人α防御素融合表达、纯化及生物活性检测

目的:获得大量重组人α防御素(HDα)并检测其活性,为其深入研究提供必要的材料。方法:体外化学合成得到带有羟氨裂解位点编码序列的HDα基因片段,克隆入pBV220-IL-4表达载体构建重组表达载体pBV220-IL-4-HDα。测序正确后将重组质粒转入大肠杆菌DH5α中进行温度诱导表达。经羟氨裂解去除IL-4后,对所得蛋白进行纯化、复性,以SDS-PAGE和生物学活性检测鉴定其特性。结果:经温度诱导后,融合蛋白主要以包涵体的形式表达,表达产物约占菌体总蛋白的20%;羟氨裂解切除IL-4后,所得目的蛋白的纯度约为99.8%。抑菌活性试验和克隆形成试验显示,所得HDα对细菌生长有明显的抑制作用。结论:成功地构建了HDα基因的重组表达质粒,获得稳定表达的工程菌,并建立了复性与纯化技术,为进一步对其进行功能研究与应用奠定了基础。     

人防御素-5基因的克隆和真核表达载体的构建

目的对人防御素5(HD-5)基因进行克隆,构建真核表达载体HD5-pPICZαA。方法从人cDNA文库中PCR扩增HD-5基因片段,用EcoRⅠ和XbaⅠ分别双酶切HD-5基因扩增产物和毕赤酵母表达载体pPICZαA,用T4DNA连接酶连接目的基因片段和pPICZαA,然后转化到E.coli Top10中,Zeocin筛选转化子并进行PCR、酶切和序列鉴定。结果提取阳性克隆的重组质粒,EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后跑电泳获得预期条带;同时重组质粒经序列测定,证实HD-5基因正确插入pPICZαA中,插入位置、方向均正确。结论成功构建人防御素5基因的真核表达载体HD5-pPICZαA,为HD-5蛋白的真核真核表达奠定基础。     

人β防御素4基因原核表达载体的构建及其表达

人β防御素4（Humanpdefensin4，HBB4）是一种具有广谱抗微生物活性的抗菌肽。在人体先天免疫尤其上皮及黏膜防御中起重要作用。本研究用重叠延伸PCR扩增合成HBD4cDNA全长，并克隆人pMD18-T载体，用PCR法扩增HBIM成熟肽mamreHBD4，mHB4）编码序列并克隆入表达载体pGEX-4T-2中，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG）诱导下，表达HBD4与谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferase，GST）的融合多肽。用酶切鉴定、核酸测序、十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳等进行鉴定。结果表明：我们成功合成了HBD4全长编码基因，构建了克隆载体pMD18-T／HBIN和原核表达载体pGEX-4T-2／mHBD4，并在大肠杆菌中成功表达融合蛋白GST—HBD4。     

防御素基因原核表达载体构建及表达

目的：为了获得人防御素多肽，实验构建了防御素基因原核表达载体并使其在大肠杆菌中表达。方法：采用从pUC18载体上回收HNP-1外源基因片段，使其与载体pET30b连接，获得pET30b-HNP-1重组质粒，并在大肠杆菌BL-21(DEB)株中表达。结果：发现人防御素融合蛋白得到表达。结论：人防御素基因(HNP-1)可在大肠杆菌BL21(DE3)株中表达，目的蛋白在菌体内以包涵体形式存在。     

人β-防御素的研究进展

β-防御素是一类富含精氨酸,而且具有特殊结构的小分子阳离子多肽,是过去几十年里寻找新型抗生素的重要发现之一.对人类基因组序列的分析表明,人染色编码体的基因含有多达一百多种的β-防御素,它们是连接固有免疫和适应性免疫的重要因子.β-防御素不但对多种细菌、真菌、病毒等具有直接的杀伤作用,而且还与肿瘤发生、组织修复以及生殖成熟等生理过程密切相关.     

