rAd-ODC/Ex3as对前列腺癌PC-3细胞抑制作用的研究

目的:探讨重组腺病毒rAd鄄ODC/Ex3as对前列腺癌细胞的体外抑制作用及对前列腺癌的作用机制。方法:利用报告基因GFP测定病毒感染效率,用WesternBlot检测rAd鄄ODC/Ex3as是否抑制鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因的表达,采用MTT法、Matrigeal侵袭实验观察rAd鄄ODC/Ex3as对前列腺癌细胞PC鄄3恶性表型的影响,并用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。结果:当MOI为50时,腺病毒感染PC鄄3细胞的效率约为70%,WesternBlot证实rAd鄄ODC/Ex3as可抑制ODC基因的表达。rAd鄄ODC/Ex3as以20MOI感染PC鄄3细胞可明显抑制其生长增殖和侵袭性穴P<0.01雪,流式细胞仪检测结果证实rAd鄄ODC/Ex3as可引起PC鄄3细胞G1期阻滞,但并未引起凋亡。结论:rAd鄄ODC/Ex3as在体外能有效地干扰ODC基因的表达,并可抑制前列腺癌细胞PC鄄3的生长与侵袭,诱导其发生G1期阻滞,有望成为治疗前列腺癌的基因药物。     

小肠隐窝细胞株药理实验方法的建立

目的：建立小肠隐窝细胞株（IEC-6）药理实验方法。方法：观察细胞接种密度、α-二氟甲基鸟氨酸（DFMO）和胃泌素对IEC-6细胞增殖及细胞鸟氨酸脱羧酶（ODC）的影响。结果：较高接种密度（〉0.5×10^4细胞/孔）组,接种后第2天,细胞生长抑制,尤其是密度增加到4×104细胞/孔时,第2~3天,OD值逐渐增加,第4天明显增加,第5天达高峰,此后OD值开始下降。而低密度（0.2×10^4细胞/孔）接种后第4天,细胞生长出现抑制,此后其生长与其他密度相似。加入DFMO后1~3天,完全抑制了细胞增殖,此后与空白组一样,细胞逐渐生长。DFMO还明显抑制IEC-6细胞分化和移行,以及ODC活性和腐胺含量,与空白组比较具有显著性差异（P〈0.01）。IEC-6细胞在胃泌素250μg·L^-1作用后第一天,开始增殖,第3天达高峰。胃泌素500μg·L^-1作用后第1~2天,细胞开始增殖,第3天以后,细胞增殖下降。胃泌素明显促进细胞分化和移行。与空白组比较,胃泌素250μg·L^-1分别使ODC m RNA水平,ODC活性,腐胺含量增加1.09倍（P〈0.05）,1.71倍（P〈0.01）和5.30倍（P〈0.01）。同样,胃泌素500μg·L^-1可使以上3项指标分别升高1.16倍（P〈0.05）,1.63倍（P〈0.05）和4.41倍（P〈0.01）。但胃泌素两个剂量组之间无显著性差异。结论：IEC-6细胞是进行胃肠粘膜修复药理实验的合适细胞模型。     

鸟氨酸脱羧酶基因沉默对子宫内膜癌细胞Ishikawa的影响

目的利用RNA干扰技术,观察鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase,ODC）基因在子宫内膜癌Ishikawa细胞的沉默效应及对Ishikawa细胞增殖周期的影响。方法设计合成以鸟氨酸脱羧酶基因为靶向目标的siRNA序列质粒,利用脂质体介导的方法将质粒转染至子宫内膜癌Ishikawa细胞,实验分三组：Ishikawa组,pSUPER-EGFP组,pSUPER-EGFP-ODC组。用Real-time PCR和Western blot检测ODC的表达情况。采用MTT和流式细胞术来检测ODC基因沉默对Ishikawa细胞生长的影响。结果 Real-time PCR和Western显示pSUPER-EGFP-ODC组细胞ODC mRNA和蛋白质表达水平明显下降。MTT示pSUPER-EGFP-ODC能显著抑制Ishikawa细胞的增殖活性,与Ishikawa相比,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。流式细胞术结果示pSUPER-EGFP-ODC能显著阻滞Ishikawa细胞于G0/G1期,S期细胞数相应减少,并诱导细胞凋亡,与Ishikawa相比,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。结论转染靶向ODC基因的siRNA序列质粒能够下调ODC基因的表达,抑制人子宫内膜癌细胞Ishikawa在体外的增殖,阻滞Ishikawa细胞于G0/G1期并诱导细胞凋亡。     

