实时荧光PCR检测蓝氏贾第鞭毛虫和隐孢子虫方法的建立

目的建立贾第鞭毛虫和隐孢子虫的基因检测方法。方法根据GenBank中贾第鞭毛虫和隐孢子虫相对保守序列,设计引物及其相应的Taqman探针。通过对引物和探针浓度、Taq酶以及反应条件等优化筛选后,建立检测贾第鞭毛虫和隐孢子虫的荧光PCR方法。结果贾第鞭毛虫和隐孢子虫的检测结果为阳性,对其它DNA样本如日本血吸虫、刚地弓形虫、溶组织内阿米巴、旋毛虫和阴道毛滴虫的检测均为阴性。本法的敏感性高,可检测到10～102copies/μl的DNA浓度。结论建立的基因检测方法,对贾第鞭毛虫和隐孢子虫的检测具有高度的特异性和敏感性,可用于饮用水和临床样本等的快速检测。     

国内蓝氏贾第鞭毛虫研究

蓝氏贾第虫鞭毛虫(GiardialambliaStile,1915,亦称G.intestinalis或G.duodenalis,简称贾第虫)是一种机会性致病肠道原虫,一种全球性的引起人和动物腹泻的常见病原体。以往国内对本虫的危害性及其在生物进化上的地位缺乏足够的重视,实验研究起步较晚,在七十年代以前几处于?..     

蓝氏贾第鞭毛虫病治疗的研究进展

蓝氏贾第鞭毛虫病呈全球性分布,在发达国家和发展中国家均有感染,威胁着人类的健康和生命。目前治疗蓝氏贾第鞭毛虫病的药物主要是硝基咪唑类,如甲硝唑,随着长时间的临床应用,耐药虫株不断出现,但是新药的研究周期很长。近年来,如何更好地开发现有药物的新药理作用和研发新药,成为研究蓝氏贾第鞭毛虫病治疗的热点之一。本文就这些药物及其新近研究进展作一综述。     

犬隐孢子虫和隐孢子虫病的研究进展

隐孢子虫病（Cryptosporidiosis）是由隐孢子虫（Cryptosporidium）起的一种重要的人畜共患病。近年来，隐孢子虫病的检出率逐年增高，已被列为世界最常见的6种腹泻病之一。犬隐孢子虫病世界各地均有报道，严重威胁着人类和动物的健康。本文对犬隐孢子虫病的病原分类、虫体形态和寄生部位、流行病学特点、诊断、防治等方面研究状况进行了综述，为犬隐孢子虫病的有效防制提供参考。     

隐孢子虫和隐孢子虫病研究进展

190 7年著名寄生虫学家Ｔｙｚｚｅｒ在作小鼠粘膜组织切片时发现大量虫体 ,并定名为小鼠隐孢子虫 (Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｍｕｒｉｓ) ,1 91 2年Ｔｙｚｚｅｒ在小鼠小肠中查到相似虫体 ,但认为是另一种虫种 (Ｃ .ｐａｒｖｕｍ) ,因为该虫种比Ｃ .ｍｕｒｉｓ小而且内生发育阶段局限于小肠上皮。1 95 5年Ｓｌａｖｉｎ报道Ｃ .ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ感染火鸡小肠出现急性临床症状 ,其特征是严重腹泻 ,但死亡率低 ,首次证明隐孢子虫的强致病性。在腹泻犊牛小肠中检测到隐孢子虫后更进一步引起兽医的兴趣 (Ｐａｎｃｉｅｒａｅｔａｌ.,1…     

人源性蓝氏贾第鞭毛虫Elp3基因的克隆及序列分析

目的克隆蓝氏贾第鞭毛虫Elp3基因,并应用生物信息学方法进行分析。方法根据蓝氏贾第鞭毛虫Elp3已知基因序列的特点设计引物,利用PCR技术扩增获得Elp3的核苷酸序列,连接到pET28a载体并测定序列。应用生物信息学方法分析Elp3基因的序列同源性与结构特征。结果扩增片段长度为1767bp,测序结果与蓝氏贾第鞭毛虫WB株（GL50830）同源性100%。可构建生物进化树,进行同源结构建模发现,71-362aa具有一个保守的S-腺甙基蛋氨酸区域,458-584aa具有组蛋白乙酰基转移酶区域。结论成功克隆了蓝氏贾第鞭毛虫Elp3基因,生物信息学分析发现,其在进化上与其它物种不属同一起源,具有SAM和HAT的结构和功能,这些发现为进一步研究其生物学功能提供了依据和线索。     

蓝氏贾第鞭毛虫PPDK特异性锤头状核酶-GCV重组载体的构建及鉴定

丙酮酸磷酸双激酶（Pyruvatephos phate dikinase,PPDK）可能是蓝氏贾第鞭毛虫能量代谢中具有催化作用的关键酶桩一。为了进一步探讨该酶在贾第虫能量代谢中的作用,本文采用RNA draw软件分析贾第虫编码PPDK的基因序列并设计特异性反义锤头状核酶（Hammerheade ribozyme）,克隆该核酶序列并与犬贾第虫病毒（GCV）连接,构建了载有特异性锤头状核酶的贾第虫病毒重组载体pGCV634/H5/2174。该载体经线性化处理后进行体外转录,转录产物以电击方式转染对数生长期的贾第虫滋养体。提取转染后24h虫体总RNA,并以其为模板进行RT-PCR验证转染效果和对靶mRNA的切割效果。结果初步证实了该载体对虫体细胞内编码PPDK的mRNA具有切割作用。     

