取心脏标本作HE病理染色及免疫组化检测，并计数血管密度。结果:AdVEGF165基因转染的心肌细胞表达VEGF高于对照组(P<0.01)；超声检测心功能提示转染细胞组(组Ⅰ)心功能障碍轻于其它3组（P<0.01）；免疫组化检测显示，移植细胞在移植区存活；HE染色血管计数显示转染组(组Ⅰ)有更多的新生血管形成（P<0.01） 。结论：AdVEGF165基因转染心肌细胞后表达分泌VEGF增加，可促进梗死区新生血管形成，改善心肌血供，有利于移植细胞的存活，能更好地减轻心功能障碍。     

pEGFP/hVEGF121融合蛋白真核表达载体的构建及在骨髓间质干细胞中的表达

目的：构建携带人血管内皮细胞生长因子121及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒并检测其在骨髓间质干细胞（MSC）中的表达。 方法： 采用PCR技术，以pCD/hVEGF121质粒为模板扩增VEGF121基因全长，采用PCR产物的粘端克隆法，将VEGF121定向克隆入pEGFP-C1的多克隆位点，构建pEGFP/hVEGF121重组质粒，酶切、PCR及序列分析鉴定，脂质体介导转染体外培养的MSC，荧光显微镜及免疫细胞化学染色检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达。 结果： PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF121正确连接至pEGFP-C1的多克隆位点，pEGFP/hVEGF121重组质粒转染MSC后，荧光显微镜及免疫细胞化学检测EGFP/VEGF蛋白在MSC中存在表达。 结论： 成功构建了携带人VEGF121及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒，并在MSC中获得表达，为进一步研究VEGF基因治疗缺血性心血管疾病及MSC的分化奠定了实验基础。     

携带大鼠酪氨酸羟化酶基因慢病毒载体的构建及转染

目的:构建携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)和大鼠酪氨酸羟化酶(TH)基因的慢病毒载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC),观察TH基因的表达.方法:RT-PCR方法获得大鼠TH基因,将其克隆至慢病毒载体.通过瞬时转染法包装出病毒上清,鉴定滴度.感染rMSCs,荧光显微镜下观察EGFP的表达、转染效率,RT-PCR、免疫印迹法分别检测TH mRNA和蛋白的表达情况.结果:重组慢病毒载体质粒pNL-TH-IRES2-EGFP经双酶切鉴定正确,所获TH基因经测序后与GenBank报道序列完全一致;生产的病毒浓缩后滴度为4.1×10~7TU/ml;感染rMSCs结果显示荧光激发可见绿色荧光,TH-rMSCs、空载体-rMSCs组5d转染效率差异无统计学意义.RT-PCR、免疫印迹法显示TH基因成功在rMSCs中表达.结论:成功构建带有EGFP和大鼠TH基因的慢病毒载体,并获得TH-rMSCs基因工程细胞.     

MAGE-3基因稳定转染的HHCC细胞系的建立及其mRNA的表达

目的：构建肿瘤抗原MAGE-3基因的真核表达载体，建立MAGE-3基因稳定转染的人肝细胞癌细胞系（human hepatocellular carcinoma cell line，HHCC）。方法：利用分子生物学方法，构建带有MAGE-3基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-MAGE-3，经脂质体法转染HHCC后，用G418筛选阳性克隆。在荧光显微镜下观察HHCC中EGFP的表达，用RT-PCR法检测HHCC中MAGE-3 mRNA的表达。结果：成功地构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-MAGE-3。以其转染HHCC后，经荧光显微镜及RT-PCR分别检测到MAGE-3 mRNA转录和EGFP的表达。结论：建立了1株可稳定转染MAGE-3基因的肝细胞癌HHCC，为进一步应用该基因进行肝癌的免疫治疗提供了实验依据。     

