PCR检测在真菌性角膜溃疡中的诊断价值

目的探讨聚合酶链反应(PCR)快速检测在真菌性角膜溃疡诊断中的价值。方法以源于医学条件致病性真菌18srRNA基因保守区的一对寡核苷酸序列为通用引物,对临床拟诊为真菌性角膜溃疡的36例标本进行PCR检测,并与培养方法进行对比。结果在400bp处出现DNA扩增带者为阳性。36份临床标本的真菌培养阳性率为58.3%,而经PCR扩增阳性率为86.1%,PCR扩增准确性为72.2%,敏感性为100.0%,特异性为33.3%。结论真菌通用引物进行PCR反应检测真菌性角膜溃疡速度快、阳性率高,有助于真菌性角膜溃疡的快速诊断。     

真菌性角膜溃疡的PCR检测

目的 探讨临床拟诊为真菌性角膜溃疡聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)快速检测的方法.方法 以源于医学条件致病性真菌18s rRNA基因保守区的一对寡核苷酸序列为通用引物,对临床拟诊为真菌性角膜溃疡的38例标本进行PCR检测,并与培养方法进行对比.结果 在687 bp处出现DNA扩增带者为阳性.38例临床标本的真菌培养阳性率为60.53%,而经PCR扩增阳性率为81.58%,明显高于真菌培养法(P＜0.05).结论 真菌通用引物进行PCR反应检测真菌性角膜溃疡速度快、阳性率高,有助于真菌性角膜溃疡的快速诊断.     

多重聚合酶链反应在感染性角膜炎诊断中的应用价值

[目的]探讨多重聚合酶链反应(MPCR)在感染性角膜炎诊断中的应用价值.[方法]选择角膜炎患者59例,其中细菌感染性角膜炎29例、真菌感染性角膜炎16例、单纯疱疹病毒(HSV)感染性角膜炎14例;另选择正常眼20例作为对照组.提取所有受试者角膜上皮和或结膜囊分泌物中的DNA进行MPCR扩增,扩增片段有520bp(细菌),310bp(真菌),179bp(病毒).利用凝胶成像分析系统对结果进行观察分析,并与传统微生物培养法进行比较.[结果]细菌感染性角膜炎组中MPCR扩增出520bp的有20例,同时扩增出520bp和310bp的有1例,阳性率为72.4%,细菌微生物培养结果阳性率为72.4%(χ2=0.000,P>0.05).真菌感染性角膜炎组中MPCR扩增出310 bp的有8例,同时扩增出520bp和真菌310 bp的有1例,阳性率为56.3%,真菌微生物培养结果阳性率为43.8%(χ2=0.29,P>0.05).细菌、真菌、HSV感染性角膜炎组MPCR阳性检测率均明显高于正常对照组(P<0.001).真菌、细菌、HSV感染的角膜炎患者用MPCR扩增出相应病原体的例数为35例,相符率为59.3%,两组间差异有统计学意义(χ2=31.72,P<0.001).[结论]MPCR是诊断和鉴别诊断感染性角膜炎的有效方法.     

真菌通用引物PCR反应鉴别兔眼真菌性和细菌性角膜溃疡

目的 利用真菌通用引物PCR反应，鉴别兔眼真菌性和细菌性角膜溃疡。方法 根据临床上常见的致病细菌菌株(金葡菌、绿脓菌)，真菌菌株(烟曲霉菌、白念菌、镰刀菌)，制作兔眼角膜溃疡的动物模型，选取一对真菌通用引物，一对寡核苷酸引物B2F(5'ACTITCGTAGGATAG-3')和B4R(5'-TGATCGtcttccataaata-3')，对标本进行聚合酶链反应。结果 在687bp处出现DNA扩增带者为阳性。造模后第3d真菌组出现扩增带阳性的90％，第5d真菌组出现扩增带阳性的96．6％。细菌组始终未出现阳性结果。结论 真菌通用引物PCR反应检测鉴别真菌性与细菌性角膜溃疡有较好的敏感性和特异性。     

