用SYBR Green I实时逆转录-聚合酶链反应定量检测人、小鼠精子中CatSper1 mRNA

目的：建立并优化SYBR GreenI实时RT-PCR体系,定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。方法：用TRIzol分别提取人、小鼠成熟精子中的总RNA,逆转录后用SYBR GreenI实时PCR定量检测CatSper1 mRNA。SYBR GreenI实时PCR采用普通PCR试剂,加入SYBR GreenI染料,优化退火温度、Mg^2＋浓度及上、下游引物比例,并在PCR循环时采用四步法以消除引物二聚体的影响。优化完成后用不同浓度的精子cDNA为模板做标准曲线,以检测SYBR GreenI实时PCR的扩增效率。结果：定量检测CatSper1 mRNA的SYBR GreenI实时PCR体系适宜退火温度、Mg^2＋浓度及上、下游引物比例分别为63℃、3.0mmol/L和1∶1,四步法中采集荧光的温度为88℃。优化后用人和小鼠精子cDNA为模板做标准曲线分别为Y=-3.402log（X）＋25.99和Y=-3.409log（X）＋24.09,扩增效率分别为96.8%和96.5%,可定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。结论：用普通的逆转录及PCR系统和试剂,建立了一种方便、廉价、可靠的SYBR GreenI实时荧光定量RT-PCR系统,可用于人、小鼠精子中CatSper1 mRNA定量检测。     

多重逆转录-聚合酶链反应方法半定量检测多药耐药基因mRNA表达

目的：建立多重逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）半定量检测肝癌多药耐药（MDR）基因mRNA表达。方法：在对二重RT-PCR扩增5种MDR基因mRNA动力学观察及建立RT-PCR标准曲线的基础上，建立六重RT-PCR方法。结果：六重RT-PCR与单重或二重RT-PCR扩增体系在特异性和扩增效率等方面相同，实验重复性较好。结论：该方法对于检测肝癌组织和肝癌细胞MDR基因mRNA表达具有特异、灵敏、简便、快速（6h）、所需标本量小（5mg）及半定量等优点，能快速同时分析大量样本，具有临床应用前景。     

逆转录聚合酶链反应技术检测人肝癌nm23-H1基因mRNA表达

为探讨人肝癌中肿瘤转移抑制基因ｎｍ２３－Ｈ１的ｍＲＮＡ表达状况,设计特异性引物,应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术检测分析了２０例人肝癌组织及相应癌旁肝组织中ｎｍ２３－Ｈ１基因的ｍＲＮＡ表达。结果 特异性引物能成功扩增ｎｍ２３－Ｈ１基因的几乎整个编码序列：２０例肝癌及癌旁肝组织的ＲＴ－ＰＣＲ结果均为阳性,ｎｍ２３－Ｈ１基因ｍＲＮＡ未发生表达缺失或较大变异现象,由此表明,本实验建立的ＲＴ－Ｐ     

基于85B mRNA的逆转录-实时定量聚合酶链反应对肺结核分枝杆菌感染的诊断价值

目的探讨痰液样本中检测结核分枝杆菌（MTB）85B mRNA的逆转录-实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）对MTB感染的诊断价值。 方法分别纳入2016年1月至2016年12月陕西省结核病防治院经痰培养法（BACTEC MGIT 960系统）确诊为MTB阳性患者60例为试验组,60例无MTB感染的健康人为对照组。提取痰液样本核酸,分别采用TaqMan法检测MTB基因中编码16S rRNA的DNA序列和RT-qPCR法检测MTB的85B mRNA,比较两种方法的诊断效能（敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性）。 结果TaqMan法诊断MTB感染的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为93.3%、83.3%、84.9%、92.6%和88.3%;RT-qPCR法分别为98.3%、95.0%、95.2%、98.3%和96.7%。通过二元Logistics回归分析证实基于85B mRNA的RT-qPCR法对MTB感染鉴别能力更强（OR = 19.924,95%CI：5.364～73.012,P < 0.001）。 结论基于结核分枝杆菌85B mRNA的RT-qPCR方法能够快速、有效诊断MTB感染。     

