用SYBR Green I实时逆转录-聚合酶链反应定量检测人、小鼠精子中CatSper1 mRNA

目的：建立并优化SYBR GreenI实时RT-PCR体系,定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。方法：用TRIzol分别提取人、小鼠成熟精子中的总RNA,逆转录后用SYBR GreenI实时PCR定量检测CatSper1 mRNA。SYBR GreenI实时PCR采用普通PCR试剂,加入SYBR GreenI染料,优化退火温度、Mg^2＋浓度及上、下游引物比例,并在PCR循环时采用四步法以消除引物二聚体的影响。优化完成后用不同浓度的精子cDNA为模板做标准曲线,以检测SYBR GreenI实时PCR的扩增效率。结果：定量检测CatSper1 mRNA的SYBR GreenI实时PCR体系适宜退火温度、Mg^2＋浓度及上、下游引物比例分别为63℃、3.0mmol/L和1∶1,四步法中采集荧光的温度为88℃。优化后用人和小鼠精子cDNA为模板做标准曲线分别为Y=-3.402log（X）＋25.99和Y=-3.409log（X）＋24.09,扩增效率分别为96.8%和96.5%,可定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。结论：用普通的逆转录及PCR系统和试剂,建立了一种方便、廉价、可靠的SYBR GreenI实时荧光定量RT-PCR系统,可用于人、小鼠精子中CatSper1 mRNA定量检测。     

CatSperl在小鼠睾丸发育过程中的动态表达及与人精子活力的关系

目的 研究CatSper1 mRNA在小鼠睾丸发育过程中的动态变化，并探讨CatSper1蛋白表达与精子运动的关系。方法 采用荧光实时逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）相对定量法检测CatSper1mRNA在出生后11、15、18、21、25、28、35、42、56和120d龄C57BL／6小鼠（每天龄3只）睾丸中的表达；分别从4例正常精液标本中用四层密度梯度Percoll（浓度分别为95％、76％、57％和47．5％）离心分离出高活力和低活力精子，用于Western Blot定量检测CatSper1蛋白的表达。结果CatSper1mRNA在18d龄小鼠睾丸开始表达，在25和28d龄表达上调明显，分别为21d龄表达水平的2．95和7．59倍。自42d后上调缓慢，至成年小鼠时达到最高水平。CatSper1蛋白在每例标本高活力精子中的表达量均显著高于低活力精子（P〈0．05）。结论 CatSper1与精子活力特性有关，为进一步研究CatSper家族各成员间的关系和确切功能提供参考依据。     

真核表达CatSper1用于筛选有效siRNA的体外实验研究

目的 构建pEGFP-N1-CatSper1重组质粒,在真核细胞中表达CatSper1,利用化学合成siRNA抑制小鼠CatSper1基因的表达,并筛选抑制效果最佳的siRNA序列. 方法 利用重组PCR克隆小鼠CatSper1全长cDNA,构建到真核表达载体中.生物信息分析软件校正结果,获得三条针对雄性小鼠CatSper1的siRNA序列,合成后分别与重组质粒pEGFP-N1-CatSper1共转染到小鼠成神经瘤N2a细胞株中,通过观察EGFP荧光强度、实时定量聚合酶链反应和WesternBlot等方法,分析干扰效果,筛选能显著降低N2a细胞中外源性CatSper1表达量的siRNA序列. 结果 成功克隆小鼠CatSper1基因的全长cDNA片段（2,061 bp）,并构建到pEGFP-N1表达载体中.三个siRNA干扰组的CatSper1 mRNA和蛋白表达与空白对照组相比均下降,其中以靠近3＇端的siRNA干扰作用更为明显,阴性对照siRNA组未引起CatSper1 mRNA和CatSper1蛋白表达明显变化. 结论 在小鼠神经瘤N2a细胞株中成功表达外源性CatSper1蛋白,并筛选出有效的siRNA,为深入研究CatSper1功能及用于避孕提供参考.     