抗多胺代谢与HL-60细胞c-myc、c-fos、c-Ha-ras及ODC基因的表达

用核酸分子杂交技术研究多胺生物合成限速酶L-鸟氨酸脱羧酶(ODC)的不可逆抑制剂—二氟甲基鸟氨酸(DFMO)对HL-60细胞c-myc、c-fos、c-Ha-ras癌基因及ODC基因表达的影响。结果表明DFMO处理的HL-60细胞中,c-myc癌基因表达减少,c-fos基因表达水平上升,而DFMO对ODC基因表达无明显影响。此外,本文证实了加入外源性腐胺能阻止DFMO引起的上述变化,表明DFMO对HL-60细胞基因表达的影响是其抑制细胞内多胺生物合成所致。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对胃癌细胞端粒酶活性的抑制作用

目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对SGC－7901胃癌细胞端粒酶活性的影响。方法 用不同浓度的EGCG处理7901细胞,采用MTT法和PCR－ELISA法测定增殖抑制率和端料酶活性,用RT－PCR法测定端粒酶亚单位hTR、TP1、hEST2／hTRT和c-myc cRNA的表达。结果 EGCG在100μmol／L以下浓度对7901细胞增殖无明显抑制作用,而在200μmol/L以上浓度时对7901细胞增殖有明显的抑制作用,其24h和48hIC50分别为27．4μmol／L和19．5μmol／L。EGCG处理7901处理7901细胞能显著抑制其hEST2／hTRT和c-mycmRNA表达,且抑制程度与EGCG剂量有关,但对hTRRNA和TP1mRNA表达无明显影响。结论 EGCG在非细胞毒性剂量时就能有效地抑制肿瘤细胞的端粒酶活性,此可能是其防癌抗癌的机制之一。     

金雀异黄素对缺氧诱导的人ARPE-19细胞VEGF表达的抑制作用

目的:研究长期缺氧对体外培养的人ARPE鄄19细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的诱导作用,以及金雀异黄素(genistein,Gen)对其表达的影响初步研究。方法:使用半定量RT鄄PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测ARPE鄄19细胞中VEGFmRNA和蛋白的表达,分析不同浓度Gen以及PD98059、TyrphostinA25对ARPE鄄19细胞缺氧24h诱导的VEGF表达的影响。结果:①正常对照组有少量VEGF表达,缺氧24h可明显提高ARPE鄄19细胞VEGFmRNA和蛋白的表达,分别为9.566±1.528和2.636±0.499倍;②Gen可明显抑制缺氧诱导ARPE鄄19细胞中VEGFmRNA和蛋白的表达,且呈浓度依赖性(P<0.05);③PD98059、TyrphostinA25也可抑制低氧诱导的VEGF的产生,但抑制作用没有Gen(200μmol/L组)明显。结论:Gen可抑制长期缺氧诱导的ARPE鄄19细胞VEGF表达,并可能是通过抑制p42/p44MAPK途径和HIF鄄1途径共同抑制VEGF的产生,提示Gen对视网膜新生血管的形成具有预防和潜在的临床治疗价值。     