“益精方”对小鼠精子尾部特异性钙通道CatSper1的影响

目的:观察"益精方"对环磷酰胺所致少弱精子症模型小鼠精子尾部特异性钙通道CatSper1的影响。方法:将40只雄性昆明小鼠随机分为对照组(CG)、模型组(MG)、小剂量中药治疗组(SG)和大剂量中药治疗组(LG),按60mg/kg体重给CG小鼠腹腔注射生理盐水(NS),给MG、SG、LG小鼠腹腔注射环磷酰胺,每天1次,连续5d,第6d开始按体重分别给SG和LG小鼠灌服"益精方",剂量分别为人类常规用量(以60kg为标准)的1倍和5倍,MG小鼠给予等体积的NS灌胃,每天1次,连续34d,CG常规饲养,然后对小鼠进行精液常规分析,并用RT-PCR法检测小鼠精子CatSper1的表达。结果:CG、MG、SG和LG组小鼠附睾精子密度分别为(5.20±1.34)、(1.73±0.03)、(2.08±0.01)、(3.31±0.56)×106/ml,a+b级精子百分率分别为(14.49±0.30)%、(6.64±1.88)%、(11.99±1.01)%、(19.40±3.13)%,a+b+c级精子百分率分别为(68.39±15.13)%、(39.96±4.89)%、(62.28±4.43)%、(73.61±5.05)%,MG组精子密度、a+b级精子百分率、a+b+c级精子百分率显著低于CG组(P<0.05),经治疗后LG组精子密度、a+b级精子百分率、a+b+c级精子百分率明显增加,与MG组比较有显著性差异(P<0.05),而与CG组在a+b级精子百分率和a+b+c级精子百分率上没有明显区别。CatSper1的表达量在CG、MG、SG和LG组分别为0.76±0.05、0.73±0.03、0.75±0.12、0.85±0.04,LG组显著高于MG组(P<0.05),而与CG组比较没有明显区别。结论:腹腔注射环磷酰胺可使小鼠精子密度、a+b级精子百分率、a+b+c级精子百分率降低,CatSper1表达量下降,大剂量"益精方"可以通过提高CatSper1的表达量,增加小鼠精子密度、a+b级和a+b+c级精子百分率,从而达到治疗少弱精子症的目的。     

逆转录-聚合酶链反应检测增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸对BIU-87细胞mRNA表达的影响

我们试图通过基因转染技术将针对增殖细胞核抗原 (ＰＣＮＡ)的反义寡脱氧核苷酸转入ＢＩＵ 87细胞 ,与细胞ＰＣＮＡｍＲＮＡ形成ｍＲＮＡ ＲＮＡ杂交链 ,从而降低细胞的增殖水平 ,达到治疗肿瘤的目的。一、材料与方法1 .细胞培养和寡脱氧核苷酸的处理 :人膀胱移行细胞癌细胞株ＢＩＵ 87在含 1 0 %灭活小牛血清和双抗的ＲＰＭＩ1 640培养基 (ＧｉｂｃｏＢＲＬ公司 )、37℃、5 %ＣＯ2 恒温箱中培养 ,0 .2 5 %胰蛋白酶消化传代。我们采用与ＰＣＮＡｍＲＮＡＡＵＧ端互补的反义寡脱氧核苷酸 (Ａ ＳＯＤＮ)及正义寡脱氧核苷酸 (ＳＯＤＮ) ,序列如…     