聚合酶链反应检测铜绿假单胞菌感染性角膜溃疡的实验研究及临床应用

目的：探索聚合酶链反应（PCR）技术对铜绿假单胞菌感染性角膜溃疡快速诊断的可行性。优越性及其在临床应用中的价值。方法：建立PCR检测标准铜绿假单胞菌方法，对兔铜绿假单胞菌感染性角膜溃疡模型研究并应用于临床，并与细菌培养做比较。结果：铜绿假单胞菌扩增出一条长504bp的阳性条带，其他常见细菌，人和兔正常角膜组织均为阴性，动物模型PCR敏感性为93.8%。特异性为100.0%；细菌培养敏感性为68.7%。特异性为93.7%。临床标本PCR阳性率为66.7%；细菌培养阳性率为38.1%。结论：PCR技术对快速检测实验室和临床标本中的铜绿假单胞菌具有重要的应用价值。     

病原性真菌PCR检测方法的建立

目的：建立一种快速、灵敏和特异的病原性真菌的检测方法。方法：选取真菌18S rRNA保守区的一对寡核苷酸序列作为通用引物,对10种真菌、3种常见细菌及80例临床标本进行PCR扩增。结果：所试10种真菌均能扩增出一条约400bp的DNA片段,而3种细菌则无此扩增条带。通过对80例临床标本的检测,证实PCR法和常规培养法结果基本一致。此外,对白色念珠菌检测的最低限为10pg的DNA。结论：PCR方法检测临床常见真菌有较高的灵敏性与特异性,有助于临床真菌感染性疾病的诊断与治疗。     

聚合酶链反应检测无菌性体液中真菌

目的：评价聚合酶链反应（PCR）直接检测无菌性体液中真菌结果可靠性。方法：采用真菌通用引物，通过PCR对96份临床无菌性体液扩增菌DNA，同时对这些标本进行细菌、真菌培养。结果：PCR诊断无菌性体液真菌感染与培养法完全一致，培养出细菌的标本PCR检测真菌PCR检测真菌DNA均阴性。结论：PCR直接检测无菌性体液中真菌敏感、特异、快速、准确，但不能代替培养法。     

单疱病毒性角膜炎的PCR诊断

应用聚合酶链反应（PCR）技术对临床诊断活动期单纯疱疹病毒性角膜炎（HSK）30眼，匐行性角膜溃疡5眼，原因未明角膜炎3眼进行SHV-1DNA检测，选择HSV的胸苷激酶（TK）基因为目的基因，扩增片段为110bp.PCR法检测同时将上述标本进行组织培养。30眼活动期HSK角膜上皮标本28眼检出HSV-IDNA，组织培养阳性9眼；5眼匐性角膜溃疡全部未测出HSV-IDNA；3眼原因未明角膜炎中检出HSV-IDNA，组织培养均为阴性。结果表明：PCR法可用于HSK的病原学诊断，其特异性强，灵敏度高，适宜临床标本的快速检测，尤其对于临床没有典型病变，角膜炎不能定性者价值更高．     

DNA探针杂交快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌

目的 建立一种早期快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的分子生物学方法。方法 采用聚合酶链反应（PCR）合成肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异的DNA探针和细菌16S rRNA的通用探针，并用生物素标记DNA探针，分别与细菌、病毒和真菌DNA杂交。并将该方法评价临床样本的检测。结果 聚合酶链反应分别扩增出263、351、370bp三种DNA探针，肺炎链球菌和流感嗜血杆菌只与其对应的探针杂交，细菌通用探针和病毒、真菌间无交叉反应。该法可检测出1ng细菌DNA，100份痰标本利用该方法检测出11份肺炎链球菌和8份流感嗜血杆菌，其阳性率高于痰培养。结论 该方法简便、快速、特异，具有较高的应用价值．可应用于临床检测。     

PCR检测人巨细胞病毒感染的研究

目的：建立快速简便的聚合酶链反应(PCR)方法检测入巨细胞病毒(HCMV—DNA)。方法：根据国外文献报道的HCMV基因序列,利用计算机辅助设计并选出一对寡核苷酸引物,扩增片段为370hp。结果：在370bp处出现DNA扩增带者为HCMV—DNA阳性。结论：PCR技术检测HCMV—DNA敏感、特异,有望应用于临床作为HCMV感染的早期诊断方法。     