人精子DNA从头甲基化转移酶及甲基CpG结合蛋白的mRNA表达分析

目的 通过体外分离成熟的精子,利用实时荧光定量PCR(qRealTime-PCR)检测其是否表达DNA从头甲基化转移酶(DNMT1/3a/3b)及甲基CpG结合蛋白(MeCP2),为精子中甲基化表观修饰研究提供依据.方法 体外采集健康男性志愿者的精液标本,利用精子上游收集法获得具有活性的成熟精子.通过SYBR Green/PI双染色法,利用流式细胞术(FCM)检测精子样本的质膜完好性及其活性.抽提精子的总RNA,逆转录PCR获得cDNA,利用qRealTime-PCR鉴定精子甲基化转移酶及甲基CpG结合蛋白的mRNA表达情况.结果 SYBR Green/PI双染色和流式细胞仪检测发现,利用上游收集法可以收集SYBR Green /PI-的精子占总精子数的(94.513±1.120)%,表明该方法可以收集到质膜完好且活性强的精子.qRealTime-PCR结果显示,此样本精子中DNA从头甲基化转移酶的表达比较明显,而甲基CpG结合蛋白的表达量相当低.其中DNMT1的mRNA表达量较高(0.272±0.045,P＜0.05),DNMT3a和DNMT3b的表达水平比较弱[(4.930±0.01)E-006,(6.500±1.7)E-005,P＜0.05],而MeCP2几乎不表达[(2.12±0.91)E-006,p＜0.05].结论 利用qRealTime-PCR可以比较快速方便的检测出此次精子样本中DNA从头甲基化转移酶和甲基CpG结合蛋白的mRNA表达水平.     

SYBR green实时荧光定量PCR检测VEGF mRNA方法的建立

目的：建立SYBR green实时荧光定量PCR检测VEGF mRNA水平的方法，并初步应用于美容相关疾患。方法：构建内参GAPDH质粒，倍比稀释VEGF和GAPDH标准品，建立PCR标准曲线，同时绘制熔解曲线，后应用SYBR Green实时荧光定量PCR检测正常皮肤、烧伤瘢痕、恶性黑素瘤细胞株A2058和WM793 cDNA的VEGF mRNA水平。结果：VEGF、GAPDH的标准曲线，符合线性要求，相关系数r均为1，熔解曲线峰值单一，产物特异度好，四组样本的SYBR green荧光定量PCR结果提示瘢痕组织、A2058、WM793的VEGF mRNA水平明显高于正常皮肤。结论：本研究成功建立了VEGF mRNA水平的SYBR green荧光定量PCR检测方法。     

CatSper1在精索静脉曲张模型大鼠精子中的差异表达及左卡尼汀对其的保护作用

目的:通过制备精索静脉曲张大鼠模型,检测其附睾精子中精子特异性钙通道(CatSper1)的表达,观察左卡尼汀对大鼠精子CatSper1的影响。方法:70只雄性大鼠随机分为7组,每组10只。分别为对照组(A组),精索静脉曲张组(B组),精索静脉曲张+生理盐水组(C组),精索静脉曲张+小、中、大剂量左卡尼汀组(D、E、F组)和F+延长喂养14 d组(G组)。手术结扎部分左肾静脉制备精索静脉曲张大鼠模型,12周后,C组给予生理盐水1 ml/d,D、E、F组分别用左卡尼汀小[0.05 g/(kg·d)]、中[0.1 g/(kg·d)]、大[0.2 g/(kg·d)]剂量灌胃35 d,G组在F组基础上延长灌胃14 d;实验结束后处死大鼠,进行精子参数分析,应用RT-PCR以及Western印迹分别检测精子中CatSper1 mRNA及蛋白表达情况。结果:与A组比较,B组a+b级精子百分率、精子活率及浓度均不同程度下降(P0.01),B组精子CatSper1 mRNA及蛋白相对表达量均明显下降(1.44±0.67 vs 0.71±0.38;1.87±0.67 vs 0.84±0.42,P0.01)。与C组比较,应用左卡尼汀后,各组精子浓度无明显增加, a+b级精子百分率、精子活率以及精子CatSper1 mRNA及蛋白表达含量明显增高,尤其大剂量组F、G组增高更加明显(P0.01)。与F组比较,G组延长应用2周左卡尼汀,精子CatSper1 mRNA及蛋白表达量无明显增加(P0.05)。结论:精索静脉曲张模型大鼠精子中CatSper1表达下降,应用左卡尼汀后,CatSper1的表达量及a+b级精子百分率、精子活率明显增加。     