黄芪多糖胶原干预周围组织中核因子κB与血管内皮细胞生长因子表达而 促进毛细血管新生**

背景：补气生血类中药具有与生长因子促血管生成作用相近的功效。 目的：观察黄芪多糖胶原促血管新生的疗效,及其对血管内皮细胞生长因子基因表达的核因子κB通路的影响。 方法：采用大鼠背部皮下植入模型,分别将黄芪多糖胶原和空白胶原植入大鼠背部两侧,于植入后3,7,14,21 d处死大鼠,取胶原周围肉芽组织进行检测。 结果与结论：造模后3 d时,大鼠肉芽组织中微血管数开始增加,7~14 d时达到峰值,之后下降。在造模后3,7,14 d,植入黄芪多糖胶原的大鼠周围肉芽组织中毛细血管数、血管内皮细胞生长因子mRNA及核因子κB蛋白的表达均显著高于植入空白胶原的大鼠(P < 0.01),且核因子κB蛋白的表达早于毛细血管新生与血管内皮细胞生长因子mRNA的表达。说明黄芪多糖胶原促血管新生作用有可能是通过活化核因子κB信号通路而上调血管内皮细胞生长因子mRNA表达实现的。     

人VEGF165基因真核表达质粒的构建及其对血管内皮细胞增殖的影响

目的 :构建人VEGF16 5基因的真核表达质粒pBudCE4 .1/VEGF16 5 ,观察其在血管内皮细胞 (VEC)中的表达和表达产物对VEC增殖的影响。方法 :用RT PCR法从引产胎儿心脏组织中克隆VEGF16 5基因 ,并将其克隆至真核表达质粒pBud CE4 .1中 ,对重组真核表达质粒pBudCE4 .1/VEGF16 5进行酶切鉴定和测序。以脂质体转染法将pBudCE4 .1/VEGF16 5导入VEC中 ,用Northernblot和免疫细胞化学染色法 ,分别从mR NA水平和蛋白质水平检测它们在转染的VEC中的表达 ,并检测表达产物对VEC增殖的影响。结果 :人VEGF16 5基因的RT PCR产物为 5 76bp。测序结果显示 ,扩增的VEGF16 5基因的序列与基因文库中登录的序列完全一致。经HindⅢ和BamHI酶切鉴定证实 ,VEGF16 5基因已成功地克隆至真核表达质粒pBudCE4 .1中。以其转染血管内皮细胞 (VEC)后 ,经Northernblot杂交和免疫细胞化学染色法检测均证实VEGF16 5基因表达。表达产物对VEC增殖有明显的促进作用。结论 :所构建的pBudCE4 .1/VEGF16 5真核表达质粒可在VEC中表达 ,表达产物可明显促进VEC增殖 ,为通过VEGF16 5基因转染防治移植器官内血管的狭窄奠定了基础     

反义VEGF165基因转染对人神经母细胞瘤生物学行为的影响

目的探讨反义VEGF165基因转染在抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长中的作用。方法构建正义和反义VEGF165真核表达载体,用脂质体转染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,G418筛选稳定表达细胞克隆。应用RT-PCR证实外源性反义VEGF mRNA的表达,免疫细胞化学和EUSA检测VEGF蛋白的表达水平,MTT法检测肿瘤细胞体外生长情况,并接种于裸鼠皮下,观察体内肿瘤增殖能力。结果RT-PCR证实转染反义VEGF的细胞中有外源性反义VEGF mRNA的表达,免疫细胞化学和EUSA显示VEGF蛋白表达明显降低,MTT实验显示转染前后细胞体外生长速度基本一致。而转染反义VEGF的肿瘤细胞裸鼠体内生长速度明显减慢。结论反义VEGF基因转染能够有效抑制SH-SY5Y细胞内源性VEGF蛋白的表达,抑制裸鼠体内肿瘤的生长。     

血管内皮细胞生长因子基因转染骨髓基质细胞的瞬时表达与稳定表达

目的探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因修饰的大鼠骨髓基质细胞（BMCS）的表达能力及表达活性。方法取6周龄SD大鼠BMCS传代培养后以3μl阳离子脂质体（Lipofectamine）：1μg pc DNA3．1-VEGF165的比例转染，通过RT—PCR技术、免疫组织化学S—P法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及瞬时表达和稳定表达，用血管内皮细胞（VEC）增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果VEGF基因转染的大鼠骨髓基质细胞可有效转录VEGF165，其分泌培养上清液中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖，具有很强的生物活性。结论采用基因转染技术可将VEGF转染至BMCS中，并可有效表达具有生物活性的VEGF。     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景：骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。 目的：观察hVEGF165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。 方法：体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1∶3比例的混合液转染,并分为3组：转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。 结果与结论：转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义(P < 0.05),但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义(P > 0.05),转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义(P< 0.05),hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