人PDGF-A基因的克隆、表达及表达产物的纯化

目的 克隆血小板衍生的生长因子A链（PDGF-A）的基因，并在大肠杆菌中表达。方法 利用RT-PCR法，从人肝癌细胞系（HHCC）的总RNA中，扩增PDGF-A的全长cDNA，再用PCR法扩增PDGF-A成熟蛋白的全长编码序列，编码序列经测序验证后，克隆入表达载体pGEX-4T-1中，构建PDGF-A的原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白，并进行谷胱甘肽（GST）亲和层析纯化。结果 以RT-PCR扩增的PDGF-A基因的全长为1255bp，以PCR扩增得到其成熟蛋白的编码序列为531bp，构建了PDGF-A基因的原核高效表达载体pGEX-PDGF-A。表达产物主要位于包涵体内，对包涵体蛋白进行变性和复性处理后，利用亲和层析法获得纯化的目的蛋白，结论 成功地扩增到PDGF-A成熟蛋白的编码序列，并在大肠杆菌高效表达，为进一步对PDGF-A功能的研究提供了有利的工具。     

人α-防御素-1(α-HNP-1)基因乳腺定位表达载体的构建及表达

目的:将人α-防御素-1(α-HNP-1)基因与山羊β-乳球蛋白(Beta-Lac-toglobulin,BLG)基因5’调控区序列融合,构建α-HNP-1基因的乳腺定位表达载体并对其进行检测。方法:用PCR方法获得α-HNP-1基因片断并克隆于pMD18-T载体,经DNA测序证实α-HNP-1基因序列无误后,再将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1-HNP-1重组质粒。用PCR方法扩增出BLG基因5’区调控序列并克隆到pcD-NA3.1-HNP-1中,构建乳腺定位表达载体pcDNA3.1-BLG-HNP-1,该载体经脂质体包裹后,经乳腺导管注入妊娠中后期大鼠乳腺中进行表达。结果:经酶切鉴定和DNA测序分析证实重组质粒载体pcDNA3.1-BLG-HNP-1构建正确,经ELISA检测,大鼠乳汁中有α-HNP-1表达,其48h表达量为27.67ng/ml,72h表达量为49.00ng/ml。结论:成功构建了α-HNP-1基因乳腺定位表达载体并最终在乳腺获得一定量表达,说明乳腺导管注入法是一种较理想的评价乳腺特异表达载体的可行性方法。     

人α-防御素-1(α-HNP-1)基因真核表达载体的构建及在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染表达

目的构建人α-防御素-1(α-HNP-1)基因的真核表达载体,并且转染大鼠骨髓间充质干细胞。方法提取人外周血粒细胞中的总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用PCR的方法扩增得到人α-防御素-1(α-HNP-1)的基因片断。将扩增产物连接入pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,蓝白筛选,对PCR及酶切鉴定含有目的片断的克隆进行测序。经测序证实无误后,将获得的pGEM-T-HNP-1重组质粒上的α-HNP-1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)上,构建HNP-1的真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1。将真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1用脂质体法转染原代大鼠骨髓间充质干细胞,用免疫组化法检测α-HNP-1的表达。结果获得预期大小为303bp的RT-PCR产物;经PCR、酶切鉴定和DNA测序分析证实重组质粒载体pcDNA3.1-HNP-1构建正确;免疫组化法显示转染细胞呈阳性反应。结论成功构建HNP-1基因的真核表达载体,并且在大鼠骨髓间充质干细胞中能成功表达。     

人α-防御素HNP1基因在气管上皮细胞转染的表达研究

目的　探讨人α防御素ＨＮＰ１ 基因在气管上皮细胞转染表达的可行性。方法　采用脂质体转染法将ＨＮＰ１ ｃＤＮＡ 重组真核表达质粒ｐＢａｂｅＮｅｏＨＮＰ１ 导入无血清培养的人、兔气管粘膜上皮细胞,利用逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ） 法及免疫组化法,分别在核酸水平及蛋白质水平检测ＨＮＰ１ 的表达。结果　用ＲＴＰＣＲ 在人和兔的转染上皮细胞总ＲＮＡ 提取物中均扩增出１ 条３１９ｂｐ 的ＤＮＡ 片段,与ＨＮＰ１ ｃＤＮＡ 片段大小一致, 而在未转染的上皮细胞总ＲＮＡ 中没有扩增出相应ＤＮＡ片段。免疫组化法检测到转染细胞呈强阳性反应,未转染细胞呈阴性反应,与ＲＴＰＣＲ 法检测的结果一致。结论　实验在ｍ ＲＮＡ 和蛋白质水平上均提示重组真核表达质粒ｐＢａｂｅＮｅｏＨＮＰ１ 转染气管粘膜上皮细胞后,能有效表达ＨＮＰ１ 分子。     