二氟甲基鸟氨酸对人肺癌细胞L78细胞生长抑制、凋亡诱导及相关基因的表达调控

目的：研究二氟甲基鸟氨酸(DFMO)对人肺癌细胞L78生长及相关基因表达的影响。方法：应用细胞生长曲线、端粒酶活性、细胞形态及DNA电泳观察细胞生长速率及细胞凋亡情况，同时应用Northern blot及免疫组化技术检测相关基因的表达。结果：(1)DFMO处理的L78细胞与对照组相比生长受到抑制，同时，诱导细胞凋亡增多。(2)在DFMO作用下，L78细胞df4基因被诱导表达，同时伴有P21^ras表达下调，Fas基因表达的上调。结论：DFMO抑制L78细胞生长，诱导凋亡的作用与其对df4基因的诱导密切相关，DFMO通过对df4的诱导．调控P21^ras和Fas的表达．     

二氟甲基鸟氨酸对人肺癌细胞生长特性的影响及其相关基因ALT-04ag表达调控

目的研究抑制多胺生物合成对人肺癌细胞生长特性的影响及该影响与肺癌相关基因ALT-04ag表达调控的关系。方法以细胞形态观察、生长曲线、流式细胞分析、DNA电泳图谱等方法,研究鸟氨酸脱羧酶(ODC)不可逆抑制剂二氟甲基鸟氨酸(DFMO)对人肺鳞癌细胞L78生长特性的影响;根据人肺癌相关抗原ALT-04ag基因片段序列设计引物进行RT-PCR及用抗相关抗原单抗ALT-04进行免疫组化,分别检测ALT-04ag相关基因的mRNA及蛋白表达。结果5mmol/LDFMO作用人肺鳞癌细胞L785d,引起ALT-04ag基因mRNA和蛋白表达下调,并能明显抑制细胞生长、诱导细胞凋亡。同时加入外源性腐胺(Pu)可阻止上述基因及细胞形态的变化。结论抑制多胺生物合成引起的L78细胞生长抑制和细胞凋亡的诱导与肺癌相关抗原基因表达的下调有关。     

老年人肺癌组织中鸟氨酸脱羧酶基因表达及其临床意义

目的：从mRNA和蛋白质水平探讨ODC基因表达和老年人肺癌的关系，为肺癌基因诊断和基因治疗的研究提供理论依据。方法：分别应用RT PCR和免疫组化方法检测42例老年人肺癌组织和癌旁正常肺组织中ODC mRNA和ODC蛋白的表达，应用Western Blot检测肺癌组织中ODC表达，同时用MTT法观察不同转染组肿瘤细胞的增殖状况，探讨上述指标与肺癌临床病理学特性的关系。结果：RT PCR显示，老年人肺癌组织中ODC mRNA表达明显高于癌旁正常肺组织（P＜0.05），不同类型和分化程度肺癌组织中ODC mRNA水平差异无统计学意义（P＞0.05），Ⅲ期肺癌组织中ODC mRNA表达明显高于Ⅰ期+Ⅱ期（P＜0.05）；免疫组化显示，肺癌组织中ODC蛋白表达明显高于癌旁正常肺组织(P＜0.05);不同病理类型和分化程度肺癌组织中ODC蛋白表达未见明显差异（P＞0.05），Ⅲ期肺癌组织中ODC蛋白表达较Ⅰ期+Ⅱ期明显升高（P＜0.05）；Western Blot显示，肺癌组织中ODC蛋白表达明显高于癌旁正常肺组织；MTT法观察生长曲线检测数据表明，ODC的反义RNA表达载体转染组细胞的增殖明显比对照组细胞和空载体转染组细胞缓慢。结论：ODC表达增强与老年人肺癌发生、发展、浸润及转移有关，可作为判断肺癌生物学行为的参考指标; ODC的反义RNA表达载体对A 549肺癌细胞株的生长具有一定的抑制作用。     