用PCR扩增tim基因检测蓝氏贾第鞭毛虫

采用聚合酶链反应(PCR)对蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)的磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase,缩写为tim)基因进行特异性扩增,结果扩增出1条683bp的DNA片段.此方法的特异性可高达100%,而其它DNA样本,如日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、旋毛虫(Trichinella spiralis)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis),以及人体血细胞等均未出现扩增反应.本法的敏感性也很高,可检测到0.4pg贾第虫包囊的DNA.13株来自不同地理位置和/或宿主的贾第虫DNA样本在PCR中均各产生1条长为683bp的目的片段.上述结果表明本实验建立的检测贾第虫的PCR方法有效.     

用PCR扩增tim基因检测蓝氏贾第鞭毛虫

采用聚合酶链反应 (PCR)对蓝氏贾第鞭毛虫 (Giardialamblia)的磷酸丙糖异构酶 (triosephosphateisomerase ,缩写为tim)基因进行特异性扩增 ,结果扩增出 1条 6 83bp的DNA片段。此方法的特异性可高达10 0 % ,而其它DNA样本 ,如日本血吸虫 (Schistosomajaponicum)、刚地弓形虫 (Toxoplasmagondii)、微小隐孢子虫 (Cryptosporidiumparvum)、溶组织内阿米巴 (Entamoebahistolytica)、旋毛虫 (Trichinellaspiralis)和阴道毛滴虫 (Trichomonasvaginalis) ,以及人体血细胞等均未出现扩增反应。本法的敏感性也很高 ,可检测到0 4pg贾第虫包囊的DNA。 13株来自不同地理位置和 或宿主的贾第虫DNA样本在PCR中均各产生 1条长为 6 83bp的目的片段。上述结果表明本实验建立的检测贾第虫的PCR方法有效     

用PCR扩增tim基因检测蓝氏贾第鞭毛虫

采用聚合酶链反应(PCR)对蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)的磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase,缩写为tim)基因进行特异性扩增,结果扩增出1条683bp的DNA片段.此方法的特异性可高达100%,而其它DNA样本,如日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、旋毛虫(Trichinella spiralis)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis),以及人体血细胞等均未出现扩增反应.本法的敏感性也很高,可检测到0.4pg贾第虫包囊的DNA.13株来自不同地理位置和/或宿主的贾第虫DNA样本在PCR中均各产生1条长为683bp的目的片段.上述结果表明本实验建立的检测贾第虫的PCR方法有效.     

蓝氏贾第鞭毛虫中国株组蛋白H2A基因的克隆与重组表达

目的获取蓝氏贾第鞭毛虫中国株GlH2A基因及重组蛋白。方法 PCR扩增获取GlH2A基因,连接至pMD-19T并进行测序分析。连接至pET28a构建表达载体,并转化宿主菌E.coli BL21（DE3）,然后进行异丙基硫代半乳糖苷酶（IPTG）诱导表达。表达产物进行亲和层析纯化,再用Western blotting进行免疫学鉴定。结果序列测定获得蓝氏贾第鞭毛虫中国株GlH2A基因的编码序列,与美国WB株H2A（GL50803_14256,Accession：NW_001844132）序列完全一致。该基因编码124个氨基酸,预测分子量13900Mr,保留了与核小体形成相关的重要氨基酸位点,在大肠埃希菌中获得表达,纯化后纯度达90%以上。Western blotting检测表明重组蛋白能够被抗His6标签抗体识别。结论克隆得到GlH2A基因编码序列;得到了重组GlH2A蛋白,并进行了纯化,为进一步研究组蛋白及其修饰酶在基因转录调控中的作用奠定了基础。     

隐孢子虫病原分类研究进展

隐孢子虫是一种危害严重的人兽共患的传染病原，不但给畜牧业生产造成巨大损失，甚至威胁人类健康，已成为全球寄生虫学和环境科学领域研究的热点之一，具有重要的公共卫生意义。本文就隐孢子虫在分类学上的研究进展作一综述。     

隐孢子虫体外培养研究进展

隐孢子虫是一种重要的人兽共患寄生性原虫,可引起儿童和免疫低下人群以及幼龄动物发生严重胃肠道疾病.长期以来围绕建立隐孢子虫体外培养模型国外学者做了大量探索,国内则在该领域尝试不多.为了研究隐孢子虫详细的内生发育过程,快速筛选抗隐孢子虫的有效药物、研究功能基因表达和外源基因的有效表达等,需要建立有效的体外培养模型.本文就20多年来国内外隐孢子虫培养概况进行了综述.     