人小肠黏膜防御素5 mRNA的表达特点及意义

目的 检测人小肠黏膜防御素5基因(Alpha defensin 5，DEFA5)的表达，为从分子水平上探讨小肠黏膜抗菌防御机制提供实验依据。方法 从2例新鲜尸体和2例右半结肠癌患者的回肠部位取小肠黏膜提取总RNA，通过RT-PCR扩增出DEFA5的两个外显子序列，比较其个体间的差异；沿小肠轴间隔30cm取新鲜尸体小肠黏膜提取总RNA，仍通过RT-PCR扩增编码HD-5的阅读框序列，比较HD-5沿肠轴的表达趋势。结果 DEFA5在个体间的表达是一致的，通过RT-PCR获得的外显子序列大小为451bp，且碱基序列与GenBank中的DEFA5标准序列相一致；通过PCR获得的编码HD-5的阅读框序列为303bp，其中，酶切位点12bp，保护性碱基6bp，终止子3bp，编码HD-5的序列282bp(94AA)；沿着空肠到回肠的肠轴方向，DEFA5在空回肠黏膜均有表达，至回肠末端最强，并有逐渐增强的趋势。结论 DEFA5基因的表达在个体问是保守的，而且沿着空肠到回肠的肠轴方向在mRNA水平的表达有逐渐增加的趋势，提示HD-5作为天然免疫物质在小肠黏膜屏障功能的维护中起着十分重要的作用。此外，本实验获得的HD-5阅读框序列为进一步重组表达HD-5奠定了基础。     

女性生殖道人Beta-防御素基因的表达

目的 :检测人 β 防御素 (HBDs)基因在女性生殖道各段组织及妊娠相关组织的表达 ,探讨内源性抗菌肽在女性生殖道粘膜天然抵抗致病微生物侵袭机制中的作用。方法 :采用逆转录多聚酶链反应法 (RT PCR)检测正常女性生殖道各段组织及怀孕妇女生殖相关组织中HBD 1、HBD 2的表达情况 ,以 β actin为阳性对照。结果 :细胞株ME 1 80表达HBD 1mRNA ,而不表达HBD 2mRNA ;正常女性阴道、子宫颈、子宫内膜、输卵管、卵巢等 5个组织中均发现有HBD 1mRNA的表达 ,除阴道、卵巢外其余组织也有HBD 2mRNA的表达 ;绒毛膜、绒毛、羊膜、胎…     

人α—防御素HNP1基因在气管上皮细胞传染的表达研究

目的 探讨人α－防御素ＨＮＰ１基因在气管上皮细胞转染表达的可行性。方法 采用脂质体转染法将ＨＮＰ１ ｃＤＮＡ重组真核表达质粒ｐＢａｂｅ－Ｎｅｏ－ＨＮＰ１导入无血清培养的人、兔气管粘膜上皮细胞，利用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）法及免疫组化法，分别在核酸水平及蛋白质水平检测ＨＮＰ１的表达。结果 用ＲＴ－ＰＣＲ在人和兔的转染的上皮细胞总ＲＮＡ提取物中均扩增出１条３１９ｂｐ的ＤＮＡ片段，与ＨＮＰ１ｃ     

人NT-proBNP的克隆及原核表达

目的：克隆人氨基末端脑钠肽（amino—terminal pro—brain natriuretic peptide,NT—proBNP）基因,构建原核表达载体并纯化表达产物。方法：采用PCR从正常成人cDNA中扩增NT—proBNP基因,将其克隆至pGEM—T中,测定其核苷酸序列。然后构建原核表达载体pGXE4T-2-NT-proBNP,用IPTG诱导表达,GSH—agarose亲和纯化蛋白。结果：经PCR扩增获得NT—proBNP基因,测序正确,在大肠杆菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的20％,用SDS—PAGE和Western blot鉴定,显示其相对分子量34600。经亲和纯化后的GST—NT—proBNP的纯度可以达到96％,得率为1．8mg／100ml。结论：NT—proBNP的纯化成功,为建立NT—proBNP检测方法奠定了基础。     

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.     