二苯乙烯苷通过降低钙调神经磷酸酶的活性抑制心肌成纤维细胞的增殖

目的:研究二苯乙烯苷(2,3,4’,5-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG)对精氨酸加压素(argininevasopressin,AVP)引起的心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖的抑制作用及其相关信号通路。方法:采用MTT法观察TSG对AVP引起的CFs增殖的抑制作用。定磷法检测细胞内钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)的活性,WesternBlot测定其蛋白表达。结果:30μmol/L、100μmol/L的TSG明显抑制100 nmol/L AVP引起的CFs的增殖(P<0.01),而3μmol/L、10μmol/L的TSG则对CFs的增殖无明显影响。CaN的活性在100 nmol/L AVP刺激30 min后达到最高(P<0.05),而30μmol/L TSG能抑制CaN活性的增高(P<0.05);CaN蛋白水平在AVP刺激48 h后明显升高(P<0.05),而这种升高作用能被30μmol/L TSG抑制(P<0.05)。结论:TSG可以抑制AVP诱导的CFs的增殖。TSG可能是通过减少CaN活化和蛋白表达抑制CFs的增殖。     

ODC反义寡核苷酸对K562细胞凋亡及分化和相关基因表达的影响

目的：观察鸟氨酸脱羧酶反义寡核苷酸（ＯＤＣａｓＯＤＮ）引起鸟氨酸脱羧酶（ＯＤＣ）表达及活性的抑制对人红白血病Ｋ５６２细胞生长、凋亡的影响,为探索抑制多胺生物合成的抗癌新途径提供实验依据。方法：采用硫代修饰的ＯＤＣａｓＯＤＮ处理细胞,观察生长曲线,及用Ｇｉｅｍｓａ染色观察形态变化,ＲＮＡ斑点杂交检测基因表达,放射微量法测定ＯＤＣ活性。结果：ＯＤＣａｓＯＤＮ能抑制Ｋ５６２细胞生长、诱导凋亡,并证明了该细胞的ＯＤＣ、Ｂｃｌ２表达下降及ＯＤＣ活性受到抑制。结论：ＯＤＣａｓＯＤＮ能下调ＯＤＣ表达、降低其酶活性,引起ｂｃｌ２基因表达抑制,导致Ｋ５６２细胞生长抑制及凋亡诱导。     

腺病毒介导的鸟氨酸脱羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶双反义RNA抑制肺癌A-549细胞的实验研究

目的：探讨鸟氨酸脱羧酶（ODC）和S－腺苷甲硫氨酸脱羧酶（AdoMetDC）双反义重组腺病毒（Ad-ODC-AdoMetDCas）介导的ODC和AdoMetDC反义RNA对肺癌A 549细胞增殖和侵袭的抑制作用。方法：采用FACS检测Ad-GFP感染细胞中GFP表达,以测定不同MOI的腺病毒对肺癌A-549细胞的基因转染效率;应用MTT法观察Ad-ODC-AdoMetDCas对肺癌A-549细胞生长增殖的影响;采用Western印迹和HPLC的方法分别检测腺病毒对肺癌A-549细胞中ODC和AdoMetDC蛋白表达以及胞内多胺含量的抑制作用,并应用TUNEL标记检测法观察Ad-ODC-AdoMetDCas对肺癌细胞凋亡的影响。结果：基因转染效率结果显示,以50 MOI的Ad-GFP感染肺癌细胞48h后,大约有75% 肺癌A-549细胞GFP表达阳性;Ad-ODC-AdoMetDCas对肺癌A-549细胞生长增殖有明显抑制作用。Ad-ODC-AdoMetDCas可明显抑制肺癌细胞中ODC和AdoMetDC基因表达 ,基因抑制率大于60％（P＜0.05）。HPLC结果显示,肺癌A-549细胞感染Ad-ODC-AdoMetDCas后,细胞内三种多胺含量都明显降低（P＜0.05）。TUNEL标记检测结果证实,Ad-ODC-AdoMetDCas可引起肺癌A-549细胞明显凋亡。结论：ODC和AdoMetDC双反义腺病毒具有显著抑制肺癌增殖和侵袭的作用,对于肺癌的防治研究具有一定的意义,有望成为治疗肺癌的基因药物。     