携带人血管内皮生长因子165慢病毒表达载体的构建与表达*

背景：已有研究证实血管内皮生长因子在正常肝脏肝部分切除后余肝的再生过程中发挥着重要的作用,但关于其对肝硬化肝脏是否也有相同作用国内外鲜有报道。 目的：构建携带人血管内皮生长因子165基因的慢病毒载体,体外转染BLR 3A大鼠肝细胞并观察该细胞中人血管内皮生长因子165基因的表达。 方法：采用DNA重组技术将人血管内皮生长因子165基因克隆入pLenti6/V5-D-TOPO慢病毒表达载体中,筛选出阳性克隆与慢病毒包装系统ViraPowerTM Packaging Mix共转染293T细胞产生病毒颗粒,通过实时定量-聚合酶链反应法测定病毒滴度;携带人血管内皮生长因子165基因的慢病毒载体体外转染BLR 3A大鼠肝细胞72 h后,利用反转录-聚合酶链反应及Western blot法检测细胞中人VEGF165 mRNA及蛋白的表达。 结果与结论：成功构建了表达人VEGF165基因的慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO-VEGF165,测得病毒滴度为1.18×     107 VP/mL。重组慢病毒载体转染BLR 3A大鼠肝细胞72 h后,荧光蛋白表达率超过80%,反转录-聚合酶链反应及Western blot法测得转染组人血管内皮生长因子165 mRNA及血管内皮生长因子165蛋白表达阳性。提示构建的携带人血管内皮生长因子165的慢病毒载体可有效转染BLR 3A大鼠肝细胞,并促使该细胞表达人血管内皮生长因子165 mRNA及蛋白。 关键词：人血管内皮生长因子165;慢病毒载体;BLR 3A大鼠肝细胞;转染;基因治疗 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.11.007     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。 目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。 方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA 进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。 结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165 cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。     

人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定

背景：人白血病抑制因子(LIF)和血管内皮生长因子165(VEGF165)对脊髓损伤后神经元存活有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。 目标：构建双基因共表达载体pIRES2-LIF-VEGF165并对其进行鉴定。 方法：是采用直接PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人白血病抑制因子基因,然后将人白血病抑制因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-LIF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-LIF-EGFP中,最后构建成为含有IRES(即内部核糖体进入位点)的pIRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体。通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达。 结果与结论：DNA测序显示,提取的人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,片段大小分别为609 bp和576 bp。构建的pIRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体经EcoRI/BamHI切出LIF条带,经BamHI/NotI双酶切后切出IRES-VEGF165片段,经EcoRI/NotI双酶切后切出LIF-IRES-VEGF165片段。RT-PCR 与Western-blot方法检测显示,此载体转染后,HEK293细胞均能表达人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。结果证实,实验成功构建了人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

血管内皮生长因子165转染可促进脂肪间充质干细胞增殖

背景：血管内皮生长因子是目前最重要的促血管新生因子之一,在脂肪移植中可促进移植物的血运重建,提高成活率。 目的：探讨血管内皮生长因子165基因转染促进脂肪间充质干细胞增殖的作用。 方法：利用目的片段重组血管内皮生长因子165基因入腺病毒pAdEasy-1系统,包装病毒并测定滴度,同理包装空病毒。将包装成功的两种病毒液分别以100的最佳感染复数转染入脂肪间充质干细胞内,以未转染细胞为空白组。采用RT-PCR和Western blot法检测各组转染细胞中血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测各组细胞的增殖情况。 结果与结论：实验组血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白表达量高于对照组和空白组(P < 0.05);实验组转染脂肪间充质干细胞后分裂增殖程度显著增加,与对照组和空白组比较差异有显著性意义(P < 0.05),结果表明腺病毒介导的血管内皮生长因子165基因转染脂肪间充质干细胞后可以持续表达目的蛋白,同时也能促进脂肪间充质干细胞的显著增殖。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程