女性生殖道人Beta-防御素基因的表达

目的 :检测人 β-防御素 (HBDs)基因在女性生殖道各段组织及妊娠相关组织的表达 ,探讨内源性抗菌肽在女性生殖道粘膜天然抵抗致病微生物侵袭机制中的作用。方法 :采用逆转录多聚酶链反应法 (RT -PCR)检测正常女性生殖道各段组织及怀孕妇女生殖相关组织中HBD - 1、HBD - 2的表达情况 ,以 β -actin为阳性对照。 结果 :细胞株ME - 180表达HBD - 1mRNA ,而不表达HBD - 2mRNA ;正常女性阴道、子宫颈、子宫内膜、输卵管、卵巢等 5个组织中均发现有HBD - 1mRNA的表达 ,除阴道、卵巢外其余组织也有HBD - 2mRNA的表达 ;绒毛膜、绒毛…     

乳腺癌相关的乳腺珠蛋白基因的克隆、表达及纯化

目的 克隆人乳腺珠蛋白(hMAM)基因,原核表达重组蛋白并纯化,为建立一种新的乳腺癌诊断方法奠定基础.方法 从人乳腺癌组织中提取总RNA,经RT-PCR合成cDNA,设计特异性的引物,用PCR的方法扩增出目的片段,构建PET-32A-hMAM和PGEX-4T1 -hMAM表达载体,在BL21菌中表达hMAM重组蛋白,纯化,并进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定.结果 经RT-PCR、PCR扩增后得到一条207 bp的DNA片段,构建载体后DNA测序,结果与预期序列一致.表达和纯化的融合蛋白相对分子质量大约为28 000,与预期结果一致.结论 成功克隆hMAM基因,并获得高纯度的hMAM重组蛋白,为进一步开发hMAM诊断试剂打下基础.     

人β-防御素-2基因5′-端转录调控区DNA片段的克隆及序列初步分析

人 β-防御素 (hBD)主要由上皮细胞生成 ,包括hBD - 1、hBD - 2等亚类 ,是皮肤、粘膜免疫的重要分子。其中hBD - 2是富含半胱氨酸阳离子的由 4 1个氨基酸组成的低分子抗菌肽。通常hBD - 2在健康组织中为低水平表达 ,但当皮肤、肺、气道组织有病菌入侵时可诱导hBD - 2的大量表达。对牛气道防御素 (TAP)受LPS刺激诱导表达的转录机制的研究表明NF -κB和NF -IL6共同调控TAP基因的转录。本研究将人 β -防御素 - 2基因上游序列输入Matinspector软件 ,应用Matinspector软件于转录因子数据库 (http ://tansfac gbf de/TRANSFAC)中…     

牦牛中性粒细胞防御素的分离纯化及抗菌活性

目的:分离牦牛中性粒细胞(PMN)防御素并检测其抗菌活性.方法:运用Percoll密度梯度离心法,从新鲜牦牛全血中分离纯化牦牛中性粒细胞,用50 mL/L冰乙酸抽提,提取液经Bio-Gel P-10聚丙烯酰胺凝胶过滤和反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化,对活性多肽进行质谱分析,并对其中3个肽进行氨基酸组成分析,用琼脂弥散法检测三种多肽的抗菌活性.结果:获得13种活性多肽,其中三个肽为牦牛中性粒细胞防御素1～3,并具有很强的抗菌活性.结论:PMN存在防御素并具有广谱抗菌活性,在天然免疫中发挥着重要作用.     

抗人β防御素3融合蛋白抗体的制备及其活性检测

目的：人抗菌肽β防御素3（HBD3）除具有杀灭多种病原菌的作用外，还参与机体免疫防御的多个过程，本实验的目的是进一步了解HBD3在人体的生物功能。方法：通过将编码HBD3成熟链的基因与载体pGEX—KG相连，表达出谷胱甘肽s转移酶与HBD3（GST—HBD3）的融合蛋白，制备HBD3的抗体。结果：通过Western blot检测及免疫组化方法证实HBD3抗体的制备成功，显示了HBD3蛋白在食道上皮细胞的表达部位。结论：为进一步了解HBD3在人体的功能及其在疾病状态下的改变奠定了坚实的基础。     

人DcR3融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的:制备DcR3融合蛋白及其多克隆抗体,并鉴定其特异性。方法:将亚克隆构建的pET28a( )/DcR3重组表达质粒转化入大肠杆菌(E.coli)BL21菌株,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western blot分析蛋白产物,将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定。结果:pET28a( )/DcR3重组表达质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为33000的目的蛋白,表达量约占菌体蛋白总量的38%,纯化后的目的蛋白纯度达98%。Western blot显示纯化蛋白与抗DcR3单克隆抗体(mAb)具有良好的反应性。纯化后多克隆抗体效价达1.28×10-6。结论:DcR3蛋白在E.coli中得到高效表达,成功制备高纯度DcR3蛋白及高效价抗DcR3多克隆抗体,为研究DcR3在组织中的表达、分布,研制ELISA试剂盒以检测恶性肿瘤及自身免疫性疾病等患者血清DcR3表达水平提供实验基础。