高表达OAZI-1增加小鼠黑素瘤B16-F1细胞对多胺类似物CPENSpm的敏感性

目的检测高表达OAZI-1的小鼠黑素瘤B16-F1细胞对抗癌药物多胺类似物CPENSpm敏感性的影响并探讨其作用机制。方法高表达OAZI-1的B16-F1细胞经CPENSpm处理后,MTT法检测细胞增殖;QT-RT-PCR检测细胞内OAZI-1、ODC和OAZ的mRNA表达水平;反相高效液相色谱法检测细胞内多胺含量;化学发光法分析细胞内SMO酶活性。结果高表达OAZI-1显著增加B16-F1细胞对CPENSpm的敏感性,QT-RT-PCR结果显示,OAZI-1高表达增加ODCmRNA但降低OAZ mRNA水平,CPENSpm处理对ODC和OAZ的mRNA水平无进一步影响。与对照细胞相比,CPENSpm处理能更显著性地降低OAZI-1高表达细胞中的多胺含量,同时更强地诱导SMO酶的活性。结论 CPENSpm处理能在更大程度上耗竭OAZI-1高表达的B16-F1细胞中的多胺,由此对该肿瘤细胞显示出更大的细胞毒性。     

塞来昔布与茶多酚合用对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响

目的：研究塞来昔布与茶多酚合用对三阴乳腺癌MDA—MB-231细胞增殖及凋亡的影响。方法：MTT比色法检测塞来昔布、茶多酚单药及两者联合用药对乳腺癌MDA—MB-231细胞增殖的影响。Hoechst33258荧光染色观察细胞形态学改变。流式细胞术Annexin V—FITC／PI双染检测细胞凋亡率。结果：MTT结果显示塞来昔布（10umol／L）与不同浓度茶多酚（6．25、12．5、25、50、100ug／mL）单用及合用均对MDA—MB-231细胞产生增殖抑制作用,且联合用药组的抑制率高于各单用组,差异具有统计学意义（P〈0.05）。Hoechst33258荧光染色结果显示塞来昔布（10umol／L）与茶多酚（50、100ug／mL）合用组的凋亡细胞较单用组明显增加,出现典型凋亡形态学特征。流式细胞术进一步证明两药合用使凋亡率显著增加。结论：塞来昔布与茶多酚合用具有显著抑制三阴乳腺癌MDA—MB-231细胞增殖,诱导细胞凋亡的作用。     

茶多酚对人脐静脉内皮细胞增殖作用的研究

目的探讨茶多酚（TP）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）生长增殖的影响。方法采用二因素3×5析因设计及噻唑兰（MTT）比色法检测不同作用时间及剂量的仲对HUVEC的生长增殖作用，采用倒置相差显微镜观察HUVEC形态的变化。结果在24h时间段，120，160,240mg／L组，在48，72h时间段，80、120、160、240mg／L组与对照组吸光度有显著性差异。24，48，72h的半数抑制浓度分别是184．41，127．70，108．98mg／L。且TP作用时间与剂量之间有交互作用。结论TP能抑制HUVEC增殖且具有量效一时效依赖关系。     

ODC反义RNA对人肺鳞癌细胞c—myc及c—Ha—ras基因表达的影响

目的：探讨鸟氨酸脱羧酶（ＯＤＣ）反义ＲＮＡ逆转人肺鳞癌细胞ＬＴＥＰ７８（Ｌ７８）恶性表型的分子机理。方法：核酸杂交，免疫细胞化学染色等。结果：在ＯＤＣ反义基因稳定整合、ＯＤＣ反义ＲＮＡ高效表达的转染细胞株中，ｃｍｙｃ及ｃＨａｒａｓｍＲＮＡ的表达比Ｌ７８亲本细胞显著下降；ｒａｓＰ２１蛋白的表达也受到明显抑制。结论：ＯＤＣ反义ＲＮＡ引起细胞内多胺耗竭，对ｃｍｙｃ及ｃＨａｒａｓ基因表达有明显的下调作用，这可能是其逆转人肺鳞癌细胞恶性表型的重要机制之一。     