激光显微切割结合实时荧光聚合酶链反应定量检测肝脏中转化生长因子-β1和-β2的表达

目的 定量检测转化生长因子-β1(TGF-βl)和TGF-β2在大鼠正常肝脏中肝细胞和汇管区间质细胞中的表达水平。方法 激光显微切割技术分离大鼠正常肝脏中的肝细胞和结缔组织细胞，实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术分析TGF-β1和TGF-β的mRNA含量。结果 激光显微切割技术成功地将肝脏结缔组织细胞从肝细胞中分离。TGF-β1的mRNA含量在肝细胞中是TGF-β2的11倍左右，在肝脏汇管区间质细胞中接近TGF-β2的5倍左右。结论 激光捕获显微切割技术结合实时荧光定量PCR技术能够针对性地精确分析不同的和极少量的细胞中基因表达。在肝脏中TGF-β1的合成多于TGF-β2。     

前列腺癌患者尿液中DD3 mRNA检测及临床意义

目的:观察PCa患者尿液中DD3 mRNA的表达,并讨论其临床意义。方法:从48例PCa患者、23例BPH患者和9例健康男性志愿者(对照组)前列腺按摩后初始尿液中分离细胞,采用RT-PCR方法检测其中DD3mRNA的表达情况。结果:BPH和对照组未见DD3 mRNA阳性表达,而PCa患者DD3 mRNA阳性率为81.3%(39/48),两者差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:尿液中DD3 mRNA的检测有望成为早期诊断PCa的一种无创、简单、敏感的方法,也有望成为PCa治疗后监测的一种方法。     

实时荧光定量检测胃癌患者MUC1基因表达及临床意义

目的:检测胃癌患者肿瘤组织及外周血MUC1 mRNA的表达水平,探讨MUC1 mRNA表达的临床意义.方法:利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法检测胃癌组织、正常组织及外周血中MUC1mRNA水平,分析其表达与肿瘤临床病理因素的关系.结果:胃癌患者肿瘤组织及外周血MUC1 mRNA表达水平高于正常对照组(P<0.05),肿瘤组织MUC1 mRNA的检出率与肿瘤的分化程度、淋巴结转移、血行转移及临床分期有关(P<0.05),外周血MUC1 mRNA的检出率与肿瘤的淋巴结转移、血行转移及临床分期有相关(P<0.05).结论:检测胃癌组织及外周血MUC1 mRNA的表达有助于早期发现胃癌及其微转移.     

转化生长因子-β1对人软骨细胞基质金属蛋白酶-1mRNA及其阻滞剂mRNA表达的影响

目的观察转化生长因子-β1(TGF-β1)对人透明软骨细胞基质金属蛋白酶-1(MMP-1)及其阻滞剂T(IMP-1)mRNA表达的作用及相关意义,更好地理解骨关节炎软骨损伤的相关机制。方法TGF-β1作用于传代培养的人软骨细胞12h,浓度分别为1ng/mL、10ngm/L、100ng/mL;上述不同浓度TGF-β1与白介素-1β(IL-1β)10ng/mL组成联合作用组,继续培养12h。应用逆转录PCRR(TP-CR)方法及实时荧光定量方法(FQP-CR),检测TGF-β1及其与IL-1β联合作用于传代培养的人透明软骨细胞MMP-1、TIMP-1mRNA表达的含量。结果正常对照组透明软骨细胞可见MMP-1、TIMP-1mRNA扩增产物,而实验组TGF-β11ng/mL、10ng/mL、100ngm/L作用于透明软骨细胞12h后,MMP-1mRNA表达逐渐降低,TIMP-1mRNA表达逐渐增高;TGF-β1与IL-1β联合作用后,随着TGF-β1浓度的升高,MMP-1mRNA表达逐渐降低,TIMP-1mRNA表达逐渐增高,各组之间差异有显著性意义(P<0.05)。提示TGF-β1与MMP-1、TIMP-1mRNA表达之间存在剂量依赖关系。结论不同浓度TGF-β1按照剂量依赖方式抑制人软骨细胞MMP-1mRNA基因的表达,刺激人软骨细胞TIMP-1mRNA基因表达;TGF-β1具有对抗IL-1β对人软骨细胞MMP-1、TIMP-1mRNA表达的作用,也呈现剂量依赖关系。研究结果对揭示骨关节炎的发病机理,指导其治疗具有积极意义。     