双引物聚合酶链反应同时快速检测梅毒螺旋体和单纯疱疹病毒Ⅱ型

目的 建立双引物聚舍酶链反应（PCR）用于同时快速检测梅毒螺旋体和单纯疱疹病毒Ⅱ型。方法 基于单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）的DNA聚合酶基因以及梅毒螺旋体47KD膜蛋白基因序列，自行设计2对特异性寡核苷酸引物，建立了同时检测上速2种痛原体的双引物PCR。结果 各特异性引物仅扩增相应的病原体DNA，即单纯疱疹病毒Ⅱ型扩增产物为202bp以及梅毒螺旋体扩增产物为252bp。其他11种生殖道常见微生物及正常人基因组DNA不被扩增。检测了51例临床标本，梅毒螺旋体暗视野显微镜检查阳性检出率为15．7％，双引物PCR阳性检出率为19．6％；二种方法检测结果间比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。HSV阳性培养率23．6％，双引物PCR阳性率47．1％，双引物PCR阳性检出率显著高于HSV培养且差异有统计学意义（P=0．019）；上速临床标本分别进行了2种痛原体的单引物PCR，与双引物PCR对照结果完全一致。结论 我们建立的双引物PCR一次可同时检测2种病原体，且有快速、敏感、特异以及简便的特点。     

PCR与RFLP相结合检测全血中真菌感染的研究

目的建立从临床可疑真菌感染的全血标本中检测常见真菌基因的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）检测方法。方法采用PCR-RFLP检测方法检测临床可疑真菌感染的全血标本。提取DNA,用真菌的通用引物ITS1-ITS4扩增真菌ITS1-5.8SrDNA-ITS2区域,并对扩增产物进行MspI酶切分析鉴定,检测是否有真菌感染,并将真菌定位到种。应用此方法鉴定了100例临床可疑真菌感染全血标本,并与传统血培养方法进行对比。结果 100例疑似标本的真菌培养阳性率为26%,而经PCR扩增阳性率为31%。结论 PCR-RFLP检测全血中真菌基因具有快速、敏感性、特异性,有助于临床真菌感染的快速诊断,有一定的临床应用前景。     

PCR与RFLP相结合检测全血中真菌感染的研究

目的 建立从临床可疑真菌感染的全血标本中检测常见真菌基因的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测方法.方法 采用PCR-RFLP检测方法检测临床可疑真菌感染的全血标本.提取DNA,用真菌的通用引物ITS1-ITS4扩增真菌ITS1-5.8SrDNA-ITS2区域,并对扩增产物进行MspI酶切分析鉴定,检测是否有真菌感染,并将真菌定位到种.应用此方法鉴定了100例临床可疑真菌感染全血标本,并与传统血培养方法进行对比.结果 100例疑似标本的真菌培养阳性率为26%,而经PCR扩增阳性率为31%.结论 PCR-RFLP检测全血中真菌基因具有快速、敏感性、特异性,有助于临床真菌感染的快速诊断,有一定的临床应用前景.     

PCR法检测细菌23S rDNA在感染性疾病快速诊断中的应用研究

目的　研究建立快速检测细菌DNA的方法。方法　设计一对共同引物 ,应用聚合酶链反应 (PCR)法 ,扩增细菌核糖体 2 3S亚单位基因 2 3SrDNA。对 2 3种临床常见致病菌、培养物及临床病例标本采用该方法进行检测 ,并与常规细菌培养法比较。结果　该方法可检测细菌下限为 2 5CFU ,与真菌、乙肝病毒等无交叉反应。对纯菌及培养物均可检出一条明显DNA条带 ,革兰阴性细菌约 35 0bp ,革兰阳性细菌约 4 0 0bp。临床标本 2 3SrDNA检出率明显高于常规培养方法 (P <0 0 1)。结论　应用所设计的共同引物 ,检测细菌 2 3SrDNA ,敏感性和特异性好 ,比常规培养法快速、准确。     

多重半套式PCR检测细菌16srRNA基因方法的建立

（1）目的 设计并建立多重半套式聚合酶链反应（PCR）快速检测临床标本中感染病原菌DNA方法。（2）方法 通过对多数病原菌16srRNA基因保守区和变异区序列分析,设计通用引物和革兰阴性菌及革兰阳性菌的特异性引物分别作为外侧和内侧引物,分两步先后加入同一反应体系中对不同细菌的DNA进行扩增。（3）结果金黄色葡萄球菌和大肠无纪律希菌经扩增后均有长度为1032bp的DNA片段产生;金黄色葡萄球菌另有一长度为336bp的特异性产物,大肠埃希菌另有一长度为127bp的特异性产物。（4）结论 该方法可以特异、敏感、快速检测出临床感染的病原菌。     