CatSper基因家族在人和小鼠组织中的表达特征

目的研究CatSper基因家族在人和小鼠组织中的分布特点。方法将不同发育阶段的小鼠睾丸组织cDNA与Affymetrix全基因组芯片探针进行杂交,筛选出差异表达基因CatSper基因家族。RT—PCR验证差异表达基因在不同发育阶段的小鼠睾丸组织的表达特征,及其在人和小鼠不同组织中的分布。结果基因芯片分析发现CatSper1、CatSper2和CatSper3在小鼠睾丸的表达呈阶段特异性。RT-PCR结果表明该基因家族在睾丸的表达丰度明显高于其它组织;CatSper1和CatSper4在人体睾丸组织中特异性表达。结论CatSper基因家族在人和小鼠中呈现睾丸特异性表达或高表达,可能在精子发生中发挥重要功能。     

RCAS1mRNA在肝细胞癌中表达的意义

目的研究RACS1mRNA在原发性肝细胞癌中的表达并探讨其意义。方法应用SYBR GreenⅠ逆转录实时荧光定量PCR技术检测37例肝细胞癌(HCC)及癌旁组织中RCAS1mRNA的相对表达量,研究其表达与各项临床指标间的关系。结果RCAS1mRNA的表达水平与病理分级和临床TNM分期有显著相关性(P<0.05),而与病人的性别、血清AFP水平及肿瘤大小无显著相关性。结论RACS1mRNA可作为判断HCC侵袭性和进展的一个潜在指标。     

双孔钾离子通道TASK-1、TRAAK在弱精子症患者精子中的表达

目的 探讨双孔钾离子通道TASK-1、TRAAK在精子中的表达水平及TASK-1、TRAAK在弱精子症发生机制中的作用。方法 采用非连续密度梯度离心分离、纯化正常对照组精液标本20例和弱精子症组精液标本30例,提取精子总RNA后,采用RT-PCR,SYBR Green实时定量PCR检测精子中TASK-1、TRAAK mRNA的相对表达量。结果 TASK-1、TRAAK mRNA在正常对照组和弱精子症组精子中均有表达;其中,TRAAK在弱精子症患者精子中的表达量明显低于其在正常对照组精子中的表达量,下降2.3倍,两组之间有明显的统计学差异(P0.05),TASK-1在弱精子症患者精子中的表达量与其在正常对照组精子中的表达量没有明显差异(P0.05)。结论 TRAAK基因在弱精子症患者精子中的表达下调可能与精子活力下降有关,提示TRAAK可能成为弱精子症发病机制研究的一个分子靶标。     

PTEN和Survivin在膀胱癌中的表达及临床意义

目的 探讨PTEN mRNA和Survivin mRNA在膀胱移行细胞癌中的表达及其与病理分级、临床分期和复发的关系.方法 采用SYBR Green Ⅱ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应试验方法检测43例膀胱癌组织及9例膀胱正常组织中PTEN mRNA和Survivin mRNA的表达情况.结果 膀胱正常组织中PTEN m...     

CatSper与精子超活化

精子超活化是受精前精子运动方式发生改变的过程,Ca2+参与这一过程,诱导精子鞭毛发生不对称运动。CatSper是近来发现的一类仅存于精子鞭毛上的阳离子通道,作为Ca2+内流的通道参与精子超活化过程。现就目前CatSper在小鼠上的研究现状,对其蛋白结构、分布、在精子超活化过程中调节Ca2+的作用以及尚待解决的问题作一综述。     

Wistar大鼠smad3 cDNA序列测定及其mRNA水平实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的：克隆和测定Wistar大鼠smad3基因部分序列，构建检测Wistar大鼠smad3基因表达的重组质粒标准品并建立实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）方法。方法：提取并培养Wistar大鼠皮肤成纤维细胞的总RNA，逆转录（RT）-PCR扩增，将扩增产物克隆到PMD-18T载体上，测序分析。用已测定序列的T载体作为标准品建立实时荧光定量PCR方法，并检测转化生长因子-β1（TGF-β1）刺激对培养Wistar大鼠皮肤成纤维细胞smad3 mRNA表达的影响。结果：测定Wistar大鼠smad3基因cDNA序列长415bp，其与人、家鼠、小鼠具有较高的同源性，已被GenBank收录（DQ409172）。建立的实时荧光定量PCR方法在10^3-10^7拷贝数/μl的标准品梯度稀释范围内相关系数为0.98946。25ng/ml TGF-β1刺激后Wistar大鼠皮肤成纤维细胞smad3基因表达升高为PBS刺激对照组的1.5倍。结论：获得Wistar大鼠smad3基因序列并成功建立了smad3实时荧光定量PCR的方法，为Smad3作用的分子机制研究提供了实验基础。     