应用巢式RT-PCR联合检测原发性肝癌病人外周血AFPmRNA和MAGE-1mRNA的表达

目的 寻找一种敏感的方法以早期发现原发性肝癌的复发与转移。方法 应用逆转录聚合酶链反应分别在术前、术后1周和术后2个月检测37例行根治性切除的原发性肝癌病人外周血中MAGE-1 mRNA和AFPmRNA的表达，并随访所有病人1年。结果 外周血中MAGE-1 mRNA和AFPmRNA的阳性率和肿瘤的病理分期相关；肿瘤病期越晚，外周血中微转移灶的检出率越高。1年的随访中，有9例病人出现复发，MAGE-1和(或)AFPmRNA的阳性率为77．8％(7／9)，其中6例外周血中MAGE-1mRNA和(或)AFPmRNA持续阳性，2例由阴性转为阳性。另有10例病人MAGE-1mRNA和(或)AFPmRNA由术前阳性术后转为阴性，随访1年中无复发。结论 联合检测外周血MAGE-1和AFPmRNA的表达是早期发现肝癌术后复发、评估预后一项敏感可信的指标。     

Mahoganoid蛋白及其mRNA在大鼠睾丸和附睾中的表达

目的:探讨M ahoganoid(Md)蛋白及其mRNA在成熟大鼠睾丸和附睾组织中的表达。方法:健康成年SD大鼠20只,取睾丸和附睾组织4%多聚甲醛固定,石蜡切片,用免疫组化SP法和原位杂交方法分别检测Md蛋白及其mRNA在睾丸和附睾组织中的表达。结果:免疫组化SP法显示:睾丸组织间质细胞、睾丸生精小管管周肌样细胞和各级生精细胞(精原细胞、初级精母细胞和精子细胞)、支持细胞呈阳性反应,Md蛋白主要表达于胞膜及胞质。在附睾组织,棕色免疫阳性反应物质可见于输出管的高柱状细胞、低柱状细胞的胞膜及胞质,以及附睾管的高柱状细胞、主细胞、基细胞的胞膜及胞质。其中,在附睾尾部的上皮细胞中仅见微弱的棕色免疫阳性反应物质。原位杂交方法显示:睾丸组织间质细胞、睾丸生精小管管周肌样细胞和各级生精细胞(精原细胞、初级精母细胞和精子细胞)、支持细胞上也均有Md mRNA阳性棕色颗粒杂交信号,主要表达于胞膜及胞质。在附睾组织,Md mRNA阳性棕色颗粒杂交信号也均可见于高柱状细胞、主细胞、基细胞的胞膜及胞质。结论:Md蛋白及其mRNA在成熟大鼠睾丸和附睾组织中均有表达,其生理功能尚有待阐明。     

MTA1 m RNA与ki67蛋白在乳腺癌组织中的表达及临床意义

目的：观察MTA1 mRNA与ki67蛋白在乳腺癌组织中的表达,探讨二者与乳腺癌的相关性。方法：应用原位核酸分子杂交检测乳腺癌组织中MTA1 mRNA的水平,应用免疫组织化学技术检测乳腺癌组织中ki67蛋白的表达,分析二者与乳腺癌的相关性。结果：MTA1 mRNA、ki67蛋白在乳腺癌低分化组的表达明显高于高、中分化组（P〈0.01）,淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组（P〈0.01）。MTA1mR-NA、ki67蛋白在c-erbB2阳性组的表达水平高于c-erbB2阴性组（P〈0.01）,MTA1 mRNA、ki67蛋白在ER阳性组的表达水平低于ER阴性组（P〈0.05）。ki67蛋白与MTA1 mRNA的表达呈正相关,r=0.553。结论：MTA1 mRNA和ki67蛋白的表达与乳腺癌的发生、发展密切相关,可以作为判断乳腺癌预后的重要分子标志物。     