半巢式聚合酶链反应在浆膜腔细菌感染诊断中的初步应用

目的观察革兰分型半巢式聚合酶链反应(PCR)在浆膜腔细菌感染诊断中的应用价值。方法对30例浆膜腔积液标本,以细菌16SrRNA基因为靶序列,采用一对通用引物和一条革兰阴性菌特异性引物,以半巢式PCR方法进行检测,并同时作细菌培养。结果以通用引物对30例标本作第1次PCR,11例扩增出371bp长度的DNA片段,阳性率为36.7%;对阳性PCR产物再以革兰阴性菌特异性引物作第2次PCR,9例扩增出353bp的DNA片段即为革兰阴性菌。对此30例标本作细菌培养,阳性率为16.7%,低于PCR扩增法。5例标本细菌分离结果与半巢式PCR革兰分型结果相同。结论革兰分型半巢式PCR方法能够灵敏地检测细菌并作出革兰阴性、阳性分型,对于浆膜腔感染的早期诊断具有较好的应用价值。     

DNA探针杂交快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌

目的 建立一种早期快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的分子生物学方法。方法 采用聚合酶链反应(PCR)合成肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异的DNA探针和细菌16SrRNA的通用探针,并用生物素标记DNA探针,分别与细菌、病毒和真菌DNA杂交。并将该方法评价临床样本的检测。结果 聚合酶链反应分别扩增出263、351、370bp三种DNA探针,肺炎链球菌和流感嗜血杆菌只与其对应的探针杂交,细菌通用探针和病毒、真菌间无交叉反应。该法可检测出1ng细菌DNA,100份痰标本利用该方法检测出11份肺炎链球菌和8份流感嗜血杆菌,其阳性率高于痰培养。结论 该方法简便、快速、特异,具有较高的应用价值,可应用于临床检测。     

东方田鼠特异DNA片段的克隆及核苷酸序列分析

根据泰泽氏菌rDNA序列设计出二对特异引物，以标准菌RJ株和大肠杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌纯化的DNA为模板，进行套式PCR反应。结果用外引物扩增，泰泽氏菌和大肠杆菌均出现625bp的反应带，其它细菌无反应带；而用内引物第二次扩增，只有泰泽氏菌出现196bp的特异扩增带，将PCR方法应用于人工免疫抑制的SD大鼠，检出率为30％（9／30）。同时将此30份血清用间接免疫荧光法（IFA）进行检测，结果未检出阳性样品。结果提示，套式PCR方法具有特异性强、敏感性高，简便快速的特点。     

16S-23S rRNA基因区间细菌鉴定实验研究

目的 :探讨 16 S- 2 3S r RNA基因区间对细菌鉴定的应用。方法 :以 16 S- 2 3S r RNA基因区间为靶序列设计引物 ,采用聚合酶链反应检测标准菌株及临床菌株 DNA。结果 :对 2 7株代表 2 7个菌种的标准菌株进行 PCR扩增 ,分别出现不同的 DNA图谱 ,该图谱能直接或经核酸内切酶处理后用于细菌分类 ,敏感性可达 2 .5 CFU/ml的细菌 ,与人外周血白细胞 DNA和真菌及病毒无交叉。 32株临床细菌标本均扩增出与相应标准菌株一致的图谱。结论 :16 S- 2 3S r RNA基因区间 PCR扩增技术检测细菌 ,具有敏感、特异、快速、准确的优点 ,为临床败血症病原的快速诊断提供了新的方法     

PCR快速检测细菌16S rRNA基因的初步研究

目的：建立检测细菌16SrRNA基因的PCR方法。方法:以细菌16S rRNA基因为靶序列。利用计算机软件primer5．0，Bioedit设计2条引物-pml.,pm2并建立相应的PCR方法。采用该PCR方法扩增实验室保留菌株的16srRNA基因,以人类外周血白细胞基因组DNA、HBV—DNA阳性血清以及白色念珠菌为对照。检测该实验方法的特异性;采用倍比稀释的方法进行该实验方法的敏感性实验。结果：用引物pml，pm2对17个不同菌株进行PCR扩增。均得到371bp左右长度的DNA片段。特异性实验表明,此通用引物与人类基因组DNA、真菌及病毒无交叉反应。敏感性实验表明。用pml，pm2引物进行的PCR扩增可检测出20CFU／ml,结论：16S rRNA基因PCR检测方法具有特异、敏感、快速的特点。