弱精子症患者精子中CRISP2基因及蛋白的初步研究

目的:探讨弱精子症患者精子中富含半胱氨酸的分泌蛋白2(CRISP2)mRNA及蛋白的表达水平,探讨其与精子活力的关系及相关的分子机制。方法:收集成年男性弱精子症患者精液78例,活力正常精液70例作为对照组,50% Percoll离心分离纯化后,提取精子总RNA及总蛋白,采用RT-PCR,SYBR Green实时定量PCR和Western印迹技术检测CRISP2 mRNA及蛋白相对表达量。结果:CRISP2基因在弱精子症患者精子中的表达量明显低于其在正常对照组精子中的表达量,下降达4.3倍;Western印迹发现CRISP2蛋白在弱精子症组较正常对照组下降达1.71倍,两组之间的表达量有明显的统计学差异(P<0.05)。结论:CRISP2基因及蛋白在弱精子症患者精子中的表达下调可能与精子活力下降有密切联系,提示CRISP2基因及蛋白可能成为弱精子症发病机制研究的一个分子靶标。     

Relationship between DYNLT1 and Beclin1 expression and the fertilising potential of human spermatozoa

This study aimed to evaluate dynein light chain type 1 (DYNLT1) mRNA expression in mature spermatozoa and to investigate its association with Beclin1 expression to help in understanding of pathogenesis of male infertility. It included 60 infertile men divided into idiopathic (n = 20), accessory gland inflammation (n = 20), and varicocele (n = 20) groups, and 20 healthy fertile men as a control group. Semen parameters were evaluated according to the 2010 World Health Organization criteria. Mature spermatozoa were isolated by Sil‐select gradient. Relative quantification of DYNLT1 and Beclin1 mRNA expression in whole sperm pellet and mature spermatozoa was done using real‐time PCR. Beclin1 protein was assessed in whole sperm pellet and mature spermatozoa by ELISA. Beclin1 mRNA and protein were significantly increased in spermatozoa from infertile patients of different aetiologies in comparison to healthy controls (p < .05). However, DYNLT1 mRNA expression was significantly decreased in infertile groups than controls (p < .05). Mature spermatozoa extracted from all studied subjects showed increased DYNLT1 mRNA and decreased Beclin1 mRNA and protein expression compared with the whole sample. It is concluded that decreased Beclin1 and increased DYNLT1 mRNA expression in mature spermatozoa may provide an insight into the biological processes that are activated or suppressed during sperm maturation.     

Low expression of glycoprotein subunit 130 in ejaculated spermatozoa from asthenozoospermic men

Previous studies showed that interleukin-6 (IL-6) was expressed in human Leydig and Sertoli cells and that it inhibited sperm motility. The aim of this study was to compare the expression of IL-6, IL-6R, and GP130 in ejaculated spermatozoa between normozoospermic and asthenozoospermic men. Human spermatozoa in the semen were purified by Percoll gradient technique to separate the seminal plasma and other round cells. RT-PCR, immunocytochemistry, and Western blot were used to detect the expression of IL-6, IL-6R, and GP130 in spermatozoa. With RT-PCR, only GP130 mRNA but not IL-6 and IL-6R mRNA was expressed in human ejaculated spermatozoa. The expression of GP130 mRNA was significantly lower in asthenozoospermic men than in normozoospermic men. The protein expression of GP130 was further confirmed by both immunocytochemistry and Western blot. Again, GP130 protein levels were significantly lower in asthenozoospermic men than in normozoospermic men. The results suggested that the decreased expression of GP130 in ejaculated spermatozoa could be associated with low sperm motility in asthenozoospermic men.     