瑞士兰氏贾第虫株变异性富含半胱氨酸表面蛋白的研究

从羊、牛和人各自分离出的贾第虫株都具有一个大的膜蛋白。用生物素和放射性碘标记后，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示此膜蛋白分子量的大小，在不同种群之间有着明显的差异。［＾３５Ｓ］半胱氨酸代谢标记及电泳分析表明每个克隆化虫株都有一个主要蛋白，此蛋白的大小与表面标记技术展示的表面蛋白相似。贾第虫株富含半胱氨酸表面蛋白（ＣＲＩＳＰｓ）具有变异能力。虫株在连续体外克隆化培养几代后，在克隆化的群体中自发的出现了一些新的Ｃ     

广州市哨点医院腹泻儿童隐孢子虫感染的分子

目的了解广州某哨点医院门诊腹泻儿童隐孢子虫感染现状和分子流行病学特征。方法收集2012年6月至2013年5月广州市某哨点医院门诊腹泻儿童的人口资料学和粪便标本。采用巢氏聚合酶链反应（NestedPCR）方法检测粪便标本中的隐孢子虫卵囊。结果348份粪便标本中隐孢子虫的检出率为3．45％（12／348）,发病年龄以3岁以内为主（n=10）,检出率在患者的性别、年龄、月份间差异均无统计学意义,时间分布有2个高峰,分别为3—4月和11—12月。检出的12株隐孢子虫经测序分型,8株为C．hominis,4株为C．parvum,其中Ia亚型6株,Ib亚型2株,lIa亚型3株,IId亚型1株。结论广州某哨点医院腹泻儿童存在隐孢子虫感染,高发于春季和冬季,以3岁以内婴幼儿为主,主要流行C．hominis。     

实验感染C57 BL/6N小鼠粪内蓝氏贾第鞭毛虫tim基因检测

建立蓝氏贾第鞭毛虫感染动物模型 ,用PCR技术对感染动物粪内该虫tim基因进行检测 ,探讨蓝氏贾第鞭毛虫基因检测方法。用人源蓝氏贾第鞭毛虫河北株 (CD)和江苏株 (XZ)的包囊分别接种两组C5 7BL 6N小鼠 ,于接种后第 6天、1 0天和 1 4天收集粪便标本 ,采用酚 氯仿法提取总DNA。将提取液分别按 1 0 0 、 1 0 - 1 、 1 0 - 2 和 1 0 - 3稀释并纯化。根据该虫磷酸丙糖异构酶 (Triosephosphateisomerase,tim)基因合成 1对特异性引物 ,采用PCR技术分别扩增各个稀释度的样本。结果贾第虫阳性样本均被扩增出相应基因的 1条 683bp长的片段 ,纯化后的各个稀释度样本的PCR检测阳性率随稀释倍数的增加而增高。本研究结果为贾第虫感染基因检测方法的进一步研究提供了实验资料。     

微小隐孢子虫18SrRNA部分基因克隆和序列分析

分别从长春小白鼠、徐州人和南京黄牛的粪便中分离纯化了 3株微小隐孢子虫 (C .parvum)卵囊 ,根据C .parvum 18SrRNA基因序列设计合成引物 ,用PCR扩增卵囊基因组DNA ,其大小为 5 86bp的片段 ,PCR产物用试剂盒回收纯化后直接测序。将测得的序列用DNASTAR软件分析并与国外已发表的相应序列进行同源性比较 ,并绘制系统发育进化树。结果表明 ,徐州人源株与长春鼠源株及徐州人源株与南京黄牛源株同源性均为 97 6 % ;长春鼠源株与南京黄牛源株相应序列同源性为 99 6 %。此 3株C .parvum与国外株相应序列同源性为 81 4 %～ 10 0 0 %。限制性内切酶酶切位点分析仅发现徐州株有 1个特殊的DdeⅠ位点。本研究为人源及动物源微小隐孢子虫病诊断及人隐孢子虫感染来源和该病分子流行病学研究提供重要依据     

新现人兽共患兔隐孢子虫病的病原学研究进展

兔隐孢子虫是新近发现的人兽共患隐孢子虫种,已引起全球关注.本文对其分类地位、流行病学及分子特征研究等方面进行综述.     

抗微小隐孢子虫Apple结构域单克隆抗体的制备

采用PCR技术从已构建的微小隐孢子虫cDNA文库中扩增含Apple结构域基因,构建pGEX-4T-1-Apple重组质粒,并进行原核表达及纯化,得到分子质量大小约为34kDa的GST—Apple重组蛋白,以其为免疫原,免疫Balb／c小鼠,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,测定其免疫球蛋白亚类及效价,并用蛋白质印迹法（Western—blot）鉴定其特异性。结果共筛选出能稳定分泌抗重组Apple单克隆抗体的2株杂交瘤细胞株,抗体亚类均为IgGl,Western—blot分析显示2株单抗均能与重组蛋白GST—Apple发生特异性结合。为研究Apple结构域在隐孢子虫侵入过程中的功能提供有效工具。