磁性附着体中铁素体不锈钢引起小鼠成纤维细胞L929凋亡的研究

目的：研究磁性附着体中铁素体不锈钢材料引起的小鼠成纤维细胞L929凋亡情况，初步检测其生物相容性。方法：应用不同浓度的铁素体不锈钢材料浸提液处理L929细胞，流式细胞仪检测其凋亡率及细胞周期分期，透射电镜观察其凋亡形态。结果：随着浓度的增加，铁素体不锈钢材料引起的细胞凋亡率增加，但对细胞周期无特异性影响。结论：铁素体不锈钢材料符合临床应用的生物相容性要求，可应用于新型磁性附着体之中。     

全反式维甲酸对小鼠黑色素瘤B16F10细胞生物学行为的影响

目的 探讨全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)对小鼠黑色素瘤B16F10细胞体外增殖、迁移、凋亡、致瘤性的影响及其初步作用机制.方法 采用MTT法检测ATRA对小鼠黑色素瘤细胞B16F10和小鼠成纤维细胞L929增殖能力的影响.显微镜下观察给药后两种细胞的形态变化,应用划痕实验和Transwell实验检测ATRA对B16F10细胞迁移能力的影响,分别采用DAPI染色和Annexin V-FITC/PI染色观察B16F10细胞凋亡情况,JC-1染色实验检测B16F10细胞线粒体膜电位,荧光分光光度计检测B16F10细胞中Caspase-9、Caspase-3的活化情况,利用体内成瘤实验观察ATRA对B16F10细胞致瘤性的影响.结果 MTT结果显示ATRA呈浓度依赖性地抑制B16F10细胞和L929细胞增殖,但B16F10细胞的存活率明显低于L929细胞的存活率(P＜0.05);分别以低、中、高3个浓度(6.25、16、40 μmol/L)的ATRA处理细胞24 h后,显微镜下可见B16F10细胞在中浓度时呈凋亡样改变,高浓度时细胞基本死亡,丧失正常形态;而L929细胞形态仅在高浓度时发生显著变化;划痕实验和Transwell实验提示B16F10细胞的体外迁移能力在中浓度即受到明显抑制(P＜0.05);继续以中浓度(16 μmol/L)的ATRA作用B16F10细胞24 h,DAPI染色可见细胞核裂解,甚至可见凋亡小体;AnnexinV-FITC/PI染色结合流式细胞仪测得细胞凋亡率为(37.27±4.42)％;JC-1染色实验提示线粒体膜电位明显降低;荧光分光光度计测得给药后Caspase-9、Caspase-3显著被活化,活性分别增加了(1.54±0.00)、(3.09 ±0.01)倍(P＜0.05);成瘤实验结果显示ATRA处理后的B16F10细胞致瘤性显著降低(P＜0.01),甚至消失.结论 ATRA能显著抑制B16F10细胞体外增殖、迁移能力,并能通过降低线粒体膜电位,活化Caspase-9、Caspase-3蛋白诱导细胞凋亡,进而抑制B16F10致瘤性.     

猪皮活性小肽对L929细胞增殖的研究

目的 通过大孔吸附树脂DA201-C对猪皮活性小肽溶液的精制分离,研究猪皮活性小肽不同洗脱部位对小鼠成纤维细胞(简称L929细胞)增殖作用的影响.方法 采用仿生酶解法得到猪皮活性小肽溶液;采用超滤法得到分子量<3KDa的猪皮活性小肽超滤液;以大孔吸附树脂DA201-C对猪皮活性小肽超滤液进行分离纯化;以体外培养L929细胞为研究对象,探究猪皮活性小肽不同洗脱部位对L929细胞增殖的作用,用MTT比色法检测细胞增殖活性.结果 猪皮活性小肽不同洗脱部位对L929细胞均具有极显著的增殖作用,其中水洗脱组的活性最强.结论 猪皮活性小肽对L929细胞具有显著的增殖作用,可作为活性原料在皮肤创伤等领域广泛应用.