Aquaporin3 expression and the potential role of aquaporins in motility and mitochondrial membrane potential in human spermatozoa

Aquaporins are water selective channels which play important roles in cell volume regulation during the transmission of spermatozoa to female tract. This study investigated the expression of aquaporin3 and determined the role of aquaporins in human sperm motility and mitochondrial membrane potential (MMP). RT-PCR and flow cytometry analysis were done to investigate aquaporin3 expression levels, and immunolocalisation of aquaporin3 in the spermatozoa was detected using immunocytochemical analysis. The sperm suspension was divided into four groups of spermatozoa: (a) Spermatozoa at 0 hr, (b) spermatozoa in control group, (c) spermatozoa treated with HgCl₂ (as an aquaporin inhibitor) and (d) spermatozoa treated with HgCl₂+ and 2-mercaptoethanol. The sperm samples were examined in terms of sperm motility and mitochondrial membrane potential. Results confirmed aquaporin3 expression in human spermatozoa and immunocytochemistry results showed an intense immunoreactivity in whole sperm tail. After 60 min, HgCl₂ showed a significant decrease in motility and MMP compared to the control group. At this time point, 2-mercaptoethanol in the HgCl₂+ 2-mercaptoethanol group reversed the effects of HgCl₂ as compared to the HgCl₂ group. Present study showed the expression and immunolocalisation of AQP3 in human spermatozoa and the potential role of AQPs in the sperm motility and MMP.     

“益精方”对小鼠精子尾部特异性钙通道CatSper1的影响

目的:观察"益精方"对环磷酰胺所致少弱精子症模型小鼠精子尾部特异性钙通道CatSper1的影响。方法:将40只雄性昆明小鼠随机分为对照组(CG)、模型组(MG)、小剂量中药治疗组(SG)和大剂量中药治疗组(LG),按60mg/kg体重给CG小鼠腹腔注射生理盐水(NS),给MG、SG、LG小鼠腹腔注射环磷酰胺,每天1次,连续5d,第6d开始按体重分别给SG和LG小鼠灌服"益精方",剂量分别为人类常规用量(以60kg为标准)的1倍和5倍,MG小鼠给予等体积的NS灌胃,每天1次,连续34d,CG常规饲养,然后对小鼠进行精液常规分析,并用RT-PCR法检测小鼠精子CatSper1的表达。结果:CG、MG、SG和LG组小鼠附睾精子密度分别为(5.20±1.34)、(1.73±0.03)、(2.08±0.01)、(3.31±0.56)×106/ml,a+b级精子百分率分别为(14.49±0.30)%、(6.64±1.88)%、(11.99±1.01)%、(19.40±3.13)%,a+b+c级精子百分率分别为(68.39±15.13)%、(39.96±4.89)%、(62.28±4.43)%、(73.61±5.05)%,MG组精子密度、a+b级精子百分率、a+b+c级精子百分率显著低于CG组(P<0.05),经治疗后LG组精子密度、a+b级精子百分率、a+b+c级精子百分率明显增加,与MG组比较有显著性差异(P<0.05),而与CG组在a+b级精子百分率和a+b+c级精子百分率上没有明显区别。CatSper1的表达量在CG、MG、SG和LG组分别为0.76±0.05、0.73±0.03、0.75±0.12、0.85±0.04,LG组显著高于MG组(P<0.05),而与CG组比较没有明显区别。结论:腹腔注射环磷酰胺可使小鼠精子密度、a+b级精子百分率、a+b+c级精子百分率降低,CatSper1表达量下降,大剂量"益精方"可以通过提高CatSper1的表达量,增加小鼠精子密度、a+b级和a+b+c级精子百分率,从而达到治疗少弱精子症的目的。     

Ropporin基因在人精子中的表达和意义

目的 检测ropporin基因在人精子中的表达.探讨Ropporin抗体对人精子运动的影响,评价Ropporin蛋白在精子运动中的功能.方法 收集正常男性精子,非连续梯度离心法分离精子,用RT-PCR、免疫印迹和免疫荧光方法检测ropporin基因在精子中的表达和蛋白定位;将纯化精子分别在含不同浓度Ropponn抗体的培养液中孵育(0,0.8,4和20 μ g/mL),在不同时间点(1,2,6h)用精子计算机辅助分析系统(computer-assisted sperm analysis,CASA)检测精子活动力.结果 RT-PCR、免疫印迹和免疫荧光方法均检测出ropporin基因在精子中表达;免疫荧光表明Ropporin主要定位在精子鞭毛的主段和末段;抗体实验显示抗体孵育1h、2h、6h后精子的快速前向运动(a级)和慢速前向运动(b级)均明显受到抑制,并显示剂量依赖性.结论 Ropporin在精子鞭毛的主段和末段上的表达与精子的运动密切相关.