正常生育男性成熟精子mRNA的种类和特征

目的:剖析具有正常生育能力男性成熟精子mRNA的种类和丰度。方法:健康并育有后代的成年男性10例,禁欲1周后取精液,上游法优化精子,Trizol试剂提取精子总RNA。混合所有总RNA进行基因表达系列分析(SAGE)。结果:所建SAGE文库共获877个克隆,测序得到21 052个标签,出现两次以上的独特性标签有2 712种。经与SAGEm ap数据库比对,19.7%的独特性标签没有基因匹配,代表新基因;其余能匹配的基因中,67%具有蛋白质结合或核酸结合能力,41%具有催化活性,13%与信号转导有关,与细胞运输、精子结构、转录调节相关者分别达到10%左右。结论:人成熟精子中存在数量庞大、种类繁多的mRNA。     

Osteogenic Protein-1 Stimulates mRNA Levels of BMP-6 and Decreases mRNA Levels of BMP-2 and -4 in Human Osteosarcoma Cells

Bone morphogenetic proteins (BMPs) are novel growth and differentiation factors that act on mesenchymal stem cells to initiate new bone formation in vivo and promote the growth and differentiation of cells in the osteoblastic lineage. In the present study, we examined the effects of recombinant human osteogenic protein-1 (also known as BMP-7) on the expression of related members of the BMP family using SaOS-2 and U2-OS, two human osteosarcoma cell strains. Evaluation of BMP-2, -4, and -6 mRNA expression indicates that OP-1 stimulated the mRNA levels of BMP-6 in both SaOS-2 cells (threefold) and U2-OS cells (fivefold) after 24 hours of treatment, while decreasing the mRNA levels of BMP-4 in SaOS-2 cells (80%) and BMP-2 and BMP-4 in U2-OS cells by 50% and 72%, respectively. BMP-2 mRNA expression, as examined by Northern blot analysis, was below detectable limits in SaOS-2 cultures. These results demonstrate that OP-1 modulates the mRNA expression of related members of the BMP family, suggesting a possible mode of action of OP-1 on the growth and differentiation of cells in the osteoblastic lineage in vitro. Received: 7 May 1996 / Accepted: 24 September 1996     

小鼠单个卵母细胞和早期胚胎中结节性硬化综合征2型基因mRNA定量检测方法的建立

目的:建立在小鼠单个卵母细胞和早期胚胎中结节性硬化综合征2型(TSC2)基因mRNA定量检测的方法。方法:选择外源性内参,采用PCR技术,行微流电泳定量检测单个卵母细胞和早期胚胎中TSC2基因mRNA表达水平。结果:成功建立小鼠单个卵母细胞和早期胚胎中TSC2基因mRNA表达的定量检测方法,并绘制定量标准曲线,相关性好(r=-0.987)。结论:采用PCR技术,行微流电泳定量检测单个小鼠卵母细胞和早期胚胎中TSC2基因mRNA表达的方法可行,为从分子水平评价人类配子与胚胎质量提供了方法学基础。     

病理性瘢痕中p53和cyclin D1的mRNA表达的实验研究

目的　探讨病理性瘢痕中p5 3、cyclinD1的表达及在瘢痕疙瘩与增生性瘢痕中表达的区别,以进一步了解瘢痕疙瘩与增生性瘢痕的形成及发展的机理。方法　手术切取病理性瘢痕标本作为实验组,以普通瘢痕作为对照组,运用RT -PCR方法测定病理性瘢痕中p5 3和cyclinD1的mRNA表达情况。结果　病理性瘢痕中p5 3和cyclinD1的mRNA表达与对照组比较差异有显著意义(P <0 .0 5 ) ;而瘢痕疙瘩中p5 3的mRNA表达明显高于增生性瘢痕,两者比较差异有显著意义(P <0 .0 5 )。结论　病理性瘢痕中p5 3和cyclinD1的异常表达,在病理性瘢痕的形成及发展中